Name: A Ex Vivo Método for Imaging Time-Lapse of cultivadas Rato Mesentéricas microvasculares Networks (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Aprenda a utilizar o modelo de cultura de mesentério de rato para imagens time-lapse de redes microvasculares ex vivo. Este método permite avaliar interações de células endoteliais e efeitos de drogas anti-angiogênicas em ambiente fisiologicamente relevante.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 para WLM e o Tulane Center for Aging. Gostaríamos de agradecer a Matthew Nice por sua ajuda na edição do texto do protocolo.

Todos os experimentos e os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso da Universidade de Tulane Institucional Animal (IACUC). 1. Configuração Procedimento Cirúrgico <ol><li> instrumentos de autoclave, materiais cirúrgicos e fontes de cultura antes da cirurgia. material cirúrgico para cada rato incluem: 1 cortina, uma cortina com furo pré-cortados (0,5 pol x 1,5 pol) no centro, compressas de gaze, e um resguardo absorvente. Instrumentos cirúrgicos incluem: um bisturi com uma lâmina de número 10, 2 pares de pinças, e um par de tesouras finas. fontes de cultura incluem: uma cortina, um par de pinças, e preparado inserções placa de 6 poços com filtros de policarbonato. </li><li> Esterilizar uma plataforma de Plexiglass, uma fase cirúrgica e um espaço de bancada cirúrgica com 70% de etanol. Mantenha o estágio cirúrgico em um recipiente estéril até o uso. <ol><li> Criar uma fase cirúrgica através da perfuração de um a cerca de 2 em por em um furo no centro de uma placa de cultura de 100 milímetros. Em seguida, use uma lixa para suavizarquaisquer arestas vivas e adicionar uma camada de cola de silicone para as bordas do furo para criar uma superfície elevada para os tecidos. </li><li> Alternativamente, projetar o estágio cirúrgico utilizando software CAD e fazer por 3-D de impressão (Figura 1). </li></ol></li><li> Coloque um resguardo absorvente estéril para baixo e estabelecer uma plataforma de plexiglass em cima dela. Coloque a cortina, sem um orifício pré-cortado, uma almofada aquecida ao longo do lado do resguardo absorvente. </li><li> Pré-aquecido estéril soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS), meios de comunicação e solução salina a 37 ° C. media de lugar e PBS em placas de cultura separados no topo da almofada de aquecimento e coloque soro fisiológico em um tubo de 50 mL cônico ao lado da configuração cirúrgico. </li><li> Certifique-se de todos os pacotes são abertos antes do início da cirurgia para garantir a manipulação estéril de todos os materiais. Uma lista completa das ferramentas comuns usados ​​neste procedimento são listados na Tabela de Materiais cirúrgicos específicos e ferramentas. </li></ol> 2. Mesentery colheita Tissue <ol><li> Use ratos Wistar machos adultos (350 ± 25 g; 6 - 8 semanas de idade). Outras tensões e as idades de ratos podem ser substituídos. </li><li> Anestesiar ratos por meio de uma injecção intramuscular de cetamina (80 mg / kg de peso corporal) e xilazina (8 mg / kg de peso corporal). Confirmar o rato está sob anestesia por beliscar entre os dedos para verificar se há uma resposta reflexa; não deve haver nenhum. analgesia preventiva para este procedimento terminal não é necessário. </li><li> Raspar a região abdominal e remover cabelo restante usando creme de depilação. Wipe pele abdominal duas vezes com álcool isopropílico a 70%, seguido de povidona-iodo. Para as toalhitas o cirurgião deve começar no centro do local cirúrgico e mover-se para o exterior da área preparada de uma maneira circular a fim de não se sobrepõem áreas que tenham sido previamente limpo com o mesmo pedaço de gaze estéril ou mecha de algodão estéril. Em seguida, transferir animal para a instalação cirúrgica esterilizada e coloque em cima da plat plexiglassFormato. </li><li> Usando uma lâmina de bisturi, fazer uma 0,75 em - 1,25 na incisão no intestino a partir de 1º de abaixo do esterno. Tenha cuidado para não perfurar o intestino ou mesentério (1 camada de pele, uma camada de tecido conjuntivo, e uma camada de músculo). </li><li> Coloque uma cortina com um buraco pré-cortada sobre a incisão e coloque um estágio cirúrgico esterilizado em cima da cortina. Assegurar as alinha abertura com a incisão. Use aplicadores com ponta de algodão estéreis para localizar e retirar o íleo através da abertura estágio cirúrgico. </li><li> Puxe 6 - 8 janelas mesentérica através do estágio usando aplicadores com ponta de algodão, e tenha cuidado para não tocar as janelas (Figura 1). Os tecidos são tipicamente colhidas a partir da região do ileo do intestino delgado começando perto do ceco. Mantenha tecidos expostos úmido com solução salina estéril aquecida, conforme necessário, utilizando uma seringa estéril para escorrer a solução. </li><li> Eutanásia do rato através de injecção intracardíaca de pentobarbital de sódio (0,2 mL por rato). Antes de retirar-mejanelas senteric, garantir o rato é sacrificado pela palpação do coração; não deve haver nenhum impulso. </li><li> Remover os tecidos mesentério desejados usando uma pinça para agarrar a almofada de gordura e uma tesoura fina para cortar a janela. Deixar uma fronteira de gordura (2 mm), em torno da janela. Lavar tecidos vez em aquecido PBS estéril e uma vez na mídia. </li><li> Voltar íleo exteriorizada para a cavidade abdominal e dispor de animais de acordo com as diretrizes institucionais. </li></ol> 3. Mesentery Cultura de Tecidos de Estudos de lapso de tempo <ol><li> Transferência de fontes autoclavados cultura (ver secção 1.1) e tecidos para uma capela de fluxo laminar estéril. </li><li> Use uma pinça para transferir cada tecido no topo de uma membrana filtro de policarbonato. tecidos garra pelas almofada de gordura para evitar danificar a vasculatura. </li><li> Rapidamente se espalhou o tecido usando a almofada de