Name: Preparação e Avaliação de 99m Tc-rotulados tridentadas Quelatos de Pré-alvo Usando Bioorthogonal Química (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Aprenda a radiomarcar tetrazinas com tecnécio-99m para imagem pré-alvo usando química bioortogonal. Este método permite visualizar órgãos e tecidos com alta especificidade em aplicações radiofarmacêuticas.

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Este trabalho é apoiado por financiamento de bolsas de pesquisa do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia (NSERC) do Canadá, do Instituto de Pesquisa do Câncer de Ontário (OICR, #P.SI.015.8) e da Sociedade Canadense do Câncer (CCS, # 703857). Os autores agradecem as contribuições do Dr. Denis Snider, que prestou assistência na preparação do manuscrito.

Os estudos em animais foram aprovados pelo Conselho de Ética em Pesquisa Animal da Universidade McMaster, em conformidade com a Canadian Council on Animal Care (CCAC) orientações. 1. A radiomarcação de ligandos TZ-tridentados com 99m Tc CUIDADO: Os seguintes procedimentos requerem o uso de compostos radioactivos. O trabalho só deve ser feito em um laboratório licenciado com a adesão a normas de segurança e eliminação. reacções de micro-ondas deve ser realizada num forno de microondas especificamente concebido para a síntese química. <ol><li> Síntese de [99mTc (CO) 3 (H 2 O) 3] + 19, 20 <ol><li> Em um frasco de microondas, combinar 8 mg de K 2 [BH 3 CO 2], 15 mg de Na 2 CO 3, 20 mg de Na 2 B 4 O 7 · 10H 2 O e 25 mg KOCO [CH (OH)]2 COONa · 4H 2 O. Purge o frasco durante 10 min com gás argônio. </li><li> Adicionar 4 ml de 99m TcO ~ 4 - (1.100 MBq, ~ 30 mCi) em 0,9% de solução salina para o frasco. </li><li> Aquece-se a reacção num micro-ondas durante 3,5 minutos a 110 ° C, após 10 s de agitação para garantir uma mistura completa dos reagentes. </li><li> Ajuste o pH da solução para 3,5-4 com ~ 400 mL de HCl 1M. Verifique utilizando papel de pH. </li></ol></li><li> Radiomarcação de tetrazina ligantes 1-5 <ol><li> Dissolve-se 2 mg de cada ligando (compostos 1-5) em 250 mL de MeOH 21. </li><li> Adicionar 250 uL de [99mTc (CO) 3 (H 2 O) 3] + (~ 74 MBq, ~ 2 mCi) a cada solução. </li><li> Aquece-se a mistura de reacção utilizando um forno de microondas durante 20 min a 60 ° C. NOTA: Este passo foi idêntico para todos os 5 tetrazinas. </li><li> Para os compostos 2 a 5, evapora-se o solvente e re-dissolve os produtos resultantes em 1 mL de 1: v / v 1 DCM: TFA. </li><li> Aquecer os produtos de reacção dissolvidos (2-5) a 60 ° C em um micro-ondas durante 6 min (2-4) ou 10 min (5). </li><li> Após arrefecimento até à temperatura ambiente, evapora-se o solvente usando um evaporador (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6000 rpm) e dissolve-se o composto seco em 1: 1 de ACN: H 2 O ou 1: 1 de MeOH: H2O, antes da purificação por HPLC. </li><li> Purifica-se os compostos marcado com 99m Tc (1-5), incluindo a separação do produto marcado do ligando não marcado tetrazina, utilizando HPLC (C 18 de fase inversa). Tipicamente, usar um gradiente de eluição de 30:70 ACN: H 2 O (ambos com 0,1% de TFA) a 40:60 ACN: H2O ao longo de 20 min (18 min) e uma coluna analítica C 18 4,6 x 100 mm. Use tanto UV (254 nm) e detecção gama. <ol><li> Aqui uma pequena amostra de cada produto marcado e comparar o seu tempo de retenção HPLC para o de um co-injected, não radioactiva, marcada com Re padrão (0,125 mg em 20% de metanol-H2O). O padrão marcado com Re é identificada no rastreio de UV HPLC, e eluir, ao mesmo tempo que o composto 99m Tc-rotulada no rastreio γ-HPLC. Esta co-injecção mostra picos em tempos de retenção semelhantes, o que confirma a identidade do composto de 99m Tc-rotulados. </li></ol></li><li> Evapora-se o solvente a partir das fracções de HPLC utilizando um evaporador (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6000 rpm). </li><li> Formular o composto purificado, a uma concentração de 7,4 kBq / mL em PBS, contendo BSA a 0,5% e 0,01% de Tween-80. </li><li> Para garantir os compostos marcados são estáveis, realizar um estudo de estabilidade in vitro. Incubar o composto formulado a 37 ° C durante 1, 4 e 6 h, injectando uma pequena quantidade (3,7 MBq) da mistura em HPLC em cada ponto de tempo para avaliar a estabilidade. </li></ol></li></ol> 2. Estudos Bio-distribuição Pré-alvo <ol><li&gt; Preparação de animais <ol><li> Utilizando ratos fêmeas de 7-9 semanas de idade, ratinhos Balb / c (n = 3), administrar TCO-BP formulado em solução salina (20 mg / kg) (5 mg / mL), por via de injecção na