Name: Targeted Plasma Membrane entrega de um hidrofóbica Carga encapsulado em um cristal líquido nanopartículas Transportador (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprenda a usar nanopartículas de cristal líquido para entrega direcionada de cargas hidrofóbicas à membrana plasmática de células mamíferas vivas. Este método reduz a citotoxicidade e melhora a eficiência da liberação de fármacos.

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Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Financiamento Base de NRL (Trabalho Unidade MA041-06-41-4943). ON é apoiado por uma Pós-Investigação Associateship National Research Council.

1. Preparação de DIO-LCNP e DIO-LCNP-PEG-Chol <ol><li> Dissolve-se diacrilato de líquido cristalino agente de reticulação (DACTP11, 45 mg), 3,3&#39;-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DiO, 2 mg), e um iniciador de radical livre (azobisisobutironitrilo, 1 mg) para a polimerização em 2 ml de clorofórmio. Adicionar esta a uma solução aquosa de tensioactivo funcionalizado com acrilato (AC10COONa, 13 mg em 7 ml). </li><li> Agita-se a mistura durante 1 hora e sonicado a 80% de amplitude, durante 5 min para produzir uma miniemulsão constituído por pequenas gotículas do material orgânico polimerizável rodeado por agente tensioactivo em água. </li><li> Aquecer a mistura a 64 ° C num banho de óleo para iniciar a polimerização de ambos o agente de reticulação e surfactante como o clorofórmio se evaporar lentamente, deixando uma suspensão contendo NP-DiO que é estabilizado pelo tensioactivo. </li><li> Filtra-se a suspensão NP (3 vezes) através de um filtro de seringa 0,2 fim para remover qualquer agregação. Store a solução NP filtrado a 4 ° C até uso posterior. </li><li> Conjugação de PEG-Chol para Dio-LCNP através de acoplamento EDC. <ol><li> Dissolve-Chol-PEG-NH2-HCl (PEG-Chol, 0,9 mM) em tampão HEPES 25 mM (pH 7,0). </li><li> Preparar uma solução de trabalho contendo sal N- -hidroxi-sulfossuccinimida de sódio (NHSs, 40 mM) e 1-etil-3- (3- (dimetilamino) -propil) carbodiimida (EDC, 400 mM) em tampão HEPES a partir de soluções stock concentradas. </li><li> Imediatamente adicionar 20 ul da solução de trabalho preparada de fresco de NHSs / EDC, para 1,0 ml de DIO-LCNP em tampão HEPES e agita-se durante 5 min. </li><li> Adicionar 20 ul de solução de estoque de Chol-PEG-NH2-HCl a esta mistura e agita-se durante 2 h. </li><li> Resumidamente, centrifugar a mistura de reacção à velocidade máxima (~ 2000 x g) durante 30 segundos usando um tampo de mesa e mini-centrifugador passar o sobrenadante através de um PD-10 coluna de cromatografia de exclusão de tamanho 13 equilibrada comsolução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS, 0,1X). </li></ol></li></ol> 2. Caracterização do DIO-LCNP e Dio-LCNP-PEG-Chol <ol><li> Confirmar o sucesso a conjugação covalente de PEG-Chol à superfície do DIO-LCNP por electroforese em gel. <ol><li> Dissolve-se 0,5 g de agarose em 50 ml (1x) de electroforese Tris-borato (TBE; Tris 89 mM (pH 7,6), ácido bórico 89 mM e EDTA 2 mM) tampão. Aquece-se a solução num forno de microondas para dissolver a agarose. Deixe a solução esfriar um pouco e despeje o conteúdo em uma placa de gel na caixa de eletroforese. Insira um pente de gel para criar poços de amostra. </li><li> Uma vez que o gel tem solidificado, adicione a quantidade necessária (suficiente para submergir o gel na câmara) de TBE tampão de corrida para a câmara. </li><li> Adicionar 35 ul de amostra DIO-LCNP (alterado com glicerol, 5% v / v) para os poços do gel e correr durante 20 min a uma voltagem de 110 V. </li><li> Imagem do gel usando um sistema de imagem wi gelfiltros de excitação e emissão de th a 488 nm e 500-550 nm, respectivamente. </li></ol></li><li> Avaliar o tamanho de partículas e distribuição por dispersão de luz dinâmica (DLS), diluindo a solução DIO-LCNP (diluição ~ 200 vezes) em PBS (pH ~ 8, 0,1x) e medição de um