gordura, tomando cuidado para não tocar na janela. Inverta a inserção com o tecido para dentro da parte inferior de uma placa de 6 poços e cobrir com 3 ml de meio (Figura 1 </strong&gt;). meios típicos utilizados para este procedimento inclui mínima meio essencial (MEM) com 1% de Penicilina Estreptomicina (Penstrep) e 10% de Soro Fetal Bovino (FBS). Os meios podem ser suplementados com outros soros e / ou factores de crescimento para estimular a angiogénese. </li><li> Repita os passos de 3,2-3,3 para cada tecido e cultura em condições de incubadora padrão (5% de CO2, 37 ° C) durante até 5 dias. </li></ol> 4. Imagem Time-Lapse de Mesentery Tissue <ol><li> No dia da imagiologia, suplementar os meios em cada poço com conjugado BSI-LECTINA e incubar em condições padrão de cultura, durante 30 min. Lavar tecidos duas vezes com meio livre de lectina. BSI-LECTINA mancha permanecerá visível no tecido mesentério durante até 3 dias em cultura. </li><li> Transferir a placa para um estágio de microscópio. Identificar os vasos sanguíneos e linfáticos com base na sua morfologia e estrutura de rede. </li><li> Localize uma região de rede desejado em cada tecido e tomar imagens. Tome nota do imaginglocal para assegurar a mesma região será capturado para imagens subsequentes. Se estiver usando um palco motorizado, documentar as coordenadas. </li><li> Retorno tecidos para a incubadora e continuar a cultura até ponto final desejado. Repita os passos 4,1-4,3 conforme necessário dependendo pontos de tempo experimentais desejados. </li></ol> 5. Tissue imunomarcação <ol><li> BSI-lectina Labeling <ol><li> Incubar os tecidos durante 30 min a 37 ° C com 01:40 lectina conjugada com FITC em meios (2,5 ml solução de anticorpo por poço em placas de 6 poços) seguida de duas lavagens com meio. Para lavagens, adicionar mídia e substitua imediatamente. </li></ol></li><li> / Etiquetagem Morto Vivo <ol><li> Incubar os tecidos durante 10 min a 37 ° C com 1: 500 de etídio 2 mM homodímero-1 e 1: 500 calceína AM 1 mM em meio (2,5 ml solução de anticorpo por poço em placas de 6 poços) seguida de duas lavagens com meio. </li></ol></li><li> BSI-lectina / Etiquetagem NG2 <ol><li> tecidos espalhada sobre um microscópio deslizoue (1 - 2 tecidos / lâmina) e deixar secar. Retire o excesso de gordura com um bisturi, pressionando com firmeza para excisar a gordura. </li><li> Fix tecidos em metanol frio durante 30 min a -20 ° C. Lavar tecidos com PBS (3 x 10 min). </li><li> Para marcação com anticorpos primários incubar tecidos durante 1 h à temperatura ambiente com um anticorpo policlonal de NG2: 100 de coelho e soro de cabra normal a 5% (NGS). Lavar tecidos com PBS (3 x 10 min). </li><li> Para a marcação do anticorpo secundário tecidos incubar durante 1 h à temperatura ambiente com 1: 100 de cabra anti-coelho conjugado anticorpo-CY2 (GAR-CY2) e 5% de NGS. Lavar tecidos com PBS (3 x 10 min). </li><li> Incubar os tecidos durante 30 minutos à temperatura ambiente com lectina 01:40 conjugado com FITC em PBS seguido por duas lavagens com PBS. Para lavagens, adicione PBS e depois substituir imediatamente. </li><li> Para montar os slides, cobrir tecidos com 50:50 PBS e solução de glicerol e lugar lamela em cima. Selar as bordas de slide usando unha polonês. </li></ol></li><li> LYVE-1 / Etiquetagem PECAM<ol><li> Espalhe tecidos numa lâmina de microscópio (1 - 2 tecidos / lâmina) e deixa-se secar. Retire o excesso de gordura com um bisturi, pressionando com firmeza para excisar a gordura. </li><li> Fix tecidos em metanol frio durante 30 min a -20 ° C. Lavar tecidos com PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min). </li><li> Para marcação com anticorpos primários incubar tecidos durante 1 h à temperatura ambiente com 1: anticorpo CD31 monoclonal biotinilado 200 rato e 1: policlonal LYVE-1 anticorpo 100 de coelho em PBS + 0,1% de saponina + albumina de soro bovino a 2% (BSA) + 5% de NGS . Lavar tecidos com PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min). </li><li> Para a marcação do anticorpo secundário, tecidos incubar durante 1 h à temperatura ambiente com 1: 500 de anticorpo de estreptavidina conjugada com Cy3 e 1: 100 GAR-CY2 em PBS + 0,1% de saponina + 2% de BSA + 5% de NGS. Lavar tecidos com PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min). </li><li> Para montar slides, tecidos de cobertura com 50:50 solução PBS e glicerol e colocar uma lamela em cima. Selar as bordas de slide usando unha polonês. </li></ol></li><li> BrdU / BSI-lectina Labeling <ol><li> Adicionar 1 mg / mL BrdU aos meios de comunicação e substituir a mídia de tecido com uma solução de BrdU. Incubar durante 2 horas a 37 ° C. </li><li> Espalhe tecidos numa lâmina de microscópio (1 - 2 tecidos / lâmina) e deixa-se secar. Retire o excesso de gordura com um bisturi, pressionando com firmeza para excisar a gordura. </li><li> Fix tecidos em metanol frio durante 30 min a -20 ° C. Lavar tecidos com PBS (3 x 10 min). </li><li> Desnaturação de DNA de tecidos em HCl 2 M durante 1 h a 37 ° C. Lavar tecidos em PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min). </li><li> Para marcação com anticorpos primários, tecidos incubar durante 1 h à temperatura ambiente com 1: 100 monoclonal de ratinho anti-BrdU em PBS + 0,1% de saponina + 2% de BSA + 5% de NGS. Lavar tecidos com PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min). </li><li> Para a marcação do anticorpo secundário, tecidos incubar durante 1 h à temperatura ambiente com 1: 100 de anticorpo de cabra anti-rato Cy3-conjugado (GAM-Cy3) em PBS + 0,1% de saponina + 2% de BSA + 5% de NGS. Lavar tecidos com PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min). </li><li&gt; tecidos Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente com lectina 01:40 conjugado com FITC em PBS seguido por duas lavagens com PBS. </li><li> Para montar slides, tecidos de cobertura com 