Name: Análise otimizada de In Vivo e In Vitro A esteatose hepática (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprenda métodos otimizados para gerar e caracterizar esteatose hepática in vivo e in vitro. Essas técnicas permitem avaliação não invasiva do progresso fisiológico, auxiliando no estudo de doenças metabólicas como resistência à insulina e diabetes tipo II.

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Agradecemos a Feifei Zhang pelas discussões úteis. Somos gratos a Jing Gao e Yixuan Sun pela assistência técnica e a Zhengshuai Liu e Fengguang Ma pelos estudos em animais.

Todos os protocolos experimentais com animais foram aprovados pelo comitê de cuidados com os animais e uso institucional do Instituto de Ciências da Nutrição, Instituto Xangai de Ciências Biológicas, da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China). 1. DIO Modelo rato <ol><li> alimentação HFHS <ol><li> Alimente a oito semanas de idade, do sexo masculino camundongos C57BL / 6 com um HFHS que contém 40 kcal% de gordura e 40 kcal% de sacarose. Abrigá-los em 12 h condições do ciclo escuro de luz. </li><li> Mantenha os ratos em estado dieta de alimentação HFHS de quatro a 16 semanas. Verifique semanalmente o peso corporal. </li></ol></li><li> Análise de composição corporal e análise de imagem pseudo-color <ol><li> Sujeitar os ratos para uma análise de composição corporal analisador. <ol><li> Fixar ratos conscientes, não anestesiados num tubo de plástico no. Medir a massa de gordura corporal, massa magra, e fluidos usando um sistema de RMN, conforme descrito anteriormente 2. </li></ol></li><li> Digitalizar todo o corpo de cada rato utilizando um sistema de ressonância magnética. <ol><li> Anestesiar os ratos com 1% Avertin através de injecção intraperitoneal (25 mL / g) e realizar a análise de imagens em tubos de vidro especializados. NOTA: O processo de imagiologia tem a duração de cerca de 0,5 h para cada rato. Quando a medição está concluída, retornar os ratos às suas gaiolas. </li></ol></li><li> Verificar todo o corpo dos ratos no dorsal, médio e camadas ventral; digitalizar o fígado na direcção vertical. Use um ímã 0,55 T e os seguintes parâmetros instrumentais: Espaço K = 192 x 256 mm, espessura de corte = 3 mm, TE = 14,8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 mm, FOVPhase = 100 mm, e o número de scans = 8. Digitalizar usando a mesma condição magnética para todos os grupos de camundongos. </li><li> Mapear a imagem em tons de cinza em uma imagem pseudo-cor de acordo com a intensidade do sinal 9. </li></ol></li><li> rato eutanásia <ol><li> esterilizar dissectiferramentas Ng, tais como pinça e tesouras. </li><li> Despeje isoflurano suficiente sobre uma toalha de papel e deixar que o isoflurano volatilizar em um frasco de vidro. Assegure-se que os ratos são sacrificados pelo isoflurano. </li><li> Corrigir os ratos numa mesa de operação. Spray de cada abdômen com 75% de etanol, fazer uma incisão na derme do apêndice xifóide usando uma tesoura, e desgaste da derme longitudinalmente através da linha média com as mãos para expor o peritônio. </li><li> Prender o processo xifóide com uma pinça e cortar o peritoneu da largura através do fundo das nervuras para expor as vísceras. </li><li> Recolha de sangue em tubos revestidos com EDTA por punção cardíaca. </li><li> Cortar o diafragma ao longo do fígado e remova cuidadosamente o fígado dos enterocoelia usando uma tesoura fina. Corte três pedaços de tecido de fígado para as seguintes medições de lipidos: a) 6 x 3 x 3 mm para a coloração de H &amp; E, b) 6 x 3 x 3 mm de Oil Red O coloração, e c) 20-40 mg de fígado de clorofórmio / extracção de metanol. </li></ol></li><li> Coloração H &amp; E <ol><li> Corrigir o fígado em 4% de acetato de formalina tamponada com fosfato a 4 ° C durante a noite e, em seguida, incorporá-lo em cera de parafina. </li><li> Cortar secções de parafina (5 uM) e montá-los em lâminas de vidro para coloração com H @ E, conforme anteriormente descrito 3, 10. </li></ol></li><li> Oil Red O coloração <ol><li> preparação Regent <ol><li> Preparar solução de trabalho Oil Red O com formalina a 10%, isopropanol a 60%, de hematoxilina, e gelatina de glicerol. Dissolve-se 0,5 g de Oil Red O pó com 100 ml de isopropanol e aquecê-lo em um banho de 60 ° C para produzir uma solução stock a 0,5%. </li><li> Dilui-se com água bidestilada (ddH2O), a uma proporção de 3: 2 (3 mL de uma solução de estoque e 2 ml de ddH2O). Filtra-se a solução de trabalho e deixar em repouso durante pelo menos 10 min à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Incorporar o fígado na temperatura ideal de corte composto (OCT) em apcaixa de encaixe lastic. Congelá-lo a -20 ° C durante 30 min. Corte-o em seções 8 mícrons em micrótomo de congelação, montar o tecido em um slide, e colocá-lo à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Coloque uma toalha de papel no fundo de uma banheira de coloração e derramar uma pequena quantidade de formalina a 10% para molhar