veia da cauda-. </li><li> Coloque o mouse no dispositivo de contenção física, e identificar as veias localizadas nas superfícies laterais da cauda e limpe com um algodão embebido em álcool. Em cerca de 2 cm da extremidade da cauda, ​​inserir uma agulha de calibre 30 a um ângulo raso, paralelo à veia. Lentamente pressionar o êmbolo para injetar, remova a agulha e aplicar gaze limpa no local da injecção com uma ligeira pressão até o sangramento parar. </li><li> A 1 h após a injecção de TCO-BP, administrar ~ 0,74 MBq (20 uCi) de 99m Tc-tetrazina formulados em 100 ul de 0,5% de BSA, 0,01% de Tween-80 em PBS, através de injecção na veia da cauda. </li></ol></li><li> Estudos biológicos e de distribuição <ol><li> No ponto de tempo desejado (t = 6 H), anestesiar os ratos utilizando 3% de isoflurano e mistura gasosa de oxigénio de 2%. Demonstrar uma parae pitada retirada no rato anestesiado para garantir que eles estão em plano cirúrgico de anestesia. </li><li> Recolha de sangue (1 mL) através de punção cardíaca utilizando uma seringa pré-tratada com heparina. Colocar o mouse sobre as suas costas com o nariz no cone do nariz para anestesia continuou e localizar o apêndice xifóide no animal. <ol><li> Inserir uma agulha G 25, ligeiramente à esquerda da linha média do animal no âmbito do processo xifóide, em um ângulo de 20 °. Totalmente inserir a agulha, e, lentamente, puxar o êmbolo para ver sangue no centro da agulha se o coração foi perfurado. Ligeiramente reajustar a agulha, mantendo o êmbolo, se necessário, para perfurar o coração. Lentamente extrair o sangue para dentro da seringa. </li></ol></li><li> Eutanásia do animal por deslocamento cervical, sob anestesia. </li><li> Coloque cada animal em um saco plástico e usar um calibrador de dose (configuração Tc 99m) para medir todo o nível de atividade do corpo. </li><li> Coletar os seguintes tecidos e fluidos em pré-pesamed contando tubos: sangue, osso (joelho e ombro), vesícula biliar, rins, fígado, estômago (com conteúdo), intestino delgado (com conteúdo), intestino grosso e ceco (com conteúdo), tireóide e traqueia, bexiga com urina , e cauda. </li><li> Lavar tecidos apropriados (excluindo sangue, vesícula biliar e bexiga urinária) em PBS para remover o sangue e secar antes de colocar os tecidos em tubos de contagem adequadas. </li><li> Coloque carcaça de animal em um saco plástico e medir a atividade do corpo inteiro residual usando um calibrador de dose. </li><li> Pesar cada tubo que contém uma amostra de tecido. Subtrair o peso inicial do tubo para obter uma massa de tecido. </li><li> Usar um calibrador de dose (99m Tc definição) para medir a quantidade de actividade de uma amostra de teste (100 uL) no momento da injecção para cada rato. NOTA: Esta amostra teste é igual ao volume de injecção, dando, assim, a contagem de actividade no momento da injecção. </li><li> Na altura da medição do tecido, umaliquot 5 uL da amostra de teste utilizado anteriormente. Utilizar um contador de raios gama múltiplos detectores (configuração Tc 99m) e contam para obter a contagem por minuto (CPM) para a amostra de teste de 5 mL. </li><li> Use os dois valores obtidos em 2.2.9 e 2.2.10 para calcular a atividade e relacionamento CPM usando a equação 1 para obter um factor de conversão (CPM uCi -1). (1) <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/55188/55188eq1.jpg" /></li><li> Utilizar o contador gama para medir a quantidade de radioactividade em cada tecido ou amostra de fluido. </li><li> Use equação 1 para calcular a quantidade de actividade em cada tecido ou fluido no momento da medição em relação à dose total injectada. Este valor é em seguida normalizado pelo peso do órgão e relatados como percentagem da dose injectada por grama (ou seja,% ID / g) de tecido. </li><li> Siga os passos 2.1.2 a 2.2.13 para conduzir um experimento de controle negativo usando os marcado com 99m Tc ligantes tetrazina na Absence de TCO-BP. Sacrifício ratinhos (n = 3) em 0,5, 1, 4 e 6 h pós-injecção e obter o tecido ou fluido, tal como descrito acima. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Uma colecção de quelatos tridentados ligada-tetrazina de polaridades diferentes foi preparado, e a utilidade dos seus complexos 99mTc na reacção com um derivado IEDDA TCO in vivo foi avaliada. Um método eficaz e reprodutível rotulagem 99m Tc foi desenvolvido para cinco tetrazina-quelatos, onde a concentração de ligando foi 10 -3 M. A etapa de marcação foi seguida por desprotecção de t- butilo (para os compostos 2-5). A elevada concentração de ligando fo...

