Targeted Plasma Membrane entrega de um hidrofóbica Carga encapsulado em um cristal líquido nanopartículas Transportador

O objetivo geral deste procedimento experimental é utilizar uma nanopartícula baseada em cristal líquido como uma plataforma de entrega para a liberação controlada de um dicargo hidrofóbico na porção lipofílica da membrana plasmática de células mamíferas vivas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de entrega de fármacos, como, por exemplo, como permitir de forma eficiente a entrega e a captação celular de cargas hidrofóbicas pouco solúveis em água. A principal vantagem desta técnica é que ela permite uma entrega mais específica de cargas hidrofóbicas direcionadas à membrana, diretamente à membrana plasmática, aliada à redução de sua citotoxicidade.

O procedimento será demonstrado pelo Dr. Okhil Nag, pós-doutorando do meu laboratório. Inicie este procedimento com a preparação da nanopartícula de cristal líquido DiO conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, adicione 20 microlitros da solução de trabalho recém-preparada de NHSS/EDC a 1,0 mililitro da nanopartícula de cristal líquido DiO em tampão HEPES.

E agite por cinco minutos. Em seguida, adicione 20 µL de uma solução estoque de colésterol PEG amina a esta mistura e agite por duas horas. Após duas horas, centrifugue brevemente a mistura de reação em velocidade máxima por 30 segundos utilizando uma mini centrifugadora de bancada.

Em seguida, passe o sobrenadante por uma coluna de cromatografia de exclusão por tamanho PD 10 equilibrada com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco. Para confirmar a conjugação covalente bem-sucedida do colesterol PEG à superfície da nanopartícula de cristal líquido DiO por eletroforese em gel, prepare um gel de agarose conforme descrito no protocolo textual. Após o gel ter solidificado, adicione quantidade suficiente de tampão de corrida TBE para submergir o gel na câmara.

Em seguida, adicione 35 µL da amostra de nanopartículas cristalinas líquidas de DiO aos poços do gel e realize a eletroforese por 20 minutos a uma voltagem de 110 volts. Imagem o gel utilizando um sistema de imagem de gel com filtro de excitação em 488 nanômetros e filtros de emissão de 500 a 550 nanômetros. Prepare placas de cultura tecidual com diâmetro de 35 milímetros, equipadas com inserções de lamínulas nº 1 de 14 milímetros, recobrindo-as com fibronectina bovina em DPBS durante duas horas a 37 graus Celsius.

Após duas horas, remova a solução de revestimento com fibronectina do recipiente de cultura. Colete as células HEK 293 T17 do frasco T25 lavando primeiro a monocamada celular com três mililitros de DPBS e, em seguida, adicionando dois mililitros de tripsina EDTA. Incube o frasco a 37 graus Celsius por aproximadamente três minutos.

Uma vez que as células estejam destacadas do frasco, neutralize a tripsina adicionando quatro mililitros de meio completo ao frasco. Determine a concentração celular na suspensão contando-as em um contador de células. Em seguida, ajuste a concentração celular para aproximadamente 80.000 células por mililitro com meio de crescimento.

Adicione três mililitros da suspensão celular à placa e cultive na incubadora durante a noite. No dia seguinte, as células devem apresentar aproximadamente 70 por cento de confluência e estar prontas para uso. A densidade celular adequada é essencial para uma marcação robusta e eficiente de uma alta porcentagem de células.

Prepare soluções de um mililitro de DiO, nanopartícula de cristal líquido DiO e nanopartícula de cristal líquido DiO PEG colesterol no meio de entrega, diluindo as soluções estoque correspondentes. Remova o meio de crescimento dos recipientes de cultura usando uma pipeta serológica e lave as monocamadas celulares duas vezes com DMEM HEPES. Realize as lavagens usando uma pipeta para adicionar suavemente o DMEM HEPES à borda dos recipientes e, em seguida, removendo-o.

Adicione 0,2 mililitros das soluções preparadas de DiO livre ou de nanopartículas de cristal líquido de DiO ao centro das placas de cultura. Em seguida, devolva as placas ao incubador por um período de tempo apropriado. Tempos de incubação mais longos levam à marcação celular inespecífica de áreas não membranosas.

