Name: Preparação de horizontais Fatias de rato adulto Retina de Estudos eletrofisiológicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Aprenda a preparar fatias horizontais da retina de rato adulto para estudos eletrofisiológicos. Esta técnica preserva a integridade de neurônios orientados horizontalmente, permitindo investigar circuitos sinápticos retinianos.

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Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 e FE464/11-1 to A.F. Os autores querem agradecer a excelente assistência técnica de Andrea Nerz.

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes para experiências com animais emitidos pela República Federal da Alemanha. Observação: Uma vez que o tecido da retina vai ser desprovido de oxigénio durante partes prolongadas deste processo, todos os passos devem ser realizadas tão depressa quanto possível. Ratos deve ser escuro adaptado pelo menos 3 horas antes da dissecção. Para evitar a adaptação à luz da retina, a preparação e o corte deve ser realizado sob luz vermelha fraca. 1. Preparação da mídia e de outros produtos químicos <ol><li> Prepare Ames &#39;Medium 6. Após a dissecação, imergir tecido da retina em Meio de Ames em todos os momentos. <ol><li> Dissolver 2,2 g de Ames &#39;Médio e 298 mg HEPES em 250 ml de água destilada. A concentração de HEPES irá ser de 5 mm. Mexa delicadamente até que todas as partículas são dissolvidas. </li><li> Médio da bolha Ames à temperatura ambiente com carbogénio (95% de oxigénio, 5% carrodióxido de bon) durante pelo menos 5 min. carbogénio de alimentação com uma pipeta de Pasteur de vidro para a solução. Ligue o pipeta Pasteur através de uma tubagem adequada para a saída do regulador de gás. </li><li> Adicionar 475 mg de sódio-bicarbonato de sódio à solução. A adição de bicarbonato após borbulhamento evita a precipitação de carbonato de cálcio. </li></ol></li><li> Prepare baixo agarose temperatura de gelificação. A agarose é necessária para a incorporação do tecido da retina durante o corte vibratome. <ol><li> Dissolve-se 180 mg de agarose em 9 ml de Meio de Ames e 1 ml de água destilada. Usar um forno de microondas para aquecer lentamente a solução de agarose até todos os sólidos estarem dissolvidos. Calor em 5 - 10 incrementos seg para evitar transbordamento. Solução deve ser límpida e transparente. </li><li> Loja dissolver a agarose em banho de água a 37 ° C durante a duração do processo. </li></ol></li></ol> 2. Configurando o Vibratome NOTA: Todos corte foi realizado com ovibratome listados na Tabela Materiais. As definições dadas referem-se a este tipo de apenas vibratome. Para mais detalhes sobre vibratome seccionamento do tecido neural consulte Referência 7. <ol><li> Coloque vibratome lâmina injector no suporte da lâmina. </li><li> Medir a deflexão vertical da lâmina com o dispositivo &quot;VibroCheck&quot;. Usar o parafuso de ajustamento no suporte da lâmina para inclinar a lâmina até que é paralelo ao plano de corte. O posicionamento exacto da lâmina é necessário para prevenir os efeitos do estore veneziano sobre a superfície da secção e para produzir uma secção plana que contém as células vivas sobre a sua superfície. </li><li> Definir vibratome com as seguintes configurações: amplitude, 1,00; velocidade, 0.20; espessura, 180-200 uM. </li></ol> 3. Dissecção do mouse Retina <ol><li> Anestesie adultos C57BL / 6 de rato por vaporização de cerca de 1 ml de isoflurano num recipiente estanque ao ar. Quando a anestesia é completa, a eutanásia dos animais por deslocação