instrumento de DLS 14. Medir o potencial zeta do DIO-LCNPs utilizando um instrumento de medição de potencial zeta apropriado. </li></ol> 3. Preparação de Cultura Celular Loiça para Experimentos de entrega e de imagem NOTA: rotulagem DIO-LCNP é realizada em células HEK 293T / 17 células de rim embrionário humano (entre as passagens 5 e 15) que são cultivadas tal como descrito anteriormente 4. Execute as experiências de entrega ea imagens de células subsequente conforme descrito abaixo. <ol><li> Preparar 35 mm pratos de cultura de tecido de diâmetro (14 mm equipado com inserções lamela No. 1) por revestimento com fibronectina bovina (~ 100 ul a uma concentração de 20 ug/ Ml) em DPBS durante 2 h a 37 ° C. </li><li> Remover a solução de revestimento de fibronectina a partir da placa de cultura. Colheita HEK 293 T1 / 7 células do frasco T-25 por primeira lavagem da monocamada de células com 3 ml de DPBS e depois pela adição de 2 ml de tripsina-EDTA (0,5% de tripsina-EDTA a 0,25%). </li><li> Incubar o balão a 37 ° C durante ~ 3 min. Remover a tripsina-EDTA e devolver o balão para a incubadora. Uma vez que as células são separadas do balão, neutralizar a tripsina por adição de 4 ml de meio completo (Dulbecco Modified Eagle Médium; DMEM; alterado de modo a conter 10% de soro fetal bovino, 5% de piruvato de sódio, e 5% de antibiótico / antimicótico) ao balão . Determinar a concentração de células na suspensão fazendo a contagem num contador de células. </li><li> Ajustar a concentração de células a 8 x 10 ~ 4 células / ml com meio de crescimento. Adicionar 3 mL da suspensão de células para o prato e a cultura na incubadora durante a noite; no dia seguinte, as células devem estar a ~ 70% de confluência e deve estar pronto para uso. Adequadodensidade celular é crítica para a rotulagem robusto e eficiente de uma percentagem elevada de células. </li></ol> 4. Entrega Cellular da OID e Dio-LCNPs e imagem das células fixas <ol><li> Prepare 1 ml de soluções de Dio Dio-LCNP e Dio-LCNP-PEG-Chol em meio de entrega (HEPES-DMEM; DMEM contendo HEPES 25 mM) por diluição de soluções de reserva da OID gratuito e Dio-LCNPs; Dio concentrações adequadas para a incubação sobre as células serão ~ 1-10 uM (expresso como a concentração de DiO livre ou DiO sob a forma de DIO-LCNP). </li><li> Remover o meio de crescimento a partir das placas de cultura, utilizando uma pipeta serológica e lava-se as monocamadas de células (ver etapa 3), duas vezes com HEPES-DMEM (2 ml cada lavagem). Realizar as lavagens por adição e remoção de HEPES-DMEM, usando uma pipeta para / a partir do bordo dos pratos suavemente. </li><li> Adicionar 0,2 ml das soluções de entrega livre ou DIO-LCNP preparados Dio para o centro das placas de cultura e devolver os pratos à incubator por um período de tempo adequado (tipicamente 15 ou 30 minutos, dependendo das necessidades da experiência). Períodos de incubação mais longos adicionar à rotulagem celular mais não específica de áreas não-membranoso (por exemplo, citosol). </li><li> Após o período de incubação, remove as soluções de transferência, usando uma pipeta serológica. Lavam-se as monocamadas de células duas vezes com DPBS (2 ml cada lavagem). Realizar as lavagens, adicionando suavemente e removendo DPBS para / a partir da borda do prato. </li><li> Fixar as monocamadas celulares utilizando 4% de paraformaldeído (preparado em DPBS) durante 15 min à temperatura ambiente. CUIDADO: O paraformaldeído é inflamável, um irritante respiratório, e um cancerígeno. </li><li> Remover a solução de paraformaldeído, utilizando uma pipeta e lavar cuidadosamente as células uma vez com DPBS (2 ml) por adição e remoção de DPBS utilizando pipeta para / a partir do bordo dos pratos. </li><li> As células fixadas são pronto a ser trabalhada para a presença de um sinal de fluorescência utilizando membranosa confocal de varrimento lasermicroscopia (CLSM). Realizar a imagiologia imediatamente, ou, alternativamente, substituir