a toalha de papel. Coloque o slide na banheira de coloração e corrigir os cortes congelados em vapores de formaldeído por 5 min a 4 ° C. </li><li> Mergulhe a lâmina em 60% isopropanol na banheira de coloração por 3 s; repetir uma vez. </li><li> Adicionar algumas gotas de solução de trabalho de Oil Red O para o deslizamento para cobrir todos os tecidos e incubar durante 15 min. Proteger o tecido da luz à temperatura ambiente. </li><li> Lave o slide na nova isopropanol 60% na banheira de coloração por 3 s; repetir duas vezes. </li><li> Lave o slide através de água destilada duas vezes e remover a água em torno do tecido. Não se esqueça de secar o tecido. </li><li> Coloque o slide em hematoxilina durante 1 min e lavar cuidadosamente com água da torneira durante 5-10min. Lave o slide em água destilada duas vezes e manter o que em água destilada até que esteja pronto para colocar sobre a lamela. </li><li> Aquece-se a gelatina glicerol no micro-ondas e colocar várias gotas na parte superior do tecido. Delicadamente, coloque a lamela em cima e tomar cuidado para não formar bolhas. </li><li> Observe a mancha sob um microscópio e capturar imagens característicos usando 20X e 40X objectivos. </li></ol></li><li> Medição de lipidos do fígado <ol><li> Colocar o tecido de fígado dissecado em um novo tubo de centrífuga de plástico de 2 ml. Homogeneizar em 1 ml de PBS com um homogeneizador e transferir o lisado para um novo tubo de vidro de 15 ml. </li><li> Adicionar 5 mL de clorofórmio / metanol (2:, 1 v / v) de solução, de vórtice a mistura vigorosamente durante 1 min, e deixar em repouso durante 2 horas em gelo. </li><li> Centrifugar a 1.650 xg durante 10 min a 4 ° C; a mistura deve separar em 3 camadas: a camada superior de metanol, o disco proteína meio, eo clorofórmio fundo e lipídios. </li><li> Tran<html> sfer a fase inferior para um tubo de vidro de novo usando uma pipeta de Pasteur de vidro; não há necessidade de obter cada gota da fração inferior. Definir o tubo de lado no gelo. </li><li> Adicionar 600 mL de 4 mM de MgCl2 e 1,5 ml de clorofórmio para a fracção do sobrenadante a esquerda no tubo anterior e vortex vigorosamente. Incubar em gelo durante 30 minutos e centrifugar a 1650 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Combine a fase de fundo com o tubo primeira fase inferior usando Pasteur pipeta. Descartar as camadas média e alta. </li><li> Evapora-se o clorofórmio sob atmosfera de azoto num banho de 37 ° C. Lavar os lados dos tubos de vidro cuidadosamente com 200 uL de 1% de Triton X-100 / clorofórmio (v / v). Evaporar sob atmosfera de azoto. Dissolve-se o lípido com 200 uL de ddH2O e vórtice bem para tornar a emulsão final. </li><li> Medir a triglicéridos totais (TG) e colesterol (TC) níveis usando um kit de triglicéridos ou de colesterol de acordo com o protocolo do fabricantexref &quot;&gt; 3. NOTA: Os valores são normalizados de lípidos aos das concentrações de proteína no homogenato inicial, tal como determinado por quantificação de proteínas 3. </li></ol></li></ol> 2. principal do mouse Hepatócito Modelo <ol><li> O isolamento de hepatócitos primários de rato <ol><li> Anestesiar cada rato com 6% de hidrato de cloral (10 mL / g por via intraperitoneal). </li><li> Isolar hepatócitos primários, como previamente descrito 10. Cresça as células em lamelas de vidro revestidas com colagénio de uma placa de 6 poços para Oil Red O coloração. Para extracção de lípidos, semear as células numa placa de cultura celular de 10 cm 10. </li></ol></li><li> Tratamento com células e Oil Red O coloração <ol><li> Substituir o meio com 2 ml de meio de privação e incubar a 37 ° C durante 24 h. Trate-o com glucose 30 mM e 100 nM de insulina. Incubar em que uma temperatura de 37 ° C incubadora de cultura durante 24 h. </li><li> Aspirar o meio. Adicionar 2 mL de PBS e agite cuidadosamente para lavar o material; repetir uma vez. </li><li> Fixar a lamela para o slide com um elástico. Expor as células aderentes à superfície do lado de fora. Realizar a coloração de Vermelho de Óleo O, conforme descrito acima (passo 1.5). NOTA: Os níveis basais de acumulação de lípidos são estimuladas com um elevado teor de glucose, mais tratamento com insulina após privação de soro. As gotas de lípidos são visualizadas por coloração com Oil Red O. </li></ol></li><li> Medição de lípidos <ol><li> Tratar os hepatócitos com alto teor de glucose e insulina no mesmo estado (passo 2.2.1). Adicionar 1 mL de PBS a cada placa de cultura celular de 10 cm. Raspar as células e colhem-los para novos tubos de vidro de 15 ml, a partir do qual se alíquotas de 100 ul são transferidos para tubos frescos de 1,5 ml para a quantificação de proteína. </li><li> Adicionar 4 ml de clorofórmio / metanol (2: 1, v / v) para os restantes 900 ul de células. Sonicate por aproximados 20 sinais sonoros e, em seguida, vortex vigorosamente para liberaro lípido nas células. Incubar a mistura em gelo durante 2 h. Realizar a extração de lipídios (passo 1.6). </li></ol></li></ol>