cervical. orato não devem ter mais de 3 meses, de outro modo a qualidade das fatias irá deteriorar-se. </li><li> Remover olho bola, colocando uma pinça curva sob o olho. Gentilmente levantando a bola do olho irá expor o nervo óptico. Cortar o nervo óptico com uma tesoura primavera e transferir a bola de olho para uma placa de Petri de 35 mm contendo 2 ml de Ames Médio. </li><li> Realizar todas as etapas subseqüentes no palco de um microscópio estéreo. Ajustar a ampliação para um valor que permite o controlo visual optimizada dos seguintes procedimentos (as etapas de 3,4-3,9). </li><li> Perfurar a córnea na transição para a esclera com uma pinça de pontas ou de uma agulha 20 G. Durante esta etapa, equilibrar a bola de olho com outro fórceps. Tenha cuidado para não danificar a retina com o dispositivo de perfuração. </li><li> Insira a tesoura primavera no pequeno orifício feito na etapa 3.3 e cortar um círculo ao redor da córnea. Mais uma vez, segurar a bola do olho com uma pinça durante o corte. Manter a incisão muito perto da superfície de modo a não cut na retina. </li><li> Remova cuidadosamente córnea, cristalino e corpo vítreo com uma pinça. O corpo vítreo é composto apenas por uma camada fina e transparente na parte de trás do olho. No entanto, é essencial para vibratome seccionamento que o corpo vítreo é totalmente removido. </li><li> Na placa de Petri, posicionar a ocular de uma forma que se olha através do furo para baixo, sobre a retina. O aro da abertura deve ser composto de apenas tecido escleral. Se o corte circular (passo 3.4) foi levada a cabo demasiado perto do equador da ocular, tecido da retina, também estará presente próximo da incisão. Tenha cuidado, em seguida, para não danificar a retina no passo 3.8. </li><li> Agarrar a esclera com uma pinça e arrancar com cuidado o tecido distante. É essencial para não romper a retina durante este passo. Se necessário, descolar a retina do ora serrata por equilibrando a parte escleral do tecido com a pinça e cuidadosamente descascar a retina com os outros fórceps. Mantenha a pinça fechada; nunca manuseie a retina com uma pinça desde o tecido é muito macio e dará lugar imediatamente. NOTA: Nesta etapa, a retina e o resto da ocular será ligado apenas na cabeça do nervo óptico. </li><li> Corte o local de ligação na cabeça do nervo óptico com a tesoura primavera. A retina deve agora ser flutuando livremente como uma só peça de tecido em Meio de Ames. </li><li> Cortar a retina em 4 - 6 pequenos retângulos de aproximadamente 23 mm, utilizando uma lâmina de bisturi curvado, segurando a retina ao longo das bordas com a pinça, para manipulá-lo na posição. Evite trilhar o tecido da retina dentro dos retângulos. Aqui peças das partes central da retina, e não a periferia longe. </li><li> Transferir peças da retina com um grande diâmetro de Pasteur de plástico pipeta para uma placa de petri de plástico de 35 mm, o fundo do qual tem sido substituído por uma malha com tamanho da grade inferior a 1 mm. Fixar a placa de Petri dentro do terço superior de uma garrafa ou recipiente cónico e submergir peças da retina de BU Médio Amesbbled com carbogênio. </li></ol> 4. Incorporação de Retinal Pieces em Agarose <ol><li> transferir cuidadosamente 2 - 3 partes da retina em cerca de 35 mm plástico de Petri em conjunto com alguns dos Ames Médio. É mais conveniente usar um grande diâmetro de Pasteur de plástico pipeta de transferência. Neste passo, a orientação exacta das peças da retina não importa. </li><li> Remover o máximo possível de Meio de Ames