o meio com DPBS contendo 0,05% de NaN 3 e armazenar os pratos a 4 ° C. CUIDADO: NaN 3 é tóxico; exercer extrema cautela quando se utiliza NaN 3. NOTA: Fixo amostras armazenadas deste modo deverão ser trabalhada dentro de 48 horas para os melhores resultados. </li></ol> 5. Entrega Cellular da OID e Dio-LCNPs e FRET imagem latente em células vivas NOTA: Neste método, as células são colabeled com 6 uM cada DIO-LCNP-PEG-Chol (onde DiO é um dador FRET) e 1,1&#39;-dioctadecil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-perclorato tetramethylindocarbocyanine (DII livre, onde DII é um aceitador FRET). O lançamento do DIO junto da DIO-LCNP-PEG-Chol e sua incorporação na membrana plasmática é confirmada por um aumento observado na transferência de energia do doador DiO ao aceitante DII. <ol><li> Células de etiquetas sequencialmente com Dio-LCNP-PEG-Chol e DII freE Utilizando o método descrito no passo 4. </li><li> Após a coloração, lavar as células uma vez com DPBS (2 ml) usando uma pipeta serológica e substituir o tampão de lavagem com 2 ml de solução de imagem de células vivas (LCI). </li><li> Em um estágio do microscópio equipado com uma câmara de incubação aquecida, imagem da amostra de células vivas usando um microscópio confocal (objetiva 60X) com uma configuração de imagens FRET em intervalos de 30 min durante um período de 4 horas por emocionante o doador DiO a 488 nm e recolhendo a emissão completa os espectros de ambos o dador e o aceitador DiO DII 490-700 nm com um detector espectral 32 canais. </li><li> NOTA: Para mais informações sobre imagens FRET, por favor ver referência 15. </li><li> Determinar a intensidade de emissão resolvida no tempo do dador e do aceitador DiO DII a partir de células coradas com o DIO-LCNP-PEG-Chol e DII. Calcule o tempo resolvido doador / receptor FRET relação (DII emi / DiO emi) para as imagens, o que irá aumentar de forma constante e, eventualmente, placaau uma vez que a quantidade de doador DiO particionado na membrana atingiu um máximo de 16. </li></ol> 6. Ensaio de Citotoxicidade de DiO e DIO-LCNPs para os HEK 293T / 17 células NOTA: A citotoxicidade dos materiais DIO-LCNP é avaliada utilizando um ensaio de proliferação com base-corante de tetrazólio 17. As células são cultivadas numa placa de poços múltiplos na presença de várias concentrações dos materiais, sob condições que simulam a entrega / rotulagem. As células são então cultivadas durante 72 horas para permitir a proliferação. Um corante (MTS (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio) é então adicionada aos poços, e metabolicamente ativo células converter o corante num produto de formazano azul. a quantidade de formação de cor é directamente proporcional ao número de células viáveis. <ol><li> Colheita HEK 293 T1 / 7 células do frasco T-25, seguindo o procedimento descrito no passo 3.2.SeedHEK 293T 17 / células (5000 células / 100 ^ l / poço) para os poços de uma placa de 96 poços de cultura de tecidos tratados com cultura e durante 24 h. </li><li> Remover completamente os meios de cultura dos poços utilizando uma micropipeta e adicionar 50 ul de HEPES-DMEM contendo DiO livre, Dio-LCNPs ou DIO-LCNP-PEG-Chol em concentrações crescentes para replicar poços. Incubar as células em a 37 ° C durante 30 min. NOTA: Normalmente, replica feito em triplicado ou quadruplicado são suficientes para produzir dados estatisticamente fiáveis. <ol><li> Após a incubação, remover o meio de entrega que contém os materiais utilizando uma micropipeta e substituí-la com 100 ul de meio de crescimento. Cultura das células durante 72 horas. </li></ol></li><li> Adicionar 20 uL de substrato a cada poço de tetrazólio, o retorno da placa para a incubadora, e permitir a formação de cor para prosseguir a 37 ° C durante 4 h. Leia a absorvância (Abs) do produto formazano a 570 nm (absorção mínimos para os DIO-LCNPs utilizados neste Study) e 650 nm (para subtracção do fundo