Após o período de incubação, remova as soluções de administração usando uma pipeta serológica. Lave as monocamadas celulares duas vezes com DPBS, utilizando dois mililitros para cada lavagem. Fixe as monocamadas celulares usando paraformaldeído a quatro por cento por 15 minutos à temperatura ambiente.

Remova a solução de paraformaldeído usando uma pipeta e lave suavemente as células uma vez com dois mililitros de DPBS. Agora, as células fixadas estão prontas para serem analisadas quanto à presença de um sinal fluorescente membranar, utilizando microscopia confocal de varredura a laser. Em uma platina de microscópio equipada com uma câmara de incubação aquecida, visualize a amostra de células vivas usando um microscópio confocal para avaliar a marcação da membrana.

Se a imagem não for realizada imediatamente, substitua o meio por DPBS contendo 0,05 por cento de azida de sódio e armazene as placas a quatro graus Celsius. Neste método, as células são colabelizadas com DiO como doador de FRET e DiI como aceptor de FRET. Marque as células sequencialmente com nanopartícula de cristal líquido DiO PEG colesterol e DiI livre, como anteriormente.

Após a coloração, lave as células uma vez com dois mililitros de DPBS usando uma pipeta serológica e substitua por dois mililitros da solução de imagem de células vivas. Em uma platina de microscópio equipada com uma câmara de incubação aquecida, visualize a amostra de células vivas usando um microscópio confocal com imagem de FRET. Configure o experimento com intervalos de 30 minutos durante um período de quatro horas, excitando o doador DiO em 488 nanômetros e coletando espectros completos de emissão tanto do doador DiO quanto do aceptor DiI de 490 a 700 nanômetros, com um detector espectral de 32 canais.

Em seguida, determine a intensidade de emissão resolvida no tempo tanto do doador DiO quanto do aceptor DiI a partir de células coradas com nanopartículas de cristal líquido DiO-PEG-colesterol e DiI. Por fim, calcule a razão FRET tempo-resolvida aceptor-doador para as imagens conforme descrito no protocolo do texto. O DiO livre se acumula de forma não específica no interior celular, ao invés das membranas plasmáticas das células, que foram contra-coradas com um fosfolipídio de membrana marcado com dil.

Isso pode ser visualizado com as imagens sobrepostas. Inversamente, a nanopartícula de cristal líquido DiO com colesterol PEG marca especificamente apenas a membrana plasmática da célula, conforme visualizado pela colocalização com o fosfolipídio de membrana marcado com dil. A transferência de energia por ressonância (FRET) confirma a partição do DiO a partir da nanopartícula de cristal líquido para a bicamada lipídica da membrana, por meio de um aumento observado na transferência de energia do doador DiO para o aceitador DiI.

A FRET entre DiO e DiI, bem como as alterações na emissão de DiO e DiI, confirma o aumento da FRET de DiO para DiI em função do tempo. As nanopartículas de cristal líquido DiO com PEG colesterol apresentam citotoxicidade mínima com viabilidade de 90 por cento, em comparação com toxicidade significativa do DiO livre com viabilidade de aproximadamente 50 por cento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como sintetizar nanopartículas de cristal líquido carregadas com carga, biofuncionalizá-las para direcionamento celular e imagens das células carregadas para entrega celular bem-sucedida.

Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois a entrega específica do DiO a partir de solução aquosa para a membrana plasmática representa um desafio significativo. Tivemos inicialmente a ideia deste método após utilizar a plataforma de nanopartículas de cristal líquido para a entrega celular do fármaco antineoplásico doxorrubicina, observando sua capacidade de modular a cinética de captação celular do fármaco. Após este procedimento, essa abordagem pode ser implementada para a entrega celular de uma ampla variedade de cargas hidrofóbicas que apresentam um desafio particular com relação à sua entrega às células a partir de meios aquosos.

Essa abordagem pode ser utilizada para alcançar uma entrega mais eficiente de fármacos direcionados à membrana e moléculas bioativas, como corantes sensíveis à voltagem para imagem cerebral ou fármacos fotodinâmicos para terapia medicamentosa assistida por fótons.