remanescente &#39;com uma pipeta de Pasteur de vidro. Assim que o líquido foi removido prosseguir com o passo 4.3. Não deixe que a seca tecido da retina. </li><li> Imediatamente cobrir peças da retina com 2 ml de dissolver a agarose (37 ° C). Dado o tamanho mencionado na etapa 3.10, as peças não irá enrolar-se dentro do agarose. </li><li> Dentro do líquido de agarose, suavemente empurrar partes da retina ao fundo do prato de petri. A camada de células ganglionares deve estar voltada para baixo. Use um microscópio estéreo para julgamento da posição exata. Para o posicionamento, lidar com pi da retinaECES com uma pequena espátula. Posicionar a retina o mais rápido e preciso possível uma vez que a agarose irá solidificar rapidamente. <ol><li> Providenciar partes da retina paralela ao fundo do prato de vidro; caso contrário, as seções serão tangencial ou oblíqua. peças individuais não devem tocar uns aos outros, mas também não deve ser muito longe. Tentar colocar as peças da retina mais ou menos no mesmo nível horizontal. </li></ol></li><li> Coloque placa de petri de vidro com peças da retina encaixada no refrigerador (4-6 ° C) durante pelo menos 2 min. Isto irá rapidamente endurecer a agarose para processamento posterior. Assim que a agarose foi polimerizado prosseguir com o próximo passo. </li></ol> 5. Montagem da retina Pieces <ol><li> Remova cuidadosamente o bloco de agarose contendo pedaços de retina da placa de Petri. Usar uma espátula ou um dispositivo semelhante ao levantar o bloco de agarose a partir do vidro. Devido às forças adesivas, isso pode vir a ser bastante difícil. No entanto, evitar a quebra dobloco de agarose. Realizar este e todos os passos subsequentes à temperatura ambiente. </li><li> Coloque o bloco de agarose em uma lamela de vidro e ajustar seu tamanho, com uma lâmina de bisturi. Deixar 1 - 2 mm de agarose em cada lado das peças da retina. O tamanho final do bloco deve ser de cerca de 1,066 milímetro (10 mm refere-se à altura do bloco, 6 mm ao seu comprimento de bordo). </li><li> Cole o bloco de agarose para o suporte de amostras do vibratome usando um adesivo instantâneo. peças da retina devem ser localizado na parte superior do bloco de alta 10 mm, e orientado paralelamente à sua superfície, enquanto a parte inferior é afixada ao suporte. </li><li> Cubra o bloco imediatamente por vazamento médio do Ames anteriormente borbulhar &quot;na bandeja de tampão do vibratome. </li></ol> 6. Preparação Horizontal vibratome Secções <ol><li> Comece o corte. No primeiro, definir a espessura de cortar manualmente até fragmentos de tecido da retina aparecer na fatia. Em seguida, altere as configurações no passo 2.3. Desde oretina do rato é apenas cerca de 200 um de espessura, não haverá mais do que 2-3 fatias por bloco de agarose. </li><li> Remover seções da bandeja de tampão com uma vareta de vidro e transferi-los para 2 ml de Meio Ames &#39;em uma placa de Petri de 35 mm. </li><li> Secções de armazenamento imediatamente em uma incubadora a 37 ° C (5% CO2 / 55% de O 2). A agarose em torno das secções permanecerão sólido na incubadora e pode ser usado para manipular as secções sem danificar a retina. Melhor qualidade fatia é obtida quando o armazenamento a 37 ° C no interior da respectiva atmosfera comparação com Médio Ames oxigenado &#39;à TA. As secções podem ser utilizadas imediatamente ou podem ser armazenadas até quatro horas na incubadora com bons resultados fisiológicos. </li><li> Incorporar próximos pedaços de retina em agarose e repetir Secções 4 - 6. </li></ol>