99m Tc continua a ser o radioisótopo dominante usada na medicina nuclear de diagnóstico, com mais de 50 milhões de procedimentos de imagem realizados por ano em todo o mundo 1, 2, 3. A maioria dos 99m agentes Tc utilizadas clinicamente são do tipo de perfusão radiofármacos. Há um número limitado de compostos-alvo de forma activa em que o 99mTc é dirigido para se ligar a um biomarcador específico através da ligação a uma construção de direccionamento. A criação de 99m alvo radiofármacos Tc é frequentemente prejudicado pela influência de 99m de complexos de Tc-ligando sobre a capacidade da molécula de direccionamento para ligar o biomarcador de interesse, ou os isótopos de meia-vida não é suficiente para utilização com biomoléculas peso molecular mais elevado tais como anticorpos. O último requer tipicamente vários dias antes de as imagens são adquiridas para que a biomolécula para limpar a partir de não-alvo tiss<html> ues. Pré-segmentação oferece uma abordagem alternativa para superar esses desafios. Pré-segmentação combinada com a química bioorthogonal tem demonstrado ser uma forma eficaz de desenvolver novas sondas imagem molecular para ambos fluorescência e radio-imagiologia 4, 5, 6, 7, 8. A reacção inversa de electrões demanda de Diels-Alder (IEDDA) entre derivados -cicloocteno trans (TCO) 1,2,4,5-tetrazina (Tz) e, como se mostra na Figura 1, tem sido demonstrado ser particularmente eficaz 6. A reação IEDDA com estes componentes podem apresentar cinética rápida na PBS (k 2 ≈ 6.000 M -1 s -1) e alta seletividade, sendo ideal para aplicações in vivo pré-segmentação 9, 10. e_content &quot;&gt; A abordagem mais comum utilizado envolve a administração de um vector de TCO-derivado de segmentação e depois de um período de atraso suficiente, uma tetrazina radiomarcado é administrado. tetrazinas marcados radioactivamente com base em 11 C, 18 F, 64 Cu, 89 Zr, e 111 no foram relataram 11, 12, 13, 14, 15. em contraste, há apenas um relatório de um marcado com 99m Tc Tz, o qual foi preparado usando um tipo de ligando HYNIC requerendo o uso de co-ligandos para prevenir a ligação e degradação de proteínas in vivo 16. Como alternativa, relatamos aqui a síntese de 99m Tc (I) marcado tetrazinas usando uma família de ligandos que formam complexos estáveis com um tridentados [99mTc (CO) 3] + núcleo. Figura 1: A reacção IEDDA bioorthogonal entre tetrazina e -cicloocteno trans. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55188/55188fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> A família de ligandos preparados contêm quelatos tridentados que variam em polaridade e da natureza do grupo de ligação entre a região de ligação do metal e a Tz (Figura 2). O objetivo foi identificar a 99m Tc-tetrazina construir que poderiam efetivamente localizar e reagir com os locais TCO marcados in vivo e rapidamente claro, não ligadas, a fim de produzir alta meta-se não-alvo rácios. Para testar os ligandos, um TCO-derivado de um bisfosfonato (TCO-PA) foi utilizado 17. Nós mostramos anteriormente que TCO-BP localiza a áreas do metabolismo ósseo activo e pode reagir comtetrazinas radiomarcados in vivo 18. É um reagente conveniente para testar novas tetrazinas, porque ele pode ser preparado num único passo e experiências podem ser realizadas em ratinhos normais onde a localização ocorre principalmente nas articulações (joelhos e ombros).