50:50 PBS e solução de glicerol e lugar lamela em cima. Selar as bordas de slide usando unha polonês. </li></ol></li><li> BSI-lectina / rotulagem CD11b <ol><li> Espalhe tecidos numa lâmina de microscópio (1 - 2 tecidos / lâmina) e deixa-se secar. Retire o excesso de gordura com um bisturi, pressionando com firmeza para excisar a gordura. </li><li> Fix tecidos em metanol frio durante 30 min a -20 ° C. Lavar tecidos com PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min). </li><li> Para marcação com anticorpos primários tecidos incubar durante 1 h à temperatura ambiente com 1: 100 de murganho anti-rato de CD11b em PBS + 0,1% de saponina + 2% de BSA + 5% de NGS. Lavar tecidos com PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min). </li><li> Para a marcação do anticorpo secundário tecidos incubar durante 1 h à temperatura ambiente com 1: 100 GAM-Cy3 em PBS + 0,1% de saponina + 2% de BSA + 5% de NGS. Lavar tecidos com PBS+ 0,1% de saponina (3 x 10 min). </li><li> Incubar os tecidos durante 30 minutos à temperatura ambiente com lectina 01:40 conjugado com FITC em PBS seguido por duas lavagens com PBS. </li><li> Para montar slides, tecidos de cobertura com 50:50 PBS e solução de glicerol e lugar lamela em cima. Selar as bordas de slide usando unha polonês. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in cancer and other diseases.</a> Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).</li>
<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+life%2C+disease+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li>
<li>Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+Regulation+of+Angiogenic+Sprouting+by+Biochemical+Factors+and+Wall+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress.</a> Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).</li>
<li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li>
<li>Song, J. W., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+forces+control+endothelial+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluid forces control endothelial sprouting.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).</li>
<li>Chan, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+in+vitro+3D+capillary+beds+by+self-directed+angiogenic+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting.</a> PLoS One. 7 (12), e50582(2012).</li>
<li>Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+experimental+and+computational+approaches+to+sprouting+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis.</a> Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).</li>
<li>Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+angiogenesis+model+for+investigating+multicellular+interactions+across+intact+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).</li>
<li>Azimi, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+model+for+anti-angiogenic+drug+testing+on+intact+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks.</a> PLoS One. 10 (3), e0119227(2015).</li>
<li>Nicosia, R. F., Ottinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+microvessels+in+serum-free+matrix+culture+of+rat+aorta.+A+quantitative+assay+of+angiogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro.</a> Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).</li>
<li>Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures+as+a+model+to+study+angiogenesis+of+brain+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 52(2015).</li>
<li>Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+retinal+explant+cultures+to+study+ex+vivo+tip+endothelial+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses.</a> Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).</li>
<li>Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+retinal+angiogenesis+reveals+decreased+development+and+progression+of+neovascular+sprouting+by+anecortave+desacetate%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16989723">In vivo models of angiogenesis.</a> J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).</li>
<li>Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+islands+during+microvascular+regression+and+regrowth+in+adult+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks.</a> Front Physiol. 4, 108(2013).</li>
<li>Kelly-Goss, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+along+vascular+islands+during+microvascular+network+growth%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth.</a> BMC Physiol. 12, 7(2012).</li>
<li>Skalak, T. C., Price, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mechanical+stresses+in+microvascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">The role of mechanical stresses in microvascular remodeling.</a> Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).</li>
<li>Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+types+of+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+proliferation+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival.</a> J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).</li>
<li>Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+shear+stress%2C+angiogenesis%2C+and+VEGF+in+skeletal+muscles+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo.</a> Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).</li>
<li>Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+An+Inflammatory+Link+Between+Angiogenesis+and+Lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis.</a> Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este protocolo documenta um método para usar o modelo de cultura de mesentério de rato como uma ferramenta ex vivo para geração de imagens de lapso de tempo de crescimento da rede microvascular. Trabalhos anteriores em nosso laboratório estabeleceu a utilização do nosso modelo para 1) angiogênese 8, 2) lymphangiogenesis 8, 3) interações celulares pericyte-endotelial 8 e 4) teste de drogas anti-angiogênico 9. A capaci...