<ol><li>DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+in+two+transmitter+microenvironments+at+the+cone+photoreceptor+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse.</a> Neuron. 50, 735-748 (2006).</li>
<li>Jackman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+synaptic+ribbon+in+transmitting+the+cone+light+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response.</a> Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Em contraste com fatias verticais, a morfologia dendrítica de neurónios e radialmente orientadas, como as células horizontais e células amácrinas é bem preservada. Em comparação com as preparações de retina inteiros, estes tipos de células são facilmente acessíveis para microeléctrodos e pode ser estudado por ambos os métodos electrofisiológicos e de imagem. Aqui, nós nos concentramos na retina externa; No entanto, uma abordagem semelhante tem sido reportado especialmente para células amácrinas da retina interna <sup cl...

A informação visual é codificado como um padrão espaço-temporal dinâmica de ativação de fotorreceptores, e da sinapse fita entre fotorreceptores e neurônios de segunda ordem determina a transferência a jusante da informação visual. A preparação fatia vertical da retina de mamífero é uma ferramenta muito valiosa para estudar o processamento de sinais em vias verticais, ou seja, entre os fotorreceptores e as células bipolares, e entre células bipolares e alguns tipos de célula amacrine 1, 2, 3, 4. No entanto, de corte vertical, sempre causa grave truncagem dos campos dendríticas de muitos neurônios da retina, levando à perda considerável de contatos sinápticos. Especialmente na retina externa, células horizontais são afetados devido aos seus campos dendríticas estendidos lateralmente, distribuídos e sistemas de terminais axônio 5. Numa verticaispreparação fatia, a entrada sináptica de centenas de terminais cone fotorreceptoras para os dendritos de uma célula horizontal é, assim, reduzida a alguns contactos esparsas. Isto pode ser suficiente para estudar as propriedades de sinapses individuais, mas não representam de nenhum modo as capacidades de processamento de sinal sincronizado subjacentes a activação das sinapses fita de fotorreceptores. Assim, desenvolvemos uma preparação fatia horizontal, o que deixa a quase totalidade do fotorreceptores cone de entrada sináptica para dendrites horizontais intacta e funcional. O plano de seccionamento corre paralelo à superfície da retina, idealmente o corte através da camada nuclear interna entre as células horizontais e células amácrinas. Deste modo, as fatias horizontais da retina externa são criadas, contendo, no sítio pré-sináptica, os fotorreceptores com segmentos interiores e exteriores, bem como terminais sinápticos, e células horizontais e células bipolares no local pós-sináptica. Esta preparação é bem adequado to investigar entradas sinápticas coordenadas em dendritos das células horizontais por todos os cones fotorreceptores dentro de seu campo dendrítica. Assim, pode ser útil para compreender melhor o funcionamento da sinapse fita de fotorreceptores, que é crucial para a transferência de informação visual a partir da matriz de ativação de fotorreceptores em uma resposta pós-sináptica.

<table><tbody><tr><td>Ames' Medium</td><td>Sigma</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Air Liquide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9045</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 35 mm (plástico)</td><td>Nunc Thermofisher</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>Vidro Petri prato</td><td>Quimiolina</td><td>50-1470-40</td><td></td></tr><tr><td>Dispensário de isoflurano</td><td>hospital</td><td></td><td></td>universitário</tr><tr><td>Lâmina injetora de vibratomo</td><td>Biosystems</td><td>39053250</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200</td><td></td></tr><tr><td>Vibrocheck</td><td>Leica Microsystems Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microondas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinças</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>agulhas</td><td></td><td></td><td></td>de 20 G</tr><tr><td>Tesoura de mola</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas</td><td></td><td></td><td></td>de bisturi curvas</tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td></td><td></td>estéreo</tr><tr><td>Pipeta</td><td></td><td></td><td></td>de plástico</tr><tr><td>Pasteur Pipeta</td><td></td><td></td> <td>de vidro Pasteur</td></tr></tbody></table>

preparação de horizontais fatias de rato adulto retina de estudos eletrofisiológicos

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

preparações fatia vertical são bem estabelecido para o estudo e circuitos de transmissão de sinal na retina de mamífero adulto. O plano de corte nestas preparações é perpendicular à superfície da retina, tornando-o ideal para o estudo dos neurónios e radialmente orientadas, como os fotorreceptores e as células bipolares. No entanto, as grandes células de mandris dendríticas, células horizontais amácrinas de campo amplo, e as células ganglionares são na maior parte truncada, deixando marcadamente reduzida actividade sináptica nestas células. Considerando que as células ganglionares e células amácrinas deslocadas pode ser estudada em toda uma preparação-montada da retina, células horizontais e células amácrinas localizados na camada nuclear interna são pouco acessível para eléctrodos no tecido da retina inteira. Para alcançar o máximo de acessibilidade e integridade sináptica, desenvolvemos uma preparação fatia horizontal da retina do rato, e estudou a transmissão do sinal na sinapse entre fotorreceptores e horizontalcélulas. corte horizontal permite (1) identificação visual fácil e não ambígua de corpos celulares horizontais para segmentação eletrodo, e (2) a preservação dos campos dendríticas de células horizontal estendidos, como um pré-requisito para cone de entrada sináptica intacta e funcional para os dendritos das células horizontais. células horizontais de fatias horizontais exibiram atividade sináptica tónico no escuro, e eles responderam a breves flashes de luz com uma redução da atividade sináptica atual e diminuída para dentro. evidência imunocitoquímica indica que quase todos os cones dentro do campo dendrítica de uma célula horizontal estabelecer sinapses com os dendritos periféricos. A preparação fatia horizontal é, portanto, bem adequado para estudar as propriedades fisiológicas dos neurônios da retina estendida horizontalmente, bem como transmissão de sinais sensoriais e de integração através das sinapses selecionados.