<table><tbody><tr><td>Gás argônio</td><td>Alphagaz</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>EMD Millipore</td><td>106395</td><td>---</td></tr><tr><td>Na2B4O7&#183; 10H2O</td><td>Anachemia</td><td>S9640</td><td>---</td></tr><tr><td>KNaC4H4O6&#183; 4H2O</td><td>Anachemia</td><td>217255</td><td>---</td></tr><tr><td>Technelite 99mTc gerador</td><td>Lantheus imagens médicas</td><td>---</td><td>Fonte de 99mTcO4-</td></tr><tr><td>0,9% Soro fisiológico</td><td>Lantheus imagens médicas</td><td>---</td><td>Para eluir o gerador</td></tr><tr><td>1 M HCl</td><td>Lab Chem</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>ACN</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>HPLC grau</td></tr><tr><td>Millipore H2O</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Barnstead Nanopure</td><td>---</td></tr><tr><td>DCM</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>TFA</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH 7,4 1x</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td>---</td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8047</td><td>---</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>CDMV</td><td>108737</td><td>Fornecedor: Fresenius Kabi Saúde Animal</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters</td><td>1525 Bomba Binária, 2998 Detector de Matriz de Fotodiodo, E-SAT/IN, Detector de PMT de Contagem de Fluxo Bioscan (item # 15590)</td><td>---</td></tr><tr><td>Coluna HPLC para análise e purificação de compostos 2-4</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4435-E0</td><td>Gemini&reg; 5 &micro; m C18 110&nbsp; &Aring;, Coluna LC Coluna de HPLC de 250 x 4,6 mm</td></tr><tr><td>para análise e purificação dos compostos 1 e 5</td><td>Águas&nbsp;</td><td>186003115</td><td>XBridge BEH C18 Coluna, 130 &Aring;, 5 &micro; m, 4.6 mm x 100 mm</td></tr><tr><td>Reator de Microondas&nbsp;</td><td>Biotage&nbsp;</td><td>Iniciador 8</td><td>---</td></tr><tr><td>Biotage V10 Evaporador</td><td>Biotage&nbsp;</td><td>Calibrador de série # V1041</td><td>---</td></tr><tr><td>Dose</td><td>Capintec, Inc.&nbsp;</td><td>Contador CRC-25R</td><td>---</td></tr><tr><td>Gamma</td><td>Perkin Elmer</td><td>Wizard 1470 Contador Automático de Gama</td><td></td></tr><tr><td>---Balança de sala animal&nbsp;</td><td>Mettler Toledo</td><td>XP105 Delta Range</td><td></td></tr><tr><td>---Frascos de micro-ondas&nbsp;</td><td>Biotage&nbsp;</td><td>355629</td><td>0,5-2 mL&nbsp;</td></tr></tbody></table>