O crescimento da rede microvascular e remodelação são denominadores comuns para a função do tecido, cicatrização de feridas, e patologias múltiplas e um processo chave é a angiogénese, definido como o crescimento de novos vasos sanguíneos a partir dos existentes 1, 2. Para Engenharia de Tecidos novos navios ou projetar terapias baseadas angiogénicos, compreendendo a importância da dinâmica celulares envolvidos na angiogênese é crítica. No entanto, este processo é complexo. Ela pode variar em locais específicos dentro de uma rede microvascular e envolve vários tipos de células (isto é, células endoteliais, células musculares lisas, pericitos, macrófagos, as células estaminais) e múltiplos sistemas (redes linfáticas e redes neurais). Embora os modelos in vitro têm contribuído enormemente para examinar a relação entre diferentes células envolvidas na angiogênese 3, a sua relevância fisiológica pode ser prejudicada devido à thei<html> r complexidade limitada eo fato de que eles não refletem de perto um cenário in vivo. Para superar estas limitações, os sistemas de cultura tridimensionais 3, ex vivo modelos de tecido 4, sistemas de microfluidos 5, 6, 7 e modelos computacionais foram desenvolvidos e introduzidos nos últimos anos. No entanto, ainda existe uma necessidade para um modelo com capacidade de lapso de tempo para investigar a angiogénese em redes microvasculares intactas ex vivo. A criação de novos modelos de lapso de tempo para estudos de angiogênese com esse nível de complexidade irá fornecer uma ferramenta inestimável para compreender os mecanismos subjacentes que regulam a angiogênese e para melhorar terapias. Um modelo de potencial que permite a investigação ex vivo da angiogênese através de uma rede microvascular intacta é o modelo de cultura de mesentério de rato&gt; 8. Em trabalho recente, temos demonstrado que o sangue e redes microvasculares linfáticos permanecer viável após o cultivo. Mais importante, o modelo de cultura de mesentério de rato pode ser usado para investigar as interações funcionais pericyte-endotelial de células, sangue e conexões das células endoteliais linfáticas e de imagem time-lapse. O objetivo deste trabalho é fornecer nosso protocolo para o método de imagem time-lapse. Os resultados representativos documentar os vários tipos de células que permanecem viáveis ​​após a estimulação de angiogénese com soro e oferecem exemplos da utilização deste método para a quantificação de respostas angiogénicas específicas dos tecidos, bem como estudos de acompanhamento de células endoteliais.

