Name: Imagens de células vivas e Análise 3D da angiotensina Receptor Tipo Tráfico 1a em células do rim Transfectados embrionárias humanas usando microscopia confocal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprenda a realizar imagens de células vivas e análise 3D do tráfico do receptor de angiotensina tipo 1a em células renais embrionárias humanas usando microscopia confocal. Este método permite quantificar a co-localização receptor-lisossomo em tempo real.

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O trabalho de pesquisa apresentado neste manuscrito foi apoiado pela concessão R01 HL121456-01A1 para Kathryn Sandberg. Este trabalho foi apoiado além da disponibilidade de uma Leica SP8 AOBS na Microscopia e recursos partilhada Imagem (MISR) a Georgetown University Medical Center, que é parcialmente financiado pelo P30-CA051008 dos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos da América. Agradecemos Leica assistência imagem SP8 por Peter Johnson, eo uso da Zeiss LSM880 no laboratório de Thomas Coate, do Departamento de Biologia da Universidade de Georgetown com a ajuda de imagens fornecido pela Alma Arnold da Carl Zeiss Microscopia LLC. O conteúdo deste manuscrito é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

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<li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nat Commun. 6, 7670(2015).</li>
<li>Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconversion+of+Lysotracker+Red+to+a+green+fluorescent+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule.</a> Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Experimentos preliminares aqui apresentados mostram que ao longo de um curso de tempo bastante curto de 24 min, nenhuma mudança significativa na prestação de AT 1a R-GFP para os lisossomos ocorreu. Em geral, a entrega de receptores internalizados para os lisossomas pode ocorrer tão cedo quanto 15-20 min. Esta experiência é consistente com a hipótese de que a maior parte da AT internalizado 1a R é voltado para grandes perinucleares, endossomas. A prova de que, pelo menos, alguns em 1a R c...