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<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+ATF6+Increases+Fatty+Acid+Oxidation+to+Attenuate+Hepatic+Steatosis+in+Mice+through+Peroxisome+Proliferator-Activated+Receptor+Alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha.</a> Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK+phosphorylates+and+inhibits+SREBP+activity+to+attenuate+hepatic+steatosis+and+atherosclerosis+in+diet-induced+insulin-resistant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice.</a> Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+SIRT1+attenuates+hepatic+steatosis+and+controls+energy+balance+in+mice+by+inducing+fibroblast+growth+factor+21%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21.</a> Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).</li>
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<li>Kanda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCP-1+contributes+to+macrophage+infiltration+into+adipose+tissue%2C+insulin+resistance%2C+and+hepatic+steatosis+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).</li>
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<li>Hebbard, L., George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Animal models of nonalcoholic fatty liver disease.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+effective+inhibition+of+lung+cancer+growth+and+metastasis+by+systemic+delivery+of+siRNA+via+multimodal+mesoporous+silica-based+nanocarrier%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier.</a> Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).</li>
<li>Gong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+21+improves+hepatic+insulin+sensitivity+by+inhibiting+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice.</a> Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).</li>
<li>Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23507799">Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. Financiamento: Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (No. 81270930, 31471129 e 31671224) e os cem talentos Programa da Academia Chinesa de Ciências (2013OHTP04) para YL

Esteatose hepática é uma série de doenças do fígado progressivas que está associado com o síndrome metabólico, a obesidade, resistência à insulina, ou diabetes mellitus tipo 2 (DM2) 11. A marca da DHGNA é esteatose, a acumulação de lípidos nos hepatócitos. Aqui, um espectro de métodos é apresentada para caracterizar os fenótipos e parâmetros de esteatose hepática utilizando ratinhos DIO e hepatócitos primários de rato. Este procedimento pode ser útil para elucidar os mecanismos moleculares da est...