preparação e avaliação de<sup&gt; 99m</sup&gt; tc-rotulados tridentadas quelatos de pré-alvo usando bioorthogonal química

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

O pré-direcionamento combinado com a química bio-ortogonal está emergindo como uma maneira eficaz de criar novos radiofármacos. Dos métodos disponíveis, a cicloadição de Diels-Alder (IEDDA) por demanda inversa de elétrons entre tetrazinas radiomarcadas e transcicloocteno (TCO) ligadas a uma biomolécula provou ser uma abordagem bio-ortogonal altamente eficaz para a imagem de alvos biológicos específicos. Apesar do fato de que o tecnécio-99m continua sendo o isótopo mais amplamente utilizado na medicina nuclear diagnóstica, há uma escassez de métodos para preparar tetrazinas marcadas com Tc 99m. Neste trabalho relatamos a preparação de uma família de derivados tridentados-quelatos-tetrazina e seus complexos Tc(I). Esses compostos até então desconhecidos foram radiomarcados com 99mTc usando um método assistido por micro-ondas em 31% a 83% de rendimento radioquímico. Os produtos são estáveis em solução salina e PBS e reagem rapidamente com derivados de TCO in vitro. Suas habilidades de pré-direcionamento in vivo foram demonstradas usando um derivado de TCO-bifosfonato (TCO-BP) que se localiza em regiões de metabolismo ósseo ativo ou lesão. Em estudos murinos, as Tc-tetrazinas 99mapresentaram altas concentrações de atividade nas articulações dos joelhos e ombros, o que não foi observado quando os experimentos foram realizados na ausência de TCO-BP. A captação geral em órgãos não-alvo e a farmacocinética variaram muito, dependendo da natureza do ligante e da polaridade do quelato.

Os ligandos foram sintetizados utilizando diferentes ligantes e agentes quelantes através de um simples estratégia de aminação redutiva (Figura 2), seguido por acoplamento do produto a um tetrazina comercialmente disponíveis 22, 23. A marcação radioactiva foi realizada utilizando o mesmo método para todos os compostos e era altamente reprodutível. O processo foi optimizado variando o pH, a quantidade de ligando, ...

Aqui, descrevemos um protocolo para radiomarcação e teste in vivo de derivados tridentados de quelato de 99mTc(I) e tetrazina para pré-direcionamento e química bio-ortogonal.

Preparação e Avaliação de<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-rotulados tridentadas Quelatos de Pré-alvo Usando Bioorthogonal Química