O objectivo global é obter evidência quantitativa em tempo e espaço de co-localização do receptor com organelas subcelulares específicos após o tratamento com um agonista do receptor. Assim, o objectivo imediato aqui é capturar lapso de tempo imagens confocais de lisossomas e um transmembranar abrangendo receptor em células de rim embrionário humano (HEK) a seguir à transfecção e de montar posteriormente e analisar os dados de imagem em 3D para medir quantitativamente a entrega do receptor de lisossomos. Investigando o tráfico simultânea de um receptor transmembranar com lisossomos ou outras organelas durante a endocitose quando ativado por ligando de receptor pode ajudar a determinar a forma como o receptor de membrana é regulada sob condições fisiológicas e fisiopatológicas. EM 1a R é presumido ser degradado nos lisossomas, após tratamento com Ang II em sistemas celulares modelo, principalmente HEK293 1, embora a maioria dos receptors estão localizados principalmente em endossomas de reciclagem multivesiculares para posterior reciclagem para a membrana plasmática, enquanto a maior parte do ligando, a Ang II, é degradado no lisossoma 2, 3, 4, 5. Mais recentemente, Li et al. demonstrada utilizando transferência de Förster de energia de ressonância (FRET) e microscopia de imagem de tempo de vida de fluorescência (FLIM) técnicas que a 1A R colocaliza (em ~ 10 nm escala) com LAMP1, uma proteína de membrana lisossomal o que sugere que pelo menos algum do receptor está voltado para e degradada por lisossomas 6. Estes autores observaram que a cloroquina inibidor lisossômico bloqueado na 1a associação R-LAMP1 que é consistente com relatórios anteriores que sugerem que um efeito da cloroquina é bloquear fusão de endossomas tardios ou autofagossomas com lisossomos. Outras abordagens indiretas para determinar AT 1a R localization nos lisossomos têm utilizado bafilomicina, um inibidor lisossômico para inferir AT 1a presença R nos lisossomos 3, 4, 5, 6, 7, 8. processamento de imagem de células vivas evita potenciais efeitos de fixação sobre o volume das células e perda / escurecimento / redistribuição de receptor GFP-quimérico. Estudos anteriores têm invocado células fixas para determinar colocalização ou co-ocorrência do receptor com lisossomas ou utilizando células vivas marcadas com substitutos de ligação ao receptor, como β-arrestina 1, 2, 3, 4, 5, 6. processamento de imagem de células vivas de outros GPCRs usando confocal disco giratório ou laser conf ponto de leituramicroscópios ocal equipados com detectores de Gaasp ou HYD habilitado investigadores para observar a internalização e tráfico de receptores em células individuais fotografada em z-stacks em 30 s intervalos de 9, 10. No entanto, mesmo quando células z-stacks vivo são recolhidos rapidamente, análise só pode ocorrer após a seleção de um único plano dentro de cada pilha, ou seja, em 2D 10. Embora isso possa ser suficiente para estudar o receptor quinase GPCR ou tirosina internalizado em questão, os Rs 1-A em acumula em vesículas que mudam de tamanho e posição ao longo do tempo e, portanto, são inerentemente mais difícil de provar de forma adequada usando uma fatia único representante em cada ponto de tempo. Para determinar completamente a rota do rotulada a 1a R através da célula e detectar cada subpopulação de vesículas que diferem em tamanho e posição, temos desenvolvido um método para geração de imagens 3D e análise 3D para acompanhar essas mudanças e ser<html> utilizado em conjunto com a rotulagem de vários compartimentos intracelulares, tais como os lisossomas. Os investigadores podem utilizar este protocolo para geração de imagens ao vivo de células de visualizar diretamente o movimento de AT 1a R dentro da célula e sua transferência para compartimentos subcelulares após a estimulação Ang II. compartimentos subcelulares são marcados com quimeras proteínas fluorescentes ou outros marcadores fluorescentes. Este protocolo pode também ser utilizado como uma primeira abordagem para localizar receptores em organelos subcelulares com uma resolução mínima de 200 nm a fim de comparar mutado contra os receptores de tipo selvagem ou para detectar alterações seguintes tratamentos farmacológicos. A técnica é acessível, uma vez que pode ser realizado em qualquer microscópio confocal equipado para processamento de imagem de células vivas. A relativa facilidade desta abordagem contrasta com o aumento da experiência e equipamento necessário para levar a cabo / FLIM técnicas FRET / BRET que detectam interacções moleculares 6,&quot;xref&quot;&gt; 11. Estas medições definir interacções proteína-proteína com uma resolução elevada (~ 10 nm) e localização dentro organelos subcelulares é inferida. Estas técnicas mais avançadas são usadas para acompanhar e definir melhor as interações moleculares de interesse, em vez de a passagem de receptores através de compartimentos subcelulares, e eles demonstram diretamente interações proteína-proteína em horários e locais específicos dentro da célula 11. FLIM, uma técnica de FRET independente da concentração de aceitador, é mais frequentemente realizada em amostras fixadas desde aquisição de imagem é mais lenta. Em contraste, a relação FRET fornece imagens rápida e co-localização de alta resolução de proteínas que interagem. A desvantagem de relação de FRET é que a imagem utiliza widefield epi-fluorescência para ganhar velocidade de imagem e incluir toda a célula, resultando na redução da resolução e contraste de organelas 12. transferência de bioluminescência de energia de ressonância (BRET) é outraavançada técnica que tem sido aplicado aos GPCRs para medir a aquisição de proximidade molecular ao longo do tempo 11. Nesta técnica, um fluoróforo proteína molecularmente é dividida e cada metade ligada a uma das duas proteínas em questão. Quando as duas proteínas de interesse ligam-se um ao outro, as partes da etiqueta quimérico voltar a montar para a aquisição de fluorescência e o aumento da fluorescência ao longo do tempo quantificada. Aqui, apresentamos uma técnica simples para geração de imagens ao vivo de células juntamente com quantificação imagem para estudar o tráfico de AT 1a R na célula com a estimulação Ang II e da alteração potencial de entrega de internalizado AT 1a R para lisossomos após a estimulação Ang II. A utilização final para esta técnica é para caracterizar diferenças de tráfico membrana comparando tipo selvagem e mutantes receptores. Estas diferenças ajudará a identificar o mecanismo (s) que o impacto atividades fisiológicas da AT 1a R leading a regulação da pressão arterial.

<table><tbody><tr><td>Angiotensina II (Ang II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9525&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Meio Modified Eagle de Dulbecco (DMEM 1x)</td><td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td><td>11960-044</td><td>Quente em 37 &deg; C banho-maria antes de usar&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>Quente em 37 &deg; C banho-maria antes de usar</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina (Estreptococo Caneta)</td><td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>Quente em 37 &deg; C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM (100x)</td><td>Gibco (life technologies)</td><td>25030-081</td><td>Quente em 37 &graus; C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>Rim Embrionário Humano (HEK)-293 células</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)&nbsp;</td><td>CRL-1573 Número de</td><td>passagem 5 - 12</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II com câmara 1.5 Sistema de Lamínula Alemão</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Reagente de Transfecção</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Loja em 4 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Opti-MEM, Soro Reduzido Médio</td><td>Gibco- ThermoFisher Scientific</td><td>31985-070</td><td>Quente em 37 &deg; C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>PBS 10x&nbsp;</td><td>BioReagentes Fisher</td><td>BP3994</td><td>Quente em 37 &deg; C banho-maria antes</td></tr><tr><td>do uso Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x)&nbsp;</td><td>Gibco -ThermoFisher Scientific</td><td>31053-028</td><td>Quente em 37 &deg; C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>Sondas moleculares LysoTracker Red DND-99</td><td>-ThermoFisher Scientific</td><td>L7528</td><td>Armazene as alíquotas no escuro a -20 &deg; C .&nbsp;</td></tr><tr><td>Volocity Ver. 6.3 Software de análise de imagem</td><td>Módulos de visualização e quantificação</td><td>PerkinElmer</td><td>Para análise de imagens 3D de pilhas de imagens</td></tr><tr><td>Leica SP8 AOBS</td><td>Microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Leica Microsystems</td><td>Para coleta de imagens</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880</td><td>Microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Carl Zeiss</td><td>Para coleta de imagens</td></tr></tbody></table>