<table><tbody><tr><td>Drape</td><td>Cardinal Health</td><td>4012</td><td>12" x 12" Cabo de Bisturi de Esterilização Regular Bio-Shield</td></tr><tr><td></td><td>Roboz Instrumento Cirúrgico</td><td>RS-9843 Cabo de</td><td>Bisturi, #3; Sólido; Lâmina</td></tr><tr><td>Cirúrgica Estéril</td> de 4" de Comprimento <td>Cincinnati Surgical</td><td>0110</td><td>Aço Inoxidável; Prato de Cultura Tamanho 10</td></tr><tr><td>(60 mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>130181</td><td>10/Sleeve</td></tr><tr><td>Graefe Forcep (pinças curvas)</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5135</td><td>Micro Dissecting Forceps; Serrilhada; Ligeira curva; Largura da ponta de 0,8 mm; </td></tr><tr><td>Pinça Graefe de 4" de Comprimento (pinças retas)</td> Pinça Micro Dissecante <td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5130</td><td>; Serrilhado, Reto; Largura da ponta de 0,8 mm; Tesoura</td></tr><tr><td>Micro Noyes</td> de 4" de Comprimento <td>Roboz Instrumento Cirúrgico</td><td>RS-5677</td><td>Tesoura de Mola Micro Dissecadora Noyes; Pontas retas, pontiagudas-rombas; Borda de corte de 13 mm; Largura da ponta de 0,25 mm, 4 1/2" Comprimento total</td></tr><tr><td>Almofadas de gaze</td><td>FisherBrand</td><td>13-761-52</td><td>Esponjas de gaze de algodão não estéreis; 4" x 4" Aplicadores</td></tr><tr><td>de algodão com pontas de</td> 12 camadas <td>FisherBrand</td><td>23-400-124</td><td>6" de comprimento; Eixo de madeira; </td></tr><tr><td>Placa de Uso Único de 6 Poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-49</td><td>Fundo Plano com Tampa de Baixa Evaporação; Polistireno; Seringa Estéril Não Pirogênica</td></tr><tr><td>5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td> Tigela Estéril com <td>Ponta Luer-Lok</td></tr><tr><td>Medical</td><td>Action Industries Inc.</td><td>01232</td><td>32 oz. Bolsa Peel; Azul; </td></tr><tr><td>Inserções de placa de 6 poços estéreis de uso único (inserções CellCrown)</td>Inserções de placa de 6 poços <td>SIGMA</td><td>Z681792-3EA</td><td>; Membrana de filtro de</td></tr><tr><td>policarbonato</td> não estéril <td>SIGMA</td><td>TMTP04700</td><td>Filtro de membrana de isoporos; Policarbonato; Hidrófilo; 5.0&nbsp; &micro; m, 47&nbsp; mm, White Plain</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários/Descrição</td></tr><tr><td>Beutanásia</td><td>Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Encomendado da MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 011168</td><td>Ingrediente Ativo: Por 100 mL, 390 mg de pentobarbital sódico, 50 mg de fenitoína sódica&nbsp;</td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Fort Dodge Saúde Animal (Encomendado da MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 000680</td><td>Kateset 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>LLOYD. Inc. (Encomendado da MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 000680</td><td>Analisado 100 mg/mL</td></tr><tr><td>de solução salina</td><td>Baxter</td><td>2F7122</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11095080</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Saponina&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>S7900-100G</td><td></td></tr><tr><td>Álcool isopropílico</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25372</td><td></td></tr><tr><td>Operando de iodo-povidona</td><td></td><td>82-226</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>SIGMA</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Conjugado com FITC Lectina</td><td>SIGMA</td><td>L9381-2MG</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NG2 Condroitina Sulfato Proteoglicano Anticorpo</td><td>SIGMA</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31) Anticorpo</td><td>BD Biosciences</td><td>555026</td><td></td></tr><tr><td>LYVE-1 Anticorpo</td><td>AngioBio Co.</td><td>11-034</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo conjugado com Cy2 de cabra</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-585-144</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo conjugado com Cy3 de cabra anti-camundongo</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-227-003</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo conjugado com estreptavidina Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-160-084</td><td></td></tr><tr><td>Kit de viabilidade/citotoxicidade viva/morta</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Cabra Normal</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2'-Deoxyuridine</td><td>SIGMA</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxiuridina&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Clone Bu20a</td><td>Dako</td><td>M074401-8</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-Rato CD11b&nbsp;</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA275R</td><td></td></tr></tbody></table>