<html> Em fatias horizontais da retina de rato, corpos celulares horizontais podem ser facilmente identificados de acordo com a sua morfologia original com vários dendritos primários emergentes a partir de um corpo celular poligonal (Figura 1A). corpos celulares horizontal localizada perto da superfície da fatia foram rotineiramente acessível para eléctrodos de patch-clamp. Durante gravações, as células foram preenchidos com um corante fluorescente, revelando a sua arbori...

Nós desenvolvemos uma preparação fatia horizontal da retina de mamífero adulto com o plano de corte paralelo à superfície da retina. campos dendríticos de neurônios da retina orientados nonradially não foram truncados, permitindo o estudo do processamento de sinal com técnicas de patch-clamp e de imagem.

Preparação de horizontais Fatias de rato adulto Retina de Estudos eletrofisiológicos

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

O objetivo geral deste preparo de corte horizontal da retina de camundongo é preservar a integridade morfológica e fisiológica dos neurônios orientados horizontalmente, a fim de estudar seu papel funcional em circuitos sinápticos da retina. Este método pode auxiliar na resposta a questões fundamentais no campo do processamento da informação visual, como a forma pela qual sinais sensoriais são codificados e integrados nas sinapses em fita da retina repetitiva. A principal vantagem desta técnica é que interneurônios orientados horizontalmente, como células horizontais e células amácrinas, permanecem funcionalmente íntegros e acessíveis a gravações eletrônicas.Andrea Nerz, uma técnica do meu laboratório, demonstrará o procedimento. Para iniciar este procedimento, remova o globo ocular posicionando um par de pinças curvas sob o olho. Levante suavemente o globo ocular para expor o nervo óptico e corte-o com uma tesoura de mola.Em seguida, transfira o globo ocular para uma placa de Petri de 35 milímetros contendo dois mililitros de meio AMS. Sob o microscópio estereoscópico, ajuste a ampliação para um valor que permita controle visual ideal. A seguir, segure firmemente o globo ocular com um par de pinças e perfure a córnea na transição com a esclera usando outra pinça pontiaguda ou uma agulha de calibre 20.Tenha cuidado para não danificar a retina ao perfurar a córnea. Em seguida, insira a tesoura de mola no pequeno orifício. Segure o globo ocular com pinça enquanto corta um círculo ao redor da córnea e mantenha o corte bem próximo à superfície para não atingir a retina.Remova cuidadosamente a lente da córnea e o corpo vítreo. O corpo vítreo compreende apenas uma fina camada transparente na parte posterior do olho. No entanto, é essencial que o corpo vítreo seja completamente removido para o corte com vibrátomo.Na posição do tubo de Petri, posicione a cúpula ocular para mostrar um orifício claro até a retina. A borda da abertura deve consistir apenas de tecido escleral. Em seguida, segure a esclera com pinça e cuidadosamente rasgue o tecido.É fundamental não romper a retina durante esta etapa. Neste momento, a retina e o restante da cúpula ocular devem estar conectados apenas no disco óptico. Corte o ponto de ligação no disco óptico com uma tesoura de mola.A retina agora deve estar flutuando livremente como uma única peça de tecido no meio AMS. Em seguida, transfira a retina para uma lamínula com uma pipeta Pasteur de diâmetro grande e corte-a em quatro a seis retângulos pequenos de aproximadamente dois por três milímetros quadrados usando uma lâmina de bisturi curva. Evite prender o tecido retiniano dentro dos retângulos.Neste procedimento, transfira cuidadosamente dois a três fragmentos da retina para uma placa de Petri de vidro junto com um pouco do meio AMS, utilizando uma pipeta Pasteur plástica de grande diâmetro. Remova o máximo possível do meio AMS remanescente com uma pipeta Pasteur de