Preparação e Avaliação de ^99m Tc-rotulados tridentadas Quelatos de Pré-alvo Usando Bioorthogonal Química

O objetivo geral deste procedimento é produzir tetrazinas marcadas com tecnécio-99m para imagens pré-direcionadas usando química bio-ortogonal com biomoléculas modificadas com transcicloocteno como vetores direcionados. Este método fornece uma nova plataforma importante para o desenvolvimento de novos produtos farmacêuticos de rádio. Por meio do pré-direcionamento, os complexos de tecnécio descritos aqui podem ser usados para obter imagens de uma ampla gama de órgãos, tecidos e biomarcadores.

Essa técnica é vantajosa, pois fornece um método passo a passo robusto para produzir tetrazinas marcadas com tecnécio-99m, o isótopo médico mais amplamente utilizado na medicina diagnóstica. Essa técnica pode ser usada com diferentes vetores de direcionamento, incluindo pequenas moléculas e anticorpos. Também pode ser usado para radioterapia trocando tecnécio por isótopos emissores beta de rênio.

Demonstrando parte dos procedimentos com animais estará Nancy Janzen, técnica de biologia em nosso laboratório. Para iniciar o procedimento de radiomarcação, em um frasco de micro-ondas, combine oito miligramas de boranocabonato de potássio, 15 miligramas de carbonato de sódio, 20 miligramas de tetraborato de sódio decahidratado e 25 miligramas de tartarato de sódio e potássio tetrahidratado. Purgue o frasco com gás argônio por 10 minutos.

Em seguida, adicione quatro mililitros de pertecnetato de tecnécio-99m em solução salina a 0,9% com uma atividade de 1.110 megabecquerels ao frasco. Coloque a mistura de reação em um reator de micro-ondas e mexa por 10 segundos. Em seguida, aqueça a mistura a 110 graus Celsius por 3,5 minutos para obter o cátion triaqua tricarboniltecnécio-99m.

Adicione cerca de 400 microlitros de ácido clorídrico molar para ajustar o pH da solução para 3,5 a quatro. Em seguida, para cada ligante de tetrazina, dissolva dois miligramas de ligante em 250 microlitros de metanol. Adicione 250 microlitros do complexo tecnécio-99m com uma atividade de 74 megabecquerels a cada solução de ligante.

Aqueça a mistura em um reator de micro-ondas a 60 graus Celsius por 20 minutos. Para ligantes de tetrazina com grupos protetores de t-butila, transfira a solução de um frasco de micro-ondas para um frasco de cintilação de 20 mililitros e, em seguida, evapore o solvente e dissolva novamente cada complexo em um mililitro de uma solução de um para um por volume de diclorometano e ácido trifluoroacético. Em seguida, transfira a solução para um frasco de micro-ondas e aqueça esses complexos em um reator de micro-ondas a 60 graus Celsius por seis a 10 minutos para desproteger os ligantes.

Resfrie os complexos à temperatura ambiente e, em seguida, evapore o solvente. Dissolva novamente os resíduos em 500 microlitros de uma solução aquosa um-para-um de acetonitrila ou metanol e água antes de prosseguir para a purificação por HPLC. Use HPLC de fase reversa C18 para purificar cada complexo de tetrazina marcado com rádio com um gradiente de eluição de 30 a 70 a 40 a 60 acetonitrila para água durante 20 minutos com ácido trifluoroacético a 0,1% presente no eluente por toda parte.

Colete o produto purificado quando mostrado iludindo no traço gama. Em seguida, co-injete cada complexo marcado com uma solução de 0,125 miligramas do complexo rádio-tetrazina correspondente em 20% de metanol em água. Compare os tempos de retenção do pico do complexo de rênio no traço UV e do pico do complexo de tecnécio no traço gama para verificar a identidade do pico gama.

Remova o solvente de cada complexo de tecnécio-tetrazina purificado. Formular cada complexo a uma concentração de 7,4 kilobecquerels por microlitro em solução salina tamponada com fosfato com 0,5% de albumina de soro bovino e 0,01% de polissorbato 80. Para cada sujeito de camundongo, coloque em uma seringa 100 microlitros de uma solução de cinco microgramas por microlitro do derivado TCOPB em solução salina para preparar uma dose de 20 miligramas por quilograma.

Conecte uma agulha de calibre 30 à seringa dosadora. Coloque o assunto do mouse em um dispositivo de contenção física. Identifique as veias na superfície lateral da cauda a aproximadamente dois centímetros da extremidade da cauda e limpe a área com um cotonete embebido em álcool.

Insira a agulha da seringa em um ângulo raso paralelo à veia. Injete lentamente o derivado TCOBP. Remova a agulha e aplique uma esponja de gaze limpa com leve pressão no local da injeção até que o sangramento pare.