A obesidade é um problema de saúde crescente em países desenvolvidos e em desenvolvimento. Tem sido relatada como sendo uma das condições coexistentes frequentemente associadas com doença hepática não-alcoólica (EHNA), com uma prevalência que varia entre 30 e 100 por cento em pacientes NAFLD 1. Devido à forte correlação entre o fígado gordo e obesidade, obesos (DIO) modelos de rato induzida por dieta são amplamente usadas para estudar os mecanismos moleculares complexas associadas com o desenvolvimento de EHNA 2, 3, 4, 5, 6. A esteatose hepática é o primeiro estágio de DHGNA, e pode evoluir para esteato-hepatite não alcoólica (NASH), cirrose, e, finalmente, câncer de fígado 7. Portanto, o objetivo geral deste método é gerar modelos animais e celulares de condições com esteatose hepática e ao PROvide protocolos detalhados para a medição de lípidos eficiente e preciso. Estes modelos e medições são também úteis para a investigação de outros distúrbios metabólicos, tais como a resistência à insulina e diabetes tipo 2. Como a obesidade é identificado como sendo um dos principais factores de risco para EHNA, um alto teor de gordura, alta-sacarose dieta (HFHS) que imita a dieta de alta gordura de estilo ocidental é utilizado para induzir obesidade em ratos. Subsequentemente, o grau de esteatose hepática pode ser avaliada utilizando métodos diferentes. Primeiro, o peso corporal e análise de composição corporal com ressonância magnética nuclear (RMN) mostra a acumulação de lípidos durante a alimentação. A massa de gordura e massa magra pode ser quantificado de um modo não-invasivo e em tempo real. Além disso, a imagem por ressonância magnética (MRI) é usado para mostrar tanto a todo o organismo e a distribuição de gordura no fígado. O sinal de escala de cinzentos da análise de ressonância magnética pode ser convertido numa imagem de pseudo-cor legível, e a intensidade dea escala de cinza e cor é hemi-quantificáveis. Esta tecnologia proporciona vantagens únicas para a medição da acumulação de lípidos nos animais vivos. Segundo, a análise histológica do fígado é o método mais comummente utilizado para determinar a esteatose hepática. Hematoxilina e Eosina (H &amp; E) Coloração histológica fornece informações, tais como a morfologia dos hepatócitos e infiltração de macrófagos, enquanto Oil Red O coloração mostra o tamanho e a posição das gotículas lipídicas em hepatócitos. Em terceiro lugar, a análise do conteúdo de lípidos utilizando extracção com clorofórmio / metanol é uma medida precisa e quantitativa de lípidos hepática. Os níveis totais de triglicérides e colesterol pode ser medido com métodos bioquímicos. Mais importante, a análise de extracção lipídica e Oil Red O coloração pode também ser usado em geneticamente manipuladas ou tratadas farmaceuticamente hepatócitos. A vantagem do presente método é a sua utilização de várias abordagens optimizadas para gerar modelos de esteatose hepáticae caracterizar exaustivamente os fenótipos tanto in vivo como in vitro. Os modelos de ratos DIO pode recapitular a patologia e metabólicas fenótipos de doença hepática gordurosa humano. Outros parâmetros metabólicos em seres humanos pode ser replicado neste modelo bem 8. A geração do modelo de hepatócitos esteatótica em resposta ao alto teor de glucose e insulina é eficiente, útil, e supera a limitação do trabalho caro e demorado rato. Tomados em conjunto, estes métodos são suficientes e é essencial para o estudo da disfunção lípidos hepática e resistência à insulina durante a sobrecarga de nutrientes.

<table><tbody><tr><td>Composto O.C.T</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Óleo Vermelho O</td><td>Sigma</td><td>O0625-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Triglicerídeos</td><td>Infinitos Fisher&nbsp; Kit de</td> colesterol <td>Infinity da Scientific TR22421</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>TR13421</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno tipo I, cauda de rato</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (baixa glicose)</td> <td>Invitrogen</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>cellgro</td><td>R21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>cellgro</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>TOCRIS Bioscience</td><td>3435</td><td>dissolver em PBS, 1 mM para estoque</td></tr><tr><td>Microscópio de glicose</td><td>Sigma</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr> Bomba <tr><td>peristáltica Bomba peristáltica</td><td></td><td></td> Bomba peristáltica Longerpump BT100-2J <td></td></tr><tr><td>10 cm Placa de cultura de células</td><td>Corning</td><td>420167</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> placa de 6 poços <td></td></tr><tr><td></td><td>Ressonância</td> magnética nuclear de Beyotime P0010 de Corning <td>3516</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>BCA</td><td></td></tr><tr><td></td> tecnologia <td>MiniQMR23-060H-I</td><td></td>da dieta alta gorda do <td>surcose</td></tr> (<tr><td>HFHS)</td> <td>dietas</td><td>D12327</td><td></td> do surcose</tr></tbody></table>

análise otimizada de<em&gt; in vivo</em&gt; e<em&gt; in vitro</em&gt; a esteatose hepática