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

O objetivo geral deste procedimento é produzir tetrazinas marcadas com tecnécio-99m para imagem pré-direcionada utilizando química bioortogonal com biomoléculas modificadas por trans-cicloocteno como vetores de direcionamento. Este método fornece uma plataforma importante e nova para o desenvolvimento de radiofármacos inovadores. Por meio do pré-direcionamento, os complexos de tecnécio descritos aqui podem ser usados para imagens de uma ampla variedade de órgãos, tecidos e biomarcadores.Essa técnica é vantajosa porque fornece um método passo a passo robusto para produzir tetrazinas marcadas com radioisótopos de tecnécio-99m, o isótopo médico mais amplamente utilizado na medicina diagnóstica. Essa técnica pode ser usada com diferentes vetores de direcionamento, incluindo moléculas pequenas e anticorpos. Também pode ser utilizada em radioterapia, substituindo o tecnécio por isótopos emissores de beta do rênio.A técnica em biologia do nosso laboratório, Nancy Janzen, demonstrará parte dos procedimentos com animais. Para iniciar o procedimento de marcação radiativa, em um frasco para micro-ondas, combine oito miligramas de boranocarbonato de potássio, 15 miligramas de carbonato de sódio, 20 miligramas de tetraborato de sódio deca-hidratado e 25 miligramas de tartrato de potássio e sódio tetra-hidratado. Purgue o frasco com gás argônio durante 10 minutos.Em seguida, adicione quatro mililitros de pertecnetato de tecnécio-99m em salina 0,9% com uma atividade de 1.110 megabecqueréis ao frasco. Carregue a mistura de reação em um reator de micro-ondas e agite por 10 segundos. Aqueça então a mistura a 110 graus Celsius por 3,5 minutos para obter o cátion triaqua tricarbonil de tecnécio-99m.Adicione cerca de 400 microlitros de ácido clorídrico um molar para ajustar o pH da solução de 3,5 a 4,0. Em seguida, para cada ligante de tetrazina, dissolva dois miligramas do ligante em 250 microlitros de metanol. Adicione 250 microlitros do complexo de tecnécio-99m com uma atividade de 74 megabecquerels a cada solução de ligante.Aqueça a mistura em um reator de micro-ondas a 60 graus Celsius por 20 minutos. Para ligantes de tetrazina com grupos protetores t-butila, transfira a solução de um vial de micro-ondas para um vial cintilador de 20 mililitros e, em seguida, evapore o solvente e redissolva cada complexo em um mililitro de uma solução volume a volume um para um de diclorometano e ácido trifluoroacético. Em seguida, transfira a solução para um vial de micro-ondas e aqueça esses complexos em um reator de micro-ondas a 60 graus Celsius por seis a 10 minutos para desproteger os ligantes.Resfrie os complexos até a temperatura ambiente e, em seguida, evapore o solvente. Redissolva os resíduos em 500 microlitros de uma solução aquosa na proporção um para um de acetonitrila ou metanol e água antes de prosseguir para a purificação por CLAE. Utilize CLAE em fase reversa C18 para purificar cada complexo de tetrazina radioetiquetado com um gradiente de eluição de 30 a 70, passando para 40 a 60 de acetonitrila em água ao longo de 20 minutos, com 0,1% de ácido trifluoroacético presente no eluente durante todo o processo.Colete o produto purificado quando aparecer eluindo no traço gama. Em seguida, co-injete cada complexo marcado com uma solução contendo 0,125 miligramas do complexo de rádio-tetrazina correspondente em 20% de metanol em água. Compare os tempos de retenção do pico do complexo de rênio no traço UV e do pico do complexo de tecnécio no traço gama para verificar a identidade do pico gama.Remova o solvente de cada complexo de tecnécio-tetrazina purificado. Formule cada complexo numa concentração de 7,4 quilobecqueréis por microlitro em solução salina tamponada com fosfato contendo 0,5% de albúmina sérica bovina e 0,01% de polissorvato 80. Para cada camundongo, aspire com uma seringa 100 microlitros de uma solução de derivado TCOPB a cinco microgramas por microlitro em solução salina, para preparar uma dose de 20 miligramas por quilograma.Conecte uma agulha de 30 gauge à seringa de dosagem. Coloque o camundongo em um dispositivo de contenção física. Identifique as veias na superfície lateral da cauda, aproximadamente dois centímetros da ponta da cauda, e limpe a área com um cotonete com álcool.Insira a agulha da seringa em um ângulo raso, paralelo à veia. Injete lentamente o derivado de TCOBP. Retire a agulha e aplique uma gaze limpa com leve pressão no local da injeção até que o sangramento pare.Uma hora após a injeção do derivado TCOBP, administre uma dose de 100 microlitros do complexo de tetrazina com tecnécio-99m desejado, com uma atividade de aproximadamente 0,74 megabecquerel, por injeção na veia da cauda. Utilize um calibrador de dose para medir a atividade de uma amostra-teste de 100 microlitros do complexo de tecnécio no momento da injeção. Guarde