não específico absorvância) utilizando um leitor de placas de microtitulação. </li><li> A partir do valor de absorvância diferencial (abs 570 - Abs 650) versus a concentração de material e de comunicar os resultados como percentagem de controlo da proliferação celular (grau de proliferação de células apenas em meio de cultura celular). </li></ol> Análise 7. Os dados <ol><li> Analisar estatisticamente os dados com uma análise de variância univariada (ANOVA). Para comparações múltiplas, aplicar o teste post hoc de Bonferroni. Fornecer todos os valores médios ± erro padrão da média (SEM), a menos que mencionado de outro modo. NOTA: A probabilidade aceitável para significância foi p &lt;0,05. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Um objectivo permanente de NMDD é a segmentação controlada e entrega de formulações de droga para as células e tecidos, combinada com a eficácia da droga melhorada simultânea. Uma classe específica de moléculas de fármaco para o qual este tem sido um desafio significativo é agentes de drogas / imagiologia hidrófobos que têm moderação para nenhuma solubilidade em meios aquosos. Este problema tem atormentado a transição dos fármacos potentes em sistemas de cultura celular in vitro para o ambiente clínico...

Desde o advento da interface (nanomateriais materiais ≤100 nm de, pelo menos, uma dimensão) com as células vivas, um objectivo contínuo tem sido a de tirar partido das propriedades únicas dependente do tamanho das nanopartículas (NPS) para várias aplicações. Estas aplicações incluem células e tecidos rotulagem / imagiologia (tanto in vitro como in vivo), a detecção em tempo real, e a libertação controlada de drogas e de outras cargas 1. Exemplos de tais propriedades relevantes NP incluem a emissão dependente do tamanho dos nanocristais semicondutores (quantum dots, QDs); as propriedades fototérmicos de nanopartículas de ouro; a grande capacidade de carga do núcleo aquoso de lipossomas; e a condutividade balístico de formas alotrópicas de carbono, tais como os nanotubos de carbono de parede única e grafeno. Mais recentemente, tem surgido um interesse significativo na utilização de NPS para a modulação controlada de drogas e de outras cargas, tais como o contraste / imagiologia umsenhores. Aqui, a lógica é aumentar / otimizar a solubilidade global, dose administrada, o tempo de circulação, e eventual apuramento da carga de drogas por entregá-lo como uma formulação NP significativamente. Isto veio a ser conhecido como a entrega de drogas NP-mediada (NMDD), e existem actualmente sete formulações de drogas NP aprovados pela FDA para uso na clínica para tratar vários tipos de câncer e outras centenas em várias fases de ensaios clínicos. Em essência, o objectivo é o de &quot;conseguir mais com menos;&quot; isto é, para usar o NP como um andaime para fornecer mais fármaco com menos administrações de dosagem, tirando partido da grande área superficial: volume (por exemplo, partículas duras, tais como QDs e óxidos de metal) de PN ou ao seu grande volume interior para o carregamento grandes cargas de carga (por exemplo, lipossomas ou micelas). O objectivo aqui é reduzir a necessidade de múltiplos regimes de dosagem entregues sistemicamente e, ao mesmo tempo que promove a estabilidade aquosa e melhorada a circulação, em particular paracargas de drogas hidrofóbicas desafiantes que, embora altamente eficaz, são pouco solúveis em meios aquosos. Assim, o objectivo do trabalho aqui descrito foi o de determinar a viabilidade de utilização de um novo NP andaime para a entrega controlada e específica de cargas hidrofóbicas na bicamada de membrana plasmática lipofílico. A motivação para o trabalho foi a solubilidade limitada inerente e dificuldade na entrega de moléculas hidrofóbicas para as células a partir de meios aquosos. Tipicamente, o fornecimento de tais moléculas hidrofóbicas requer o uso de solventes orgânicos (por exemplo, DMSO) ou agentes