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Estabelecer um sistema de procedimentos para caracterizar qualitativa e quantitativamente a esteatose hepática in vivo e in vitro é importante para o estudo metabólico no fígado. Aqui, vários ensaios são descritos para medir de forma abrangente o fenótipo e os parâmetros da esteatose hepática em modelos de camundongos e hepatócitos. 
Combinando os métodos fisiológico, histológico e bioquímico, este sistema pode ser usado para avaliar o progresso da esteatose hepática. In vivo, as medidas de peso corporal e ressonância magnética nuclear (RMN) fornecem uma compreensão geral dos camundongos de maneira não invasiva. A coloração de hematoxilina e eosina (H&E) e Oil Red O determinam a morfologia histológica e a deposição de lipídios do tecido hepático sob condições de sobrecarga de nutrientes, como alimentação com dieta rica em gordura. Em seguida, os teores lipídicos totais são isolados por extração de clorofórmio/metanol, que são seguidos por uma análise bioquímica para triglicerídeos e colesterol. Além disso, os hepatócitos primários de camundongos são tratados com glicose alta mais insulina para estimular o acúmulo de lipídios, um modelo in vitro eficiente para imitar a hiperglicemia induzida pela dieta e a hiperinsulinemia in vivo. Em seguida, a deposição lipídica é medida pela coloração Oil Red O e extração com clorofórmio/metanol. A coloração Oil Red O determina fenótipos esteatóticos hepáticos intuitivos, enquanto a análise de extração lipídica determina os parâmetros que podem ser analisados estatisticamente. Os protocolos atuais são de interesse para cientistas nas áreas de doenças hepáticas gordurosas, resistência à insulina e diabetes tipo 2.

Como mostrado na Figura 1A, o peso do corpo do rato foi aumentada para 45 ± 1,2 g depois de 16 semanas de alimentação HFHS, que é aproximadamente 1,5 vezes maior do que o grupo de dieta de comida de alimentação. A análise de RMN da composição corporal que mostra a massa de gordura e massa magra de ratos são indicados (Figura 1B). As distribuições de gordura do corpo inteiro e do fígado foram determinados por ressonância magnética e imagens de pseudo-cor ...

Aqui, são descritos métodos otimizados para gerar modelos in vivo e in vitro de esteatose hepática e analisar os fenótipos esteatóticos e parâmetros fisiológicos relacionados.

Análise otimizada de<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; A esteatose hepática

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um método otimizado para gerar e caracterizar esteatose hepática utilizando abordagens in vivo e in vitro. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no estudo mecanicista da desrepressão hepática do metabolismo de lipídios e glicose durante a sobrecarga nutricional e obesidade. Uma vantagem dessas técnicas é que a evolução fisiológica da esteatose hepática pode ser avaliada de forma não invasiva antes da análise histológica e bioquímica.Este método pode fornecer informações sobre a Doença do Fígado Gordo. Também pode ser aplicado a outras doenças metabólicas, como Resistência à Insulina, Diabetes Tipo II e obesidade. Demonstrarão o procedimento Zhimin, Yamei e Aoyuan.São todos estudantes de pós-graduação que trabalham na regulação transcricional do metabolismo de lipídios e glicose do meu laboratório. Após anestesiar o camundongo doador, colete uma amostra de sangue por punção cardíaca e recolha o sangue em um tubo com linha de EDTA. Para remover o fígado, corte o diafragma ao longo do comprimento do fígado e retire-o cuidadosamente do entero colia.A partir do fígado, prepare dois blocos de tecido para coloração com hematoxil

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Neste vídeo, demonstramos a coloração in vitro de lipídios neutros em hepatócitos para detectar esteatose hepática ou acúmulo excessivo de gordura no fígado. O excesso de gordura é acumulado nas células na forma de gotículas lipídicas. O óleo Red O é um corante lipossolúvel que se liga a lipídios neutros intracelulares nessas gotículas lipídicas. Quando observadas ao microscópio óptico, essas gotículas lipídicas intracelulares aparecem intensamente vermelhas.