vidro. Em seguida, cubra imediatamente os fragmentos da retina com dois mililitros de agarose dissolvida a 37 graus Celsius.Empurre suavemente os pedaços de retina até o fundo da placa de Petri. Posicione a camada de células ganglionares voltada para baixo o mais rápido e preciso possível, já que a agarose solidifica rapidamente. Ao mesmo tempo, organize os pedaços de retina paralelamente ao fundo da placa de vidro para evitar que os cortes fiquem tangenciais ou oblíquos.Depois disso, transfira os fragmentos de retina embutidos para a geladeira para endurecer a agarose antes do processamento adicional. Agora, desprenda cuidadosamente o bloco de agarose contendo os fragmentos de retina da placa de Petri. Use uma lâmina de bisturi para levantar o bloco de agarose do vidro com cuidado.Em seguida, coloque o bloco de agarose sobre uma lamínula de vidro. Ajuste seu tamanho com uma lâmina de bisturi, deixando um a dois milímetros de agarose em cada lado dos fragmentos retinianos. Em seguida, cole o bloco de agarose ao suporte do espécime do vibrátomo utilizando um adesivo instantâneo.Cubra o bloco imediatamente despejando o meio AMS previamente borbulhado na bandeja tampão do vibrátomo. Nesta figura, uma célula horizontal localizada próximo à superfície da fatia foi visualizada com óptica de contraste de pontos. Esta imagem mostra uma célula horizontal preenchida com Oregon Green 488 BAPTA-1 por meio de um eletrodo de patch que ainda estava ligado à célula.É mostrada aqui a sobreposição de uma célula horizontal injetada com corante e uma matriz de pedículos cônicos marcados com fluoresceína conjugada à aglutinina de amendoim, o que revela os contatos sinápticos putativos. Nesta figura, a gravação em regime de clamp de voltagem em célula inteira, com um potencial de retenção de menos 60 milivolts, mostra atividade sináptica tônica de alta frequência. Em maior resolução temporal, os eventos sinápticos exibem formas de onda monofásicas ou trajetórias de corrente mais complexas.Nesta figura, é mostrada a resposta de corrente de uma célula horizontal a um estímulo luminoso. A luz induz o fechamento de canais iônicos e o bloqueio da atividade sináptica. E nesta figura, os fotorreceptores cônicos foram estimulados eletricamente com um eletrodo extracelular.As correntes excitatórias pós-sinápticas variam conforme a intensidade da estimulação. Uma vez dominado, este procedimento pode ser realizado em menos de uma hora, se for executado corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como a imagem de cálcio, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como o processamento de informações visuais nas redes retinianas.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como cortar fatias horizontais da retina de mamíferos com entradas sinápticas funcionais para tipos celulares estendidos horizontalmente.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Tradicionalmente a fatia vertical e toda a preparação para montagem da retina têm sido usados ​​para estudar a função dos circuitos da retina. Aqui, descrevemos a novela corte método para preservar a morfologia dendrítica de neurônios da retina intacta.

Preparação Slice horizontal da Retina

Aqui nós descrevemos um procedimento para a geração de adaptação ao escuro fatias da retina do rato para gravações eletrofisiológicas.

Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Este vídeo demonstra uma técnica de patch-clamp de célula inteira para registro eletrofisiológico de uma retina de camundongo de montagem plana. Uma pipeta de vidro fina com um eletrodo é usada para abordar as células amácrinas starburst (SACs) dentro da retina. Depois de formar uma vedação, a sucção é aplicada para romper a membrana e formar a configuração de patch clamp de célula inteira. Finalmente, o fluxo de íons através dos receptores sinápticos SAC é medido usando a configuração.