a<em&gt; ex vivo</em&gt; método for imaging time-lapse of cultivadas rato mesentéricas microvasculares networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

A angiogénese, definido como o crescimento de novos vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes, envolve células endoteliais, pericitos, células musculares lisas, células do sistema imunológico, bem como a coordenação com vasos linfáticos e nervos. A multi-celular, as interacções multi-sistema exige a investigação de angiogénese num ambiente fisiologicamente relevante. Assim, enquanto o uso de modelos de cultura celular in vitro proporcionaram conhecimentos mecanicistas, uma crítica comum é que eles não recapitular a complexidade associada com uma rede microvascular. O objetivo deste protocolo é o de demonstrar a capacidade de fazer comparações de lapso de tempo de redes microvasculares intactas antes e após a estimulação da angiogénese em tecidos mesentério de rato cultivadas. tecidos cultivados contêm redes microvasculares que mantêm a sua hierarquia. imunohistoquímica confirma a presença de células endoteliais, células musculares lisas, pericitos, vasos sanguíneos e vasos linfáticos. Em umddition, rotulando tecidos com BSI-lectina permite a comparação de lapso de tempo de regiões de rede local antes e após a estimulação fator de soro ou crescimento caracterizada pelo aumento da germinação capilar e densidade de vasos. Em comparação com os modelos de cultura de células comuns, este método proporciona uma ferramenta para estudos de linhagens de células endoteliais e avaliação de medicamentos angiogénica do tecido específico em redes microvasculares fisiologicamente relevantes.

Após 3 dias em cultura, os tecidos foram marcados com um kit de viabilidade / citotoxicidade Live / morto para demonstrar a viabilidade da microcirculação no mesentério de ratos modelo de cultura (Figura 2A). A maioria das células presentes no mesentério permaneceram viáveis ​​na cultura em que as células endoteliais foram identificados com base na sua localização em segmentos microvasculares. Proliferação de células endoteliais foi também confirmada por marcação lectina...

A angiogênese envolve interações multicelulares e multissistêmicas que precisam ser investigadas em um ambiente fisiologicamente relevante. O objetivo deste estudo é demonstrar a capacidade do modelo de cultura de mesentério de rato em fazer comparações de lapso de tempo de redes microvasculares intactas durante a angiogênese.

A<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Método for Imaging Time-Lapse of cultivadas Rato Mesentéricas microvasculares Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