tensioactivos anfifílicos (por exemplo, poloxâmeros), que pode ser celular e do tecido viabilidade tóxico e compromisso 2, ou transportadores de micelas, o qual pode ter limitados carga interna capacidades. O transportador escolhido NP aqui era um cristal líquido NP (LCNP) nova formulação desenvolvida anteriormente 3 e que tinha sido mostrado anteriormente para conseguir um ~ 40 vezes maior<html> melhoria na eficácia do fármaco anticancro doxorrubicina em células de cultura 4. No trabalho aqui descrito, a carga representativo seleccionado foi o corante membrana potenciométrica, 3,3&#39;-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO). DiO é um corante insolúvel em água que tem sido utilizado para anterógrada e rastreamento retrógrado em vida e neurônios fixos, membrana medidas de potencial, e por membrana geral rotulagem 5, 6, 7, 8, 9. Devido à sua natureza hidrofóbica, a DIO é tipicamente adicionado directamente a monocamadas de células ou tecidos numa forma cristalina 10, ou que é incubada a concentrações muito altas (~ 1-20 uM) após diluição a partir de uma solução de estoque de concentração 11, 12. conteúdo &quot;&gt; Aqui, a abordagem foi a utilização para a plataforma LCNP, um NP multifuncional cujo núcleo interior é completamente hidrofóbico e cuja superfície é simultaneamente hidrófilo e passíveis de bioconjugação, como um veículo de entrega para DiO. DiO é incorporado no núcleo LCNP durante a síntese , e a superfície de NP é então funcional izado com uma porção de colesterol PEGuilado para promover a ligação do conjunto DIO-LCNP para a membrana do plasma da membrana. Esta abordagem resultou em um sistema de entrega que particionado DIO na membrana de plasma com uma maior fidelidade e residência membrana tempo do que a forma livre do DiO libertos de solução em massa (DiO livre). Além disso, este método mostrou que o transporte mediado por LCNP de DiO substancialmente modula e dirige a taxa de partição específica do corante na bicamada da membrana do plasma lipofilico. esta é alcançados enquanto reduzindo concomitantemente a citotoxicidade do fármaco livre por ~ 40% por entregá-lo como uma formulação LCNP. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Prevê-se que a metodologia aqui descrita será uma técnica que permite poderosa para os pesquisadores, cujo trabalho envolve ou exige a entrega celular de cargas altamente hidrofóbicos que são pouco solúveis ou completamente insolúvel em solução aquosa.

<table><tbody><tr><td>cloridrato de 1-etil-3-(3-(dimetilamino)-propil)carbodiimida (EDCA)</td><td>ThermoFisher</td><td>E2247</td><td></td></tr><tr><td>perclorato de 3,3&prime;-dioctadecyloxacarbocianina (DiO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4292-20MG</td><td>Perigoso; faça a solução de estoque em DMSO</td></tr><tr><td>Colesterol poli(etilenoglicol) cloridrato de amina</td><td>Nanocs, Inc.</td><td>PG2-AMCS-2k</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células automatizado Countess</td><td>ThermoFisher</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Dioctadecil-3,3,3&prime; &#8288;,3&prime;-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495-100MG</td><td>Perigoso; fazer solução de estoque em DMSO</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>21063045</td><td>Warm in 37 &deg; C antes</td></tr><tr><td>de usar o Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>da</td> Dulbecco 14040182 <td>Warm in 37 &deg; C antes</td></tr><tr><td>de usar Instrumento dinâmico de espalhamento de luz</td><td>ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, Reino Unido)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina Proteína Bovina, Plasma</td><td>ThermoFisher</td><td>33010018</td><td>Faça uma solução estoque 1 mg/ml usando DPBS. Use 20-30 &micro; g/ml para revestimento de prato MetTek, 2 horas a 37 &graus; C</td></tr><tr><td>Formaldeído (16%, P/V)</td><td>ThermoFisher</td><td>28906</td><td>Perigoso; diluir