imagens de células vivas e análise 3d da angiotensina receptor tipo tráfico 1a em células do rim transfectados embrionárias humanas usando microscopia confocal

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Processamento de imagem de células vivas é usado para capturar simultaneamente imagens de lapso de tempo de receptores do tipo angiotensina 1a (AT 1a R) e compartimentos intracelulares em células embrionárias humanas transfectadas renal-293 (HEK) após estimulação com angiotensina II (Ang II). HEK são transitoriamente transfectadas com DNA plasmídeo contendo AT 1a R marcado com reforçada proteína verde fluorescente (EGFP). Os lisossomas são identificados com um corante fluorescente vermelho. imagens ao vivo de células são capturados num microscópio confocal de varrimento laser, após a estimulação de Ang II e analisadas por software em três dimensões (3D), voxels ao longo do tempo. processamento de imagem de células vivas, permite investigações de tráfico receptor e evita confunde associados com a fixação, e em particular, a perda ou o deslocamento artefactual de receptores de membrana de EGFP-marcados. Assim, como as células individuais são rastreados através do tempo, a localização subcelular de receptores pode ser representada por imagem e medido. As imagens devem ser adquiridas sufficiently rapidamente para capturar o movimento vesícula rápida. No entanto, a velocidades mais rápidas de imagem, o número de fotões recolhidos é reduzida. Compromissos também deve ser feita na seleção de parâmetros de imagem como o tamanho do voxel, a fim de ganhar velocidade de imagem. aplicações significativas de processamento de imagem de células vivas estão a estudar proteína tráfico, migração, proliferação, ciclo celular, apoptose, autofagia e proteína-proteína interação e dinâmica, para citar apenas alguns.

Neste conjunto representativo de experiências, as células HEK foram transfectadas com o receptor de angiotensina tipo 1a (AT 1a R-GFP) construção (E1,2,3-AT 1a R) clonado no plasmídeo pEGFP-N2 13. Imagens de lapso de tempo de HEK foram adquiridos e jogado como um filme (Veja imagens de células vivas 1 e imagens de células vivas 2 filmes). Os filmes e fotografias mostram que após estimulação do ligando, a <sub...

Aqui apresentamos um protocolo para células de imagens que expressam receptores verdes fluorescentes marcado com proteína de tipo angiotensina 1a durante a endocitose iniciadas por tratamento angiotensina II. Esta técnica inclui lisossomas rotulagem com um segundo marcador fluorescente, e em seguida, utilizando software para analisar a co-localização do receptor e lisossoma em três dimensões ao longo do tempo.

Imagens de células vivas e Análise 3D da angiotensina Receptor Tipo Tráfico 1a em células do rim Transfectados embrionárias humanas usando microscopia confocal

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

O objetivo geral deste experimento é obter evidências quantitativas espaciais e temporais da colocalização do receptor de angiotensina tipo um com lisossomos após o tratamento com angiotensina dois. Este método foi desenvolvido para detectar diferenças no processamento subcelular de receptores do tipo Y em comparação com receptores mutantes, como durante o processo de internalização, que ocorre em resposta à estimulação pelo ligante. As vantagens desta técnica são a imagem em tempo real de células vivas, que elimina artefatos provenientes de células fixadas e permeabilizadas com detergentes, e a possibilidade de avaliar alterações dinâmicas na localização do receptor em tempo real.Inicie selecionando uma objetiva apropriada com abertura numérica de 1,4 e centralize a objetiva sobre a platina do microscópio. Adicione uma gota de óleo de imersão com alta viscosidade e baixa autofluorescência sobre a objetiva e transfira a câmara com as células transfectadas para a platina do microscópio. Levante suavemente a objetiva até que o óleo toque levemente a parte inferior da primeira lâmina e localize as células fracas.Com uma célula sadia de interesse no centro do campo de visão, mude para

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Biologia

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