O objetivo geral deste experimento é demonstrar o uso do modelo de cultura de mesent&eacute;rio de rato para a investiga&ccedil;&atilde;o, por meio de imagens de longa dura&ccedil;&atilde;o, da reorganiza&ccedil;&atilde;o de redes microvasculares ex vivo, a fim de avaliar intera&ccedil;&otilde;es entre parasitas e c&eacute;lulas endoteliais, conex&otilde;es entre c&eacute;lulas endoteliais sangu&iacute;neas e linf&aacute;ticas, ou os efeitos de f&aacute;rmacos antiangiog&ecirc;nicos. Este m&eacute;todo pode ajudar a responder perguntas fundamentais na &aacute;rea da remodela&ccedil;&atilde;o microvascular, como, por exemplo, como os microvasos sabem para onde crescer e qual &eacute; o destino dos segmentos de c&eacute;lulas endoteliais. A principal vantagem desta t&eacute;cnica &eacute; que redes microvasculares reais e intactas podem ser visualizadas antes e ap&oacute;s o crescimento ex vivo.Demonstrará o procedimento Sadegh Azimi, um estudante de pós-graduação em nosso laboratório que desenvolveu o método. Comece colocando uma plataforma de plexiglass esterilizada com etanol sobre uma almofada absorvente estéril e, sobre a plataforma, uma rata macho adulta anestesiada. Desinfete a região abdominal depilada da rata com dois lenços de álcool isopropílico a 70%, seguidos por poviodine-iodo.A partir de um centímetro abaixo do esterno, use um bisturi para fazer uma incisão de aproximadamente dois a três centímetros no intestino, atravessando a pele, o tecido conjuntivo e o músculo. Em seguida, posicione um campo cirúrgico com um orifício pré-cortado sobre o animal e coloque um suporte cirúrgico sobre o campo, tomando cuidado para alinhar os orifícios dos dois materiais com a incisão. Usando aplicadores estéreis com ponta de algodão, puxe o íleo através da abertura do suporte cirúrgico, juntamente com seis a oito janelas mesentéricas.Use uma seringa estéril para gotejar solução salina estéril a 37 graus Celsius sobre os tecidos expostos conforme necessário. Quando todas as janelas tiverem sido externalizadas, use pin&ccedil;as para segurar uma bolsa de gordura e tesouras para colher as janelas, deixando uma borda de gordura de dois mil&iacute;metros ao redor de cada tecido mesent&eacute;rico. Tenha cuidado para que as pin&ccedil;as n&atilde;o toquem nas janelas mesent&eacute;ricas, tocando apenas nas bordas de gordura circundantes.Lave cada janela uma vez com PBS a 37 graus Celsius e uma vez com meio a 37 graus Celsius conforme for coletando. Devolva o íleo à cavidade abdominal após o isolamento de todas as janelas. Em uma cabine de fluxo laminar estéril, use pinças para transferir cada tecido mesentérico pela borda adiposa para a membrana de filtro de policarbonato de um inserto de placa de cultura celular.Use o disco de gordura para espalhar rapidamente as amostras de tecido, tomando cuidado para não tocar nas janelas. Em seguida, inverta o inserto e coloque-o em um poço de uma placa de seis poços, de modo que o tecido fique plano no fundo do poço. Cubra o tecido com três milímetros de meio e transfira as janelas restantes para a placa da mesma maneira.Em seguida, cultive as janelas do mesent&eacute;rio em condi&ccedil;&otilde;es padr&atilde;o de incubadora de cultura de tecidos por at&eacute; cinco dias. No dia da aquisi&ccedil;&atilde;o de imagens, suplemente as culturas com lectina BSI conjugada e retorne a placa &agrave; incubadora. Ap&oacute;s 30 minutos, lave as amostras duas vezes com meio livre de lectina e transfira a placa para a platina de um microsc&oacute;pio fluorescente.Identifique os vasos sanguíneos e linfáticos com base em sua morfologia e estruturas em rede. Em seguida, localize uma região de interesse na rede de cada tecido para obter imagens, anotando a localização para garantir que a mesma região seja capturada nas imagens subsequentes. Quando todas as imagens tiverem sido obtidas, devolva as amostras ao incubador até a próxima sessão de imageamento ou até o ponto final experimental apropriado.Após três dias em cultura, a maioria das células presentes no mesentério é viável, com a presença de células endoteliais confirmada por sua localização nos segmentos microvasculares. A proliferação de células endoteliais também pode ser confirmada pela marcação com lectina/BrdU, enquanto a presença de células musculares lisas e parasitas ao longo dos vasos pode ser confirmada com marcação NG2. A marcação da rede microvascular linfática e sanguínea ramificada confirma ainda a manutenção do fenótipo de células linfáticas no tecido cultivado.A suplementação do meio de cultura de tecido da janela mesentérica com soro a 10% por três dias induz uma resposta angiogênica robusta, com novos segmentos de vasos e brotos capilares identificados após cinco dias de estimulação. A imagem em intervalos permite a quantificação do número de vasos por área vascular e do número de brotos capilares por área vascular a partir de uma única imagem de quatro vezes por tecido. Comparações em sequência temporal de regiões da rede também permitem o rastreamento de segmentos de células endoteliais e a identificação de padrões incorretos em vasos sanguíneos e linfáticos.Além disso, a marcação com lectina e Cd11b confirma adicionalmente a presença de macrófagos residentes intersticiais nas redes em remodelação. Uma vez dominada, esta técnica deve ser capaz de ser concluída em menos de quatro horas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como colher, cultivar e obter imagens com lapso de tempo de tecidos mesentéricos de rato.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Um novo método versátil para a observação da microcirculação é apresentado. Ele é considerado adequado para observação a longo prazo, e para combinação com pharmacophysiological ou molecular intervenções biológicas.

