Imagens de células vivas e Análise 3D da angiotensina Receptor Tipo Tráfico 1a em células do rim Transfectados embrionárias humanas usando microscopia confocal

O objetivo geral deste experimento é obter evidências quantitativas espaciais e temporais da colocalização do receptor de angiotensina tipo um com lisossomos após o tratamento com angiotensina dois. Este método foi desenvolvido para detectar diferenças no processamento subcelular de receptores do tipo Y em comparação com receptores mutantes, como durante o processo de internalização, que ocorre em resposta à estimulação pelo ligante. As vantagens desta técnica são a imagem em tempo real de células vivas, que elimina artefatos provenientes de células fixadas e permeabilizadas com detergentes, e a possibilidade de avaliar alterações dinâmicas na localização do receptor em tempo real.

Inicie selecionando uma objetiva apropriada com abertura numérica de 1,4 e centralize a objetiva sobre a platina do microscópio. Adicione uma gota de óleo de imersão com alta viscosidade e baixa autofluorescência sobre a objetiva e transfira a câmara com as células transfectadas para a platina do microscópio. Levante suavemente a objetiva até que o óleo toque levemente a parte inferior da primeira lâmina e localize as células fracas.

Com uma célula sadia de interesse no centro do campo de visão, mude para o modo confocal e confirme que a célula está bem espalhada, com seu lado ventral justaposto firmemente ao lamínula. Abra a caixa de diálogo Z Stack, clique em Live, foque no topo da célula e, em seguida, clique em Begin. Depois, foque na base da célula, insira o tamanho do passo Z de 1,00 micrômetro e clique em End.

Em seguida, selecione o Modo XYZT nas configurações de aquisição na parte superior. Por fim, defina o intervalo de tempo para a varredura e a duração da aquisição para observar o direcionamento do Receptor de Angiotensina Tipo 1A marcado com GFP para os lisossomos. Para iniciar a estimulação com ligante, adicione três microlitros de uma solução estoque 100 X do ligante ao poço que está sendo imagiado e clique em Iniciar para registrar a resposta em 3D pelo período e frequência desejados.

Para analisar as imagens de células vivas, abra o software apropriado de quantificação de imagens tridimensionais. Neste protocolo, o Velocity. Clique com o botão direito dentro do campo da imagem e selecione Propriedades.

Insira as propriedades apropriadas de pixels de imagem XY e Z para criar uma sequência de medição destinada a analisar as vesículas do receptor marcadas com GFP e as intensidades da célula inteira em resposta ao tratamento com ligante. No menu 2D, selecione o modo de foco estendido para observar a célula. Em seguida, utilize a ferramenta de região livre para desenhar uma região de interesse ao redor da célula e clique com o botão direito na imagem para selecionar Recortar para Seleção.

Um novo item de imagem será gerado. Clique no nome da imagem para selecionar a imagem da célula recortada e abrir a guia de medição. Para medir a expressão de GFP nas vesículas internalizadas, arraste Encontrar Objetos do menu Localização para a caixa de sequência acima.

Defina o canal de detecção de objetos como GFP e abra o ícone de configurações para definir o limiar usando o desvio padrão e o limite inferior como seis, a fim de selecionar objetos com as intensidades de GFP mais brilhantes. Defina o tamanho mínimo do objeto como zero micrômetros cúbicos. Em seguida, clique em medir e selecione os canais e os tipos de medições.

Para definir a limiarização e os filtros para identificar a célula inteira e medir a intensidade total de GFP, arraste uma segunda caixa Encontrar Objetos. Em seguida, defina o canal Encontrar Objetos para GFP e ajuste o desvio padrão para zero, a fim de selecionar objetos com qualquer intensidade de GFP e tamanho mínimo de objeto igual a dois micrômetros cúbicos. Arraste Filtrar População até a caixa População dois Encontrar Objetos e selecione um volume em micrômetros cúbicos maior que 100 para selecionar a célula inteira e eliminar todos os objetos menores.

Em seguida, selecione medições e o item Fazer Medição para realizar a medição em todos os pontos de tempo. Para analisar a expressão de GFP medida nas vesículas e na célula inteira ao longo do tempo, clique no nome do arquivo do item de medição abaixo do nome da imagem. Para extrair os dados de GFP e vesículas a partir dos dados totais, abra a guia bruta e selecione a população um.

Em seguida, abra a guia analisada e, clicando com o botão direito nos dados, selecione análise, seguido por restringir a análise à população um. Para medir a quantidade de GFP em toda a célula, altere ambas para a população dois. Em Analisar Esses Dados e Resumido Por, selecione o canal de cor GFP total e soma.

Em seguida, em Organizar os dados por, e na linha, selecione ponto de tempo. Para extrair os dados sobre a quantidade de GFP nos lisossomos, em Encontrar objetos para a população um, defina o canal de detecção de objetos como o canal vermelho. No ícone de roda dentro da caixa de diálogo, defina o limiar usando o desvio padrão, o limite inferior como seis, para selecionar objetos vermelhos com as intensidades mais brilhantes, e o tamanho mínimo do objeto como 0,017 micrômetros cúbicos.

Selecione as medições e crie um item de medição para realizar a medição em todos os pontos de tempo. Para analisar a expressão de GFP medida nos lisossomos, clique no nome do arquivo do item de medição abaixo do nome da imagem. Selecione a população um na guia "raw" e, em seguida, selecione a população um e o canal de cor GFP (soma) e soma na guia "analyze", clicando com o botão direito do mouse como antes para medir a quantidade de GFP nas vesículas vermelhas.

Antes da estimulação pelo ligante, os receptores de angiotensina tipo 1A marcados com GFP estão localizados predominantemente na membrana plasmática. No entanto, dentro de 2,5 minutos após a adição da angiotensina II, esses receptores tornam-se internalizados, formando vesículas brilhantes e, posteriormente, aglomerados e grandes vesículas paranucleares. O enrugamento induzido pela angiotensina II complica a quantificação da intensidade total de GFP nas vesículas, conforme observado nesses dados representativos de medição da expressão de GFP.

A filtragem por tamanho não discrimina entre as pregas maiores e as vesículas agrupadas, mas revela que a GFP em objetos menores aumenta antes do que a GFP em objetos maiores. Neste curso temporal representativo da expressão de GFP sem foco automático, a GFP internalizada foi medida como a porcentagem do total de GFP celular. A análise da GFP total dentro da célula revelou que esta célula não sofreu fotobranqueamento significativo ao longo do tempo.

A quantificação da GFP nos lisossomos de células transfectadas também indica que a intensidade do Receptor do Tipo 1A da Angiotensina presente nos lisossomos não varia por até 24 minutos após a administração da Angiotensina II. Durante este procedimento, é importante lembrar-se de monitorar a saúde das células antes e durante a aquisição de imagens, já que o procedimento é demorado; o experimento deve ser abortado se os cultivos celulares apresentarem qualquer anormalidade. Após este procedimento, imunomarcação e FRET ou FLIM podem ser utilizados para detectar e confirmar a localização subcelular dos receptores.

Blots ocidentais podem ser realizados para investigar a identidade e as alterações em moléculas de sinalização envolvidas durante o tráfego do receptor. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar imagens e análises em tempo real em células vivas para medir o direcionamento do receptor transmembranar induzido pelo ligante para lisossomos, bem como para outros compartimentos subcelulares.