a 4% usando</td></tr><tr><td>células renais embrionárias humanas DPBS (HEK 293T/17)</td><td>Coleção de Cultura</td><td>Tipo Americano ATCC&reg; CRL-11268&comércio;</td><td></td></tr><tr><td>Solução de imagem de células vivas (LCIS)</td><td>ThermoFisher</td><td>A14291DJ</td><td>Warm in 37 > C antes de usar</td></tr><tr><td>MatTek 14 mm # 1.0 inserto de lamínula placa de cultura de células</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Modified Eagle Medium (DMEM) contendo 25 mM HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>21063045</td><td>Warm in 37 &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>N-hidroxisulfosuccinimida sal de sódio (NHSS)</td><td>ThermoFisher</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1si microscópio confocal espectral</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>T10282</td><td>mistura como 50% para a suspensão celular antes de contar as células</td></tr><tr><td>Instrumento de potencial Zeta</td><td>ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, Reino Unido)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Processador Ultrassônico</td><td>Sonics and Materials Inc</td><td>GEX 600-5</td><td></td></tr><tr><td>Mini Cetntrifuge</td><td></td><td>Benchmark Mini-fuge-04477</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Sephadex&trade; G-25 Médio</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc XRS Sistema de Imagem</td><td>Bio-RAD</td><td>76S/07434</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

targeted plasma membrane entrega de um hidrofóbica carga encapsulado em um cristal líquido nanopartículas transportador

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

A entrega controlada de agentes fármaco / imagiologia de células é crucial para o desenvolvimento de agentes terapêuticos e para o estudo de processos de sinalização celular. Recentemente, nanopartículas (PN) mostraram promessa significativa no desenvolvimento de tais sistemas de distribuição. Aqui, um NP (LCNP) sistema de libertação com base na cristal líquido tem sido empregue para a libertação controlada de um corante insolúvel em água, 3,3&#39;-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO), a partir de dentro do núcleo NP para a região hidrofóbica de um plasma bicamada da membrana. Durante a síntese das NPs, o corante foi eficientemente incorporado no núcleo hidrófobo LCNP, tal como foi confirmado por análises espectroscópicas múltiplas. A conjugação de um derivado de colesterol PEGuilado para a superfície da NP (DIO-LCNP-PEG-Chol) permitiu a ligação das NPs carregadas com corante para a membrana plasmática em células HEK 293T / 17. a laser microscopia confocal e Förster transferência de energia por ressonância resolvida no tempo (FRET) imaging confirmou a passagemive efluxo de DiO a partir do núcleo LCNP e sua inserção na bicamada da membrana do plasma. Finalmente, a entrega de DiO como um LCNP-PEG-Chol atenuou a citotoxicidade de DiO; a forma NP da OID exibiu ~ 30-40% menor toxicidade em comparação com Dio livre entregues a partir de solução em massa. Esta abordagem demonstra a utilidade da plataforma LCNP como uma modalidade eficaz para a entrega específica à membrana e modulação de cargas moleculares hidrofóbicas.

LCNPs foram preparados na qual o núcleo hidrófobo da NP foi carregado com uma sonda de marcação da membrana-representativo para demonstrar a utilidade do LCNP como um veículo de entrega eficiente para cargas hidrofóbicas. Para este efeito, a carga foi escolhido o corante-marcação da membrana potenciométrica altamente insolúvel em água, DiO. LCNPs DIO-carregados (DIO-LCNPs) foram sintetizados usando uma técnica mini-emulsão de duas fases, com os componentes químicos DACTP11, AC10COONa, e DiO, como mostrado na Fig...

Uma nanopartícula cristal líquido (LCNP) nanocarrier é utilizado como um veículo para a libertação controlada de uma carga hidrofóbico à membrana plasmática de células vivas.