Coloração Oil Red O: Uma Técnica para Coloração de Lipídios Neutros em Hepatócitos para Detecção de Esteatose Hepática In Vitro

De novo a lipogênese e oxidação do ácido β-gordo constituem vias metabólicas importantes em hepatócitos, caminhos que são perturbados em vários distúrbios metabólicos, incluindo a doença de fígado gordo. Aqui demonstramos isolamento de hepatócitos primários de rato e descrever quantificação da oxidação de ácidos graxos e β-lipogênese.

Determinação da oxidação de ácidos gordos e Lipogênese em Rato Os hepatócitos primária

O presente relato descreve um ensaio enzimático in vitro para medir a atividade da fosfatidiletanolamina metiltransferase usando extratos de células de Leishmania. Este ensaio é baseado na transferência de um grupo metil radioativo de S-[Metil-3H]adenosil-L-metionina para fosfatidiletanolamina endógena.

Ensaio in vitro para medir Fosfatidiletanolamina Metiltransferase Atividade

Neste estudo, nós descrevemos um protocolo detalhado para induzir o esteatose vesicular do fígado em pilhas diferenciadas de HepaRG com o oleato do sódio do sal do ácido gordo e empregamos métodos para a deteção e a quantificação da acumulação do lipido, incluindo anti-Stokes coerente Microscopia do espalhamento de Raman (carros), análise cytofluorimetric, mancha vermelha O do óleo, e qPCR.

Induzir e caracterizar a esteatose vesicular em células HepaRG diferenciadas

Este protocolo pretende ser uma ferramenta para estudar a esteatose e as alterações moleculares, bioquímicas, celulares produzidas pela exposição excessiva de hepatócitos a lipídios in vitro.

Um modelo de esteatose experimental in vitro: cultura celular hepatocitada em meio lipídidamente condicionado

O ácido graxo β-oxidação é uma via metabólica essencial responsável pela geração de energia em muitos tipos diferentes de células, incluindo hepatócitos. Aqui, descrevemos um método para medir o ácido graxo β-oxidação em hepatócitos primários recém-isolados usando ácido palmítico de 14C.

Medição do ácido graxo β-oxidação em uma suspensão de hepatócitos de rato recém-isolados

Usando um modelo de camundongo com doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) induzida por dieta, descrevemos o uso de novas técnicas de microtomografia computadorizada in vivo como um método não invasivo para avaliar os estágios de progressão da DHGNA, enfocando predominantemente a rede vascular hepática devido ao seu envolvimento significativo na desregulação hepática relacionada à DHGNA.

Novas Técnicas de Imagem por Microtomografia Computadorizada In Vivo para Avaliação da Progressão da Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica

Neste artigo, demonstramos um protocolo otimizado baseado em fluorescência BODIPY 493/503 para caracterização de gotículas lipídicas em tecido hepático. Através do uso de projeções ortogonais e reconstruções 3D, o fluoróforo permite o sucesso da discriminação entre esteatose microvesicular e macrovesicular e pode representar uma abordagem complementar aos protocolos histológicos clássicos para avaliação da esteatose hepática.

Análise de Gotículas Lipídicas Coradas por Fluorescência com Reconstrução 3D para Avaliação da Esteatose Hepática

Este artigo descreve o uso de células HepG2 induzidas por ácido oleico como modelo para doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica.

Modelagem in vitro da deposição de gordura na doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica

Um sistema óptico foi desenvolvido para visualizar a microcirculação hepática com eritrócitos marcados com FITC e para medir a pressão parcial de oxigénio no microvasos com laser assistida phosphorimetry. Este método pode ser usado para investigar os mecanismos fisiológicos e patológicos, analisando a estrutura microvascular, o diâmetro, a velocidade de fluxo de sangue, e tensão de oxigénio.

Visualização e análise do fluxo sangüíneo e consumo de oxigênio na microcirculação hepática: aplicação para um modelo Hepatite Aguda

Aprenda métodos otimizados para gerar e caracterizar esteatose hepática in vivo e in vitro. Essas técnicas permitem avaliação não invasiva do progresso fisiológico, auxiliando no estudo de doenças metabólicas como resistência à insulina e diabetes tipo II.

Análise otimizada de

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