Estabelecendo um grampo de remendo de célula inteira para registro eletrofisiológico de uma retina de camundongo de montagem plana

O vídeo descreve o registro eletrofisiológico de sinapses retinogeniculadas e corticogeniculadas em fatias de cérebro de camundongos. Os cortes contendo o núcleo geniculado lateral dorsal (dLGN) são colocados em uma câmara de registro. Uma pipeta estimulante é posicionada no trato óptico para estimular as células ganglionares da retina (RGCs) e investigar sinapses retinogeniculadas ou no núcleo reticular tálamo para estimular neurônios corticais e investigar sinapses corticogeniculadas. Após a...

Um estudo eletrofisiológico de sinapses retinogeniculadas e corticogeniculadas em fatias de cérebro de camundongo

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/55229/ single-cell-rna-seq-of-defined-subsets-of-retinal-ganglion-cells'&gt;Laboissonniere, et. al. RNA-seq de célula única de subconjuntos definidos de células ganglionares da retina. J. Vis. exp. (2017). Este vídeo demonstra uma técnica de rastreamento fluorescente para identificar subtipos de células ganglionares da retina (RGC) em uma retina de camundongo transgênico. O processo envolve proteger a retina isolada em uma...

Identificação de subtipos de células ganglionares da retina de camundongos por meio de rastreamento fluorescente

Demonstraremos como preparar fatias de retina do olho do camundongo e registrar as respostas à luz nos neurônios da retina. Todo o procedimento é realizado em condições adaptadas ao escuro.

Gravação Light-provocou respostas pós-sinápticos nos neurônios em Dark-adaptados, Preparações da retina do rato fatia usando técnicas Grampo patch

Nós descrevemos um protocolo para acompanhar a dinâmica de Ca2 + nos terminais do axônio de cones fotorreceptores, utilizando uma preparação fatia ex-vivo da retina mouse. Este protocolo permite que os estudos exaustivos sobre cone Ca 2+ sinalização em um importante sistema de modelo de mamífero, o rato.

Imagem Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics nos terminais Cone fotorreceptores Axon do mouse Retina

Uma vez removido do corpo, tecido neuronal é muito afectado pelas condições ambientais, conduz a uma eventual degradação do tecido após 6-8 h. Usando um método de incubação único, que acompanha de perto e regula o ambiente extracelular do tecido, a viabilidade do tecido pode ser significativamente prolongada por&gt; 24 h.

A incubação prolongada de aguda Neuronal Tissue de Eletrofisiologia e cálcio-imaging

Este artigo tem como objetivo descrever um protocolo sistemático para obter fatias cerebrais hipocampais horizontais em camundongos. O objetivo desta metodologia é preservar a integridade das vias de fibra hipocampal, como o caminho perfurante e o trato de fibra de musgo para avaliar processos neurológicos relacionados ao giro dento.

Fatias hipocampais horizontais do cérebro do rato

Apresentamos um protocolo para preparar fatias agudas do hipocampo dorsal-intermediário de camundongos. Comparamos esta preparação transversal com o corte coronal em termos de qualidade de gravações e preservação de características morfológicas de neurônios registrados.

Preparação de fatias agudas do hipocampo dorsal para gravação de células inteiras e reconstrução neuronal no giro dentado de camundongos adultos

Este trabalho apresenta uma preparação alternativa de retina flatmount na qual a remoção de corpos celulares fotorreceptores permite uma difusão mais rápida de anticorpos e um melhor acesso da pipeta de remendo aos neurônios internos da retina para experimentos de imunohistoquímica, hibridização in situ e eletrofisiologia.

Split Retina como uma Preparação Flatmount Melhorada para o Estudo de Neurônios da Camada Nuclear Interna na Retina de Vertebrados

Aprenda a preparar fatias horizontais da retina de rato adulto para estudos eletrofisiológicos. Esta técnica preserva a integridade de neurônios orientados horizontalmente, permitindo investigar circuitos sinápticos retinianos.

Preparação de horizontais Fatias de rato adulto Retina de Estudos eletrofisiológicos

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