Uma hora após a injeção do derivado TCOBP, administrar uma dose de 100 microlitros do complexo de tetrazina tecnécio-99m desejado com uma atividade de aproximadamente 0,74 megabecquerel por injeção na veia da cauda. Use um calibrador de dose para medir a atividade de uma amostra de teste de 100 microlitros do complexo de tecnécio no momento da injeção. Guarde a amostra de teste para medições posteriores.

Anestesiar o camundongo com uma mistura de isoflurano a 3% e gás oxigênio a 2% seis horas após a injeção. Coloque o camundongo de costas com o nariz no cone do nariz para anestesia contínua e localize o processo xifóide. Conecte uma agulha de calibre 25 a uma seringa pré-tratada com heparina.

Insira a agulha em um ângulo de 20 graus sob o processo xifóide, ligeiramente à esquerda da linha média. Assim que a agulha estiver totalmente inserida, retire lentamente o êmbolo para verificar se há sangue no cubo da agulha, confirmando uma punção cardíaca bem-sucedida. Reajuste a agulha conforme necessário.

Depois que o coração for perfurado, puxe lentamente um mililitro de sangue para a seringa. Transfira a amostra de sangue para um tubo de contagem pré-pesado. Eutanásia do camundongo por luxação cervical enquanto estiver sob anestesia.

Coloque o animal sacrificado em um saco plástico e meça toda a atividade corporal com um calibrador de dose. Em seguida, colete os ossos do joelho e do ombro, a vesícula biliar, os rins, o fígado, a tireoide e a traqueia e a cauda. Junto com seu conteúdo, colete o estômago, o intestino delgado, o intestino grosso e o ceco e a bexiga urinária.

Enxágue o sangue de todos os tecidos coletados, exceto a vesícula biliar e a bexiga urinária, em solução salina tamponada com fosfato. Seque os tecidos e coloque cada tecido em um tubo de contagem pré-pesado. Meça a atividade residual da carcaça.

Pese cada amostra de tecido e calcule a massa do tecido sozinho. Utilizar um contador gama multidetectores para medir a actividade de uma alíquota de cinco microlitros da amostra de ensaio do complexo de tecnécio. Utilizando o valor obtido em contagens por minuto e a atividade medida no momento da injeção, calcule um fator de conversão.

Meça a atividade de cada amostra de tecido e fluido com o detector gama. Converta os valores em microcurie e normalize cada valor pelo peso do órgão para determinar a porcentagem injetada por grama de tecido. Repita este processo com camundongos adicionais sem a injeção do derivado TCOPB como uma série de controle negativo.

Usando este método, cinco complexos de tetrazina diferindo em suas combinações de ligante e líder-chave foram marcados com tecnécio-99m. Um derivado de TCOPB, que se localiza em regiões de alta renovação de cálcio no osso, foi usado para pré-direcionar as articulações do ombro e joelho de camundongos. As proporções da dose percentual injetada por grama de tecido para osso e sangue foram calculadas para cada composto de tetrazina.

Todos os cinco compostos limparam o sangue rapidamente e atingiram o osso, indicando que a reação de acoplamento bio-ortogonal seletivo entre os compostos de tetrazina e o derivado TCOBP ocorreu in vivo. O composto três mostrou a melhor combinação de direcionamento e depuração do sangue. Experimentos de controle negativo indicaram que os complexos de tetrazina marcados com rádio não se localizaram significativamente no osso na ausência do derivado TCOBP.

Por exemplo, quando o derivado TCOBP não foi administrado, o composto dois apresentou altos níveis na vesícula biliar e nos intestinos, mas muito pouco no osso. Ampla variação foi observada na localização do tecido em camundongos que receberam o derivado TCOBP entre os cinco compostos testados. Por exemplo, muito pouco do composto três foi visto no intestino grosso, fígado ou urina e bexiga em comparação com outros complexos, enquanto muito mais do composto três foi visto no osso.

Uma vez dominada, a técnica de rotulagem descrita aqui pode ser executada do início ao fim em menos de duas horas, se executada corretamente. Ao tentar essa técnica, é importante garantir que todos os reagentes sejam pesados com precisão e que os sais sejam purgados com argônio antes da adição à solução de tecnécio. Também é fundamental que o pH da solução de tecnécio seja ajustado para 3,5 a quatro antes da adição do ligante de tetrazina.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como preparar e purificar tetrazinas marcadas com tecnécio e como elas podem ser usadas para criar novos produtos farmacêuticos de rádio usando pré-direcionamento e química bio-ortogonal. Não se esqueça de tomar as devidas precauções ao trabalhar com radioatividade, como entender o tipo de radiação emitida e a melhor forma de proteger e manusear as amostras.