Targeted Plasma Membrane entrega de um hidrofóbica Carga encapsulado em um cristal líquido nanopartículas Transportador

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

O objetivo geral deste procedimento experimental é utilizar uma nanopartícula baseada em cristal líquido como uma plataforma de entrega para a liberação controlada de um dicargo hidrofóbico na porção lipofílica da membrana plasmática de células mamíferas vivas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de entrega de fármacos, como, por exemplo, como permitir de forma eficiente a entrega e a captação celular de cargas hidrofóbicas pouco solúveis em água. A principal vantagem desta técnica é que ela permite uma entrega mais específica de cargas hidrofóbicas direcionadas à membrana, diretamente à membrana plasmática, aliada à redução de sua citotoxicidade.O procedimento será demonstrado pelo Dr. Okhil Nag, pós-doutorando do meu laboratório. Inicie este procedimento com a preparação da nanopartícula de cristal líquido DiO conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, adicione 20 microlitros da solução de trabalho recém-preparada de NHSS/EDC a 1,0 mililitro da nanopartícula de cristal líquido DiO em tampão HEPES.E agite por cinco minutos. Em seguida, adicione 20 µL de uma solução estoque de colésterol PEG amina a esta mistura e agite por duas horas. Após duas horas, centrifugue brevemente a mistura de reação em velocidade máxima por 30 segundos utilizando uma mini centrifugadora de bancada.Em seguida, passe o sobrenadante por uma coluna de cromatografia de exclusão por tamanho PD 10 equilibrada com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco. Para confirmar a conjugação covalente bem-sucedida do colesterol PEG à superfície da nanopartícula de cristal líquido DiO por eletroforese em gel, prepare um gel de agarose conforme descrito no protocolo textual. Após o gel ter solidificado, adicione quantidade suficiente de tampão de corrida TBE para submergir o gel na câmara.Em seguida, adicione 35 µL da amostra de nanopartículas cristalinas líquidas de DiO aos poços do gel e realize a eletroforese por 20 minutos a uma voltagem de 110 volts. Imagem o gel utilizando um sistema de imagem de gel com filtro de excitação em 488 nanômetros e filtros de emissão de 500 a 550 nanômetros. Prepare placas de cultura tecidual com diâmetro de 35 milímetros, equipadas com inserções de lamínulas nº 1 de 14 milímetros, recobrindo-as com fibronectina bovina em DPBS durante duas horas a 37 graus Celsius.Após duas horas, remova a solução de revestimento com fibronectina do recipiente de cultura. Colete as células HEK 293 T17 do frasco T25 lavando primeiro a monocamada celular com três mililitros de DPBS e, em seguida, adicionando dois mililitros de tripsina EDTA. Incube o frasco a 37 graus Celsius por aproximadamente três minutos.Uma vez que as células estejam destacadas do frasco, neutralize a tripsina adicionando quatro mililitros de meio completo ao frasco. Determine a concentração celular na suspensão contando-as em um contador de células. Em seguida, ajuste a concentração celular para aproximadamente 80.000 células por mililitro com meio de crescimento.Adicione três mililitros da suspensão celular à placa e cultive na incubadora durante a noite. No dia seguinte, as células devem apresentar aproximadamente 70 por cento de confluência e estar prontas para uso. A densidade celular adequada é essencial para uma marcação robusta e eficiente de uma alta porcentagem de células.Prepare soluções de um mililitro de DiO, nanopartícula de cristal líquido DiO e nanopartícula de cristal líquido DiO PEG colesterol no meio de entrega, diluindo as soluções estoque correspondentes. Remova o meio de crescimento dos recipientes de cultura usando uma pipeta serológica e lave as monocamadas celulares duas vezes com DMEM HEPES. Realize as lavagens usando uma pipeta para adicionar suavemente o DMEM HEPES à borda dos recipientes e, em seguida, removendo-o.Adicione 0,2 mililitros das soluções preparadas de DiO livre ou de nanopartículas de cristal líquido de DiO ao centro das placas de cultura. Em seguida, devolva as placas ao incubador por um período de tempo apropriado. Tempos de incubação mais longos levam à marcação celular inespecífica de áreas não membranosas.Após o período de incubação, remova as soluções de administração usando uma pipeta serológica. Lave as monocamadas celulares duas vezes com DPBS, utilizando dois mililitros