Imagens de células vivas e Análise 3D da angiotensina Receptor Tipo Tráfico 1a em células do rim Transfectados embrionárias humanas usando microscopia confocal

O objetivo geral deste experimento é obter evidências espaciais e temporais quantitativas da colocalização do lisossomo do receptor de angiotensina tipo um após o tratamento com angiotensina dois. Este método foi desenvolvido para detectar diferenças no processamento subcelular do tipo Y versus receptores mutantes, como durante o processo de internalização, que se pronuncia em resposta à simulação do ligante. As vantagens desta técnica são que a imagem de células vivas, elimina artefatos de células permeabilizadas fixas e detergentes e que mudanças dinâmicas na localização do receptor podem ser avaliadas em tempo real.

Comece selecionando uma objetiva de abertura numérica de 1,4 apropriada e centralizando a objetiva sobre a platina do microscópio. Adicione uma gota de óleo de imersão de alta viscosidade e baixa florescência automática na objetiva e transfira a câmara com as células transfectadas para o estágio do microscópio. Levante suavemente a objetiva até que o óleo toque a parte inferior da primeira lâmina e localize as células escuras.

Com uma célula de interesse saudável, no centro do campo de visão, mude para o modo confocal e confirme se a célula está bem espalhada, com seu lado ventral justaposto à lamínula. Abra a caixa de diálogo Pilha Z, clique em Ao vivo, concentre-se na parte superior da célula e clique em Iniciar. Em seguida, concentre-se na parte inferior da célula, insira o tamanho do passo Z 1,00 micrômetro e clique em Finalizar.

Em seguida, selecione Modo XYZT em Configurações de aquisição na parte superior. Por fim, defina o intervalo de tempo para a varredura e o período de tempo para a varredura para observar o direcionamento do receptor de angiotensina tipo 1A marcado com GFP para os lisossomos. Em seguida, para iniciar a estimulação do ligante, adicione três microlitros de uma solução estoque de ligante 100 X ao poço que está sendo fotografado e clique em Iniciar para obter a imagem da resposta em 3D para o período e frequência desejados.

Para analisar as imagens de células ativas, abra o software de quantificação de imagem 3D apropriado. Neste protocolo, o Velocity. Clique com o botão direito do mouse no campo de imagem e selecione Propriedades.

Insira as propriedades de pixel de imagem XY e Z apropriadas para criar uma sequência de medição para analisar a vesícula do receptor marcada com GFP e as intensidades das células de buraco em resposta ao tratamento com ligante. No menu 2D, selecione o modo de foco estendido para observar a célula. Em seguida, use a ferramenta de região de estilo livre para desenhar uma região de interesse ao redor da célula e clique com o botão direito do mouse na imagem para selecionar Cortar para seleção.

Um novo item de imagem será gerado. Clique no nome da imagem para selecionar a imagem da célula cortada e abrir a guia de medição. Para medir a expressão GFP das vesículas internalizadas, arraste Localizar objetos da localização para a caixa de sequência acima.

Defina o canal de localização de objetos como GFP e abra o ícone de configurações para definir o limite usando o desvio padrão e o limite inferior como seis, para selecionar objetos com as intensidades GFP mais brilhantes. Defina o tamanho mínimo do objeto como zero micrômetros cúbicos. Em seguida, clique em medir e selecione os canais e os tipos de medições.

Para definir o limite e os filtros para identificar a célula inteira e medir a intensidade total do GFP, arraste uma segunda caixa Localizar objetos. Em seguida, defina o canal Localizar objetos como GFP e defina o desvio padrão como zero, para selecionar objetos com qualquer intensidade GFP e tamanho mínimo do objeto para dois micrômetros cúbicos. Arraste Filtrar População para a caixa População dois Localizar Objetos e selecione um volume de micrômetros ao cubo, maior que 100 para selecionar a célula inteira e eliminar todos os objetos menores.

Em seguida, selecione as medições e o item Fazer medição, para fazer a medição em todos os pontos de tempo. Para analisar a expressão de GFP medida em vesículas e em toda a célula ao longo do tempo, clique no nome do arquivo do item de medição abaixo do nome da imagem. Para extrair os dados de GFP e vesículas dos dados totais, abra a guia bruta e selecione população um.

Em seguida, abra a guia analisada e clique com o botão direito do mouse nos dados, selecione análise, seguido de restringir a análise para selecionar a população um. Para medir a quantidade de GFP em toda a célula, altere ambos para a população dois. Em Analisar estes dados e resumir por, selecione soma, GFP, cor, canal e soma.

Em seguida, em Organizar os dados por e linha, selecione ponto de tempo. Para extrair os dados da quantidade de GFP nos lisossomos, no Find Objects para a população um, defina o canal Find objects para o canal vermelho. No ícone de roda na caixa de diálogo, defina o limite usando o desvio padrão, o limite inferior como seis, para selecionar objetos vermelhos com as intensidades mais brilhantes e o tamanho mínimo do objeto como 0,017 micrômetros cúbicos.

Selecione as medições e faça o item de medição, para fazer a medição em todos os pontos de tempo. Para analisar a expressão GFP medida em lisossomos, clique no nome do arquivo do item de medição abaixo do nome da imagem. Selecione a população um na guia bruta e, em seguida, selecione a população um e some o canal de cores GFP e a soma na guia de análise, clicando com o botão direito do mouse como antes para medir a quantidade de GFP nas vesículas vermelhas.

Antes da estimulação do ligante, os receptores de angiotensina tipo 1A marcados com GFP estão localizados predominantemente na membrana plasmática. Mas dentro de 2,5 minutos após a adição da angiotensina dois, esses receptores se tornam internalizados, formando vesículas brilhantes e posteriormente agrupadas e grandes vesículas paranuclearzomas. O babado induzido pela angiotensina dois complica a quantificação da intensidade total da GFP da vesícula, conforme observado para esses dados representativos de medição da expressão de GFP.

A filtragem de tamanho não discrimina entre os babados maiores e as vesículas agrupadas, mas revela que a GFP em objetos menores aumenta mais cedo do que a GFP em objetos maiores. Neste curso de tempo representativo da expressão de GFP sem foco automático, a GFP internalizada foi medida como a porcentagem de GFP celular total. A análise da GFP total dentro da célula revelou que esta célula não fotografou alvejante de forma apreciável ao longo do tempo.

A quantificação da GFP nos lisossomos das células transfectadas também indica que a intensidade do receptor de angiotensina tipo 1A presente nos lisossomos não varia por até 24 minutos após a administração da angiotensina dois. Durante este procedimento, é importante lembrar de monitorar a saúde das células antes e durante a imagem, uma vez que o procedimento é demorado, o experimento deve ser abortado se as culturas de células forem anormais de alguma forma. Após este procedimento, imunocoloração e FRET ou FLIM podem ser usados para detectar e confirmar a localização subcelular dos receptores.

Western blots podem ser realizados para abordar a identidade e as mudanças nas moléculas de sinalização envolvidas durante o tráfego do receptor. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar imagens e análises de células vivas para medir o direcionamento do receptor transmembrana induzido por ligante para lisossomos, bem como para outros compartimentos subcelulares.