a amostra-teste para medições posteriores.Anestesie o camundongo com uma mistura de gás isoflurano 3% e oxigênio 2% seis horas após a injeção. Coloque o camundongo em decúbito dorsal com o nariz no cone nasal para manter a anestesia e localize o processo xifoideu. Conecte uma agulha de 25 gauge a uma seringa previamente tratada com heparina.Insira a agulha em um ângulo de 20 graus sob o processo xifoide, levemente à esquerda da linha média. Uma vez que a agulha esteja totalmente inserida, retire lentamente o êmbolo para verificar a presença de sangue no hub da agulha, confirmando uma punção cardíaca bem-sucedida. Reajuste a agulha conforme necessário.Uma vez que o coração tenha sido perfurado, retire lentamente um mililitro de sangue para dentro da seringa. Transfira a amostra de sangue para um tubo de contagem previamente pesado. Eutanazie o camundongo por dislocação cervical enquanto sob anestesia.Coloque o animal eutanasiado em um saco plástico e meça a atividade corporal total com um calibrador de dose. Em seguida, colete os ossos do joelho e do ombro, a vesícula biliar, os rins, o fígado, a tireoide e a traqueia, e a cauda. Juntamente com seu conteúdo, colete o estômago, os intestinos delgados, os intestinos grossos e o ceco, e a bexiga urinária.Lave o sangue de todos os tecidos coletados, exceto da vesícula biliar e da bexiga urinária, com solução salina tamponada com fosfato. Seque os tecidos com papel absorvente e coloque cada tecido em um tubo de contagem previamente pesado. Meça a atividade residual do corpo.Pese cada amostra de tecido e calcule a massa do tecido isolado. Utilize um contador gama com múltiplos detectores para medir a atividade de uma alíquota de cinco microlitros da amostra de teste do complexo de tecnécio. Usando o valor obtido em contagens por minuto e a atividade medida no momento da injeção, calcule um fator de conversão.Meça a atividade de cada amostra de tecido e fluido com o detector gama. Converta os valores para microcurie e normalize cada valor pelo peso do órgão para determinar a porcentagem da dose injetada por grama de tecido. Repita este processo com camundongos adicionais sem a injeção do derivado TCOPB como uma série controle negativo.Utilizando este método, cinco complexos de tetrazina, diferindo em suas combinações de ligante e líder-chave, foram marcados com tecnécio-99m. Um derivado de TCOPB, que se localiza em regiões de alto turnover de cálcio no osso, foi utilizado para pré-direcionar as articulações do ombro e do joelho de camundongos. As razões entre a porcentagem da dose injetada por grama de tecido para osso e sangue foram calculadas para cada composto de tetrazina.Todos os cinco compostos foram rapidamente eliminados do sangue e direcionados para o osso, indicando que a reação de acoplamento bioortogonal seletiva entre os compostos de tetrazina e o derivado de TCOBP ocorreu in vivo. O composto três apresentou a melhor combinação de direcionamento e eliminação do sangue. Experimentos de controle negativo indicaram que os complexos de tetrazina marcados com radionuclídeos não se localizaram significativamente no osso na ausência do derivado de TCOBP.Por exemplo, quando o derivado TCOBP não foi administrado, o composto dois apresentou altos níveis na vesícula biliar e intestinos, mas muito pouco no osso. Foi observada grande variação na localização tecidual em camundongos que receberam o derivado TCOBP entre os cinco compostos testados. Por exemplo, muito pouco do composto três foi observado no intestino grosso, fígado ou urina e bexiga em comparação com outros complexos, enquanto muito mais do composto três foi observado no osso.Uma vez dominada, a técnica de marcação descrita aqui pode ser realizada do início ao fim em menos de duas horas, se executada corretamente. Ao tentar esta técnica, é importante garantir que todos os reagentes sejam pesados com precisão e que os sais sejam purgados com argônio antes da adição à solução de tecnécio. Também é fundamental que o pH da solução de tecnécio seja ajustado para 3,5 a 4 antes da adição do ligante tetrazina.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar e purificar tetrazinas marcadas com tecnécio e como elas podem ser usadas para criar novos radiofármacos utilizando pré-alvo e química bioortogonal. Não se esqueça de tomar as precauções apropriadas ao trabalhar com radioatividade, como entender o tipo de radiação emitida e a melhor forma de blindar e manipular as amostras.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Este vídeo descreve a técnica de radioimunoterapia pré-direcionada ou PRIT, na qual imunoconjugados seguidos de radioligantes são administrados para o tratamento de tumores. Esta radioimunoterapia reduz as doses de radiação para tecidos saudáveis e utiliza radionuclídeos com meias-vidas muito baixas, incompatíveis com vetores baseados em anticorpos.