Medição in vivo Micro-circulação no músculo esquelético por Intra-vital Microscopia

Adulto normal tecido vascularizado mamíferos que carece de angiogênese fisiológica e que não tenha sido exposto a uma intervenção cirúrgica é usado para estudar: (i) o início e desenvolvimento da angiogênese após a administração intraperitoneal de agentes de teste, e (ii) a modificação da angiogênese após a administração sistêmica de selecionados agentes de teste.

Rat Assay Angiogenesis Mesentery

Este artigo descreve um modelo simples para estimular a angiogênese no mesentério de ratos. O modelo produz aumentos dramáticos na capilar germinação área, vascular e da densidade vascular ao longo de um curso de tempo relativamente curto em um tecido que permite a visualização en face de todo redes microvasculares para baixo para o nível da célula individual.

Exteriorização Rat Mesentério: Um modelo para investigar a dinâmica celulares envolvidos na angiogênese

A função das células vasculares depende da atividade dos mensageiros intracelulares.  Descrito aqui é um método de imagem ex vivo de dois fótons que permite a medição dos níveis intracelulares de cálcio e óxido nítrico em resposta a estímulos fisiológicos e farmacológicos em células endoteliais e musculares lisas individuais de uma aorta isolada.

Dois fótons de imagem de cálcio intracelular<sup&gt; 2+</sup&gt; Manuseio e produção de óxido nítrico no endotélio e músculo liso células de uma aorta de rato isolada

A técnica de Landis modificada permite a medição pareada da condutividade hidráulica de microvasos individuais no mesentério de ratos normais e geneticamente modificados sob condições de controle e teste usando técnicas de microperfusão. Ele fornece um método conveniente para avaliar os mecanismos que regulam a permeabilidade dos microvasos e a troca transvascular em condições fisiológicas.

Microperf Técnica para Investigar Regulamento de microvasos Permeabilidade de Rat Mesentery

Detalhamos um protocolo para monitorar o comportamento de neutrófilos e monócitos em veias mesentéricas em estado estacionário e condições inflamatórias usando microscopia confocal intravital em camundongos anestesiados.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Este protocolo descreve a intravital imagem de ratos transgênicos expressando marcadores fluorescentes específicos de célula. Intravital imagem fornece um método não-invasivo para observações de alta resolução em animais vivos usando windows implantáveis, através do qual a visualização microscópica de processos é possível. Este método é especialmente útil para estudar processos longitudinais.

A microscopia intravital da vasculatura Tumor-associado usando avançada Dorsal câmaras de janela dobras cutâneas em ratos transgênicos fluorescentes

Este manuscrito descreve em vitro protocolos de vídeo microscopia para avaliar a função vascular nas artérias de resistência cerebral de rato. O manuscrito também descreve técnicas para avaliar a densidade de microvessel com perfusão de lectina e tecido fluorescente etiquetada usando Laser Doppler Flowmetry.

Avaliação dos mecanismos de controlo Vascular utilizando a microscopia das artérias de resistência isolada de ratos

Apresentado aqui é um protocolo para estudar a microcirculação coronária no tecido cardíaco murino vivo por ex vivo monitoramento da pressão e fluxo de perfusão arterial que mantém a pressão, bem como componentes de árvores vasculares, incluindo os leitos capilares e pericitos, já que a artéria septal é canulada e pressurizada.

Medição dinâmica e imagem de capilares, arterioles e pericias em coração de rato

No presente protocolo, a função de barreira endotelial da glândula submandibular (SMG) foi avaliada por meio da injeção de diferentes marcadores fluorescentes de peso molecular nas veias angulares de modelos animais de teste in vivo sob um microscópio de varredura a laser de dois fótons.

In vivo Detecção de Permeabilidade Vascular em Glândula Submandibular de Camundongo

Este protocolo apresenta um método para induzir lesão de isquemia-reperfusão mesentérica e visualizar armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs) em vênulas mesentéricas usando microscopia intravital. O fluxo sanguíneo na artéria mesentérica superior foi restrito por 1 h, seguido de reperfusão, permitindo a quantificação direta da adesão leucocitária e da NETose.

Visualização de armadilhas extracelulares de neutrófilos em vênulas mesentéricas após lesão de isquemia-reperfusão mesentérica por microscopia intravital

Aprenda a utilizar o modelo de cultura de mesentério de rato para imagens time-lapse de redes microvasculares ex vivo. Este método permite avaliar interações de células endoteliais e efeitos de drogas anti-angiogênicas em ambiente fisiologicamente relevante.

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