para cada lavagem. Fixe as monocamadas celulares usando paraformaldeído a quatro por cento por 15 minutos à temperatura ambiente.Remova a solução de paraformaldeído usando uma pipeta e lave suavemente as células uma vez com dois mililitros de DPBS. Agora, as células fixadas estão prontas para serem analisadas quanto à presença de um sinal fluorescente membranar, utilizando microscopia confocal de varredura a laser. Em uma platina de microscópio equipada com uma câmara de incubação aquecida, visualize a amostra de células vivas usando um microscópio confocal para avaliar a marcação da membrana.Se a imagem não for realizada imediatamente, substitua o meio por DPBS contendo 0,05 por cento de azida de sódio e armazene as placas a quatro graus Celsius. Neste método, as células são colabelizadas com DiO como doador de FRET e DiI como aceptor de FRET. Marque as células sequencialmente com nanopartícula de cristal líquido DiO PEG colesterol e DiI livre, como anteriormente.Após a coloração, lave as células uma vez com dois mililitros de DPBS usando uma pipeta serológica e substitua por dois mililitros da solução de imagem de células vivas. Em uma platina de microscópio equipada com uma câmara de incubação aquecida, visualize a amostra de células vivas usando um microscópio confocal com imagem de FRET. Configure o experimento com intervalos de 30 minutos durante um período de quatro horas, excitando o doador DiO em 488 nanômetros e coletando espectros completos de emissão tanto do doador DiO quanto do aceptor DiI de 490 a 700 nanômetros, com um detector espectral de 32 canais.Em seguida, determine a intensidade de emissão resolvida no tempo tanto do doador DiO quanto do aceptor DiI a partir de células coradas com nanopartículas de cristal líquido DiO-PEG-colesterol e DiI. Por fim, calcule a razão FRET tempo-resolvida aceptor-doador para as imagens conforme descrito no protocolo do texto. O DiO livre se acumula de forma não específica no interior celular, ao invés das membranas plasmáticas das células, que foram contra-coradas com um fosfolipídio de membrana marcado com dil.Isso pode ser visualizado com as imagens sobrepostas. Inversamente, a nanopartícula de cristal líquido DiO com colesterol PEG marca especificamente apenas a membrana plasmática da célula, conforme visualizado pela colocalização com o fosfolipídio de membrana marcado com dil. A transferência de energia por ressonância (FRET) confirma a partição do DiO a partir da nanopartícula de cristal líquido para a bicamada lipídica da membrana, por meio de um aumento observado na transferência de energia do doador DiO para o aceitador DiI.A FRET entre DiO e DiI, bem como as alterações na emissão de DiO e DiI, confirma o aumento da FRET de DiO para DiI em função do tempo. As nanopartículas de cristal líquido DiO com PEG colesterol apresentam citotoxicidade mínima com viabilidade de 90 por cento, em comparação com toxicidade significativa do DiO livre com viabilidade de aproximadamente 50 por cento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como sintetizar nanopartículas de cristal líquido carregadas com carga, biofuncionalizá-las para direcionamento celular e imagens das células carregadas para entrega celular bem-sucedida.Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois a entrega específica do DiO a partir de solução aquosa para a membrana plasmática representa um desafio significativo. Tivemos inicialmente a ideia deste método após utilizar a plataforma de nanopartículas de cristal líquido para a entrega celular do fármaco antineoplásico doxorrubicina, observando sua capacidade de modular a cinética de captação celular do fármaco. Após este procedimento, essa abordagem pode ser implementada para a entrega celular de uma ampla variedade de cargas hidrofóbicas que apresentam um desafio particular com relação à sua entrega às células a partir de meios aquosos.Essa abordagem pode ser utilizada para alcançar uma entrega mais eficiente de fármacos direcionados à membrana e moléculas bioativas, como corantes sensíveis à voltagem para imagem cerebral ou fármacos fotodinâmicos para terapia medicamentosa assistida por fótons.

targeted-plasma-membrane-delivery-hydrophobic-cargo-encapsulated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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Espremendo celular como uma plataforma de entrega intracelular Robust Microfluidic

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