Radioimunoterapia pré-direcionada: um método para entrega direcionada de radionuclídeos terapêuticos a tumores

Para demonstrar imagem molecular do câncer MR com um pequeno peptídeo alvo MRI agente de contraste específico para proteínas do plasma coagulado no estroma tumoral em um modelo de câncer de próstata do rato.

MR Imagem Molecular do cancro da próstata com um pequeno Molecular CLT1 Peptide alvejado agente de contraste

Nós apresentamos um método para a rápida imobilização, reversível de moléculas pequenas e montagens de nanopartículas funcionalizadas para a superfície Plasmon Resonance (SPR) estudos, usando seqüencial on-chip química cicloadição bioorthogonal e antígeno-anticorpo de captura.

Microfluidic On-chip Reação Capture-cicloadição para imobilizar reversível pequenas moléculas ou estruturas multi-componentes para aplicações de biossensores

A cicloadição de Diels-Alder de demanda inversa de elétrons bioortogonal foi aproveitada para criar uma estratégia de imagem PET pré-direcionada eficaz e modular para o câncer. Neste protocolo, as etapas desta metodologia são descritas no contexto de um sistema modelo que emprega o anticorpo direcionado ao câncer colorretal huA33 e um radioligante marcado com 64.

Aproveitando a demanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder para Pretargeted PET Imagem

Devido à sua meia-vida radioativa de vários dias e propriedades de decaimento favoráveis, o radiometal emissor de pósitrons 89Zr é extremamente adequado para uso em radiofármacos baseados em anticorpos para imagens PET. Neste protocolo, serão descritas a bioconjugação, radiossíntese e aplicação pré-clínica de 89anticorpos marcados com Zr.

O bioconjugação e radiossíntese de<sup&gt; 89</sup&gt; Anticorpos Zr-DFO-rotulados

Um procedimento pormenorizado para a síntese de uma azida marcado com 125I e a radiomarcação de dibenzocyclooctyne (DBCO) -Grupo-conjugados, nanopartículas de ouro de 13 nm de tamanho, utilizando uma reacção de clique sem cobre é descrito.

Um protocolo otimizado para a radiomarcação eficiente de nanopartículas de ouro usando um<sup&gt; 125</sup&gt; Marcado com Eu Azida grupo prostético

Seguindo a preparação de um anticorpo monoclonal 64 Cu-modificados se ligar a um receptor de células T de murino transgico, as células T são radiomarcados in vivo, analisadas para a viabilidade, funcionalidade, estabilidade rotulagem e apoptose, e transferidas adoptivamente para ratinhos com uma via aérea hipersensibilidade de tipo retardado reacção para imagem não invasivo por tomografia de emissão de positrões / tomografia computadorizada (PET / CT).

Murino Linfócitos Rotulagem por<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antibody Receptor Segmentação para<em&gt; In Vivo</em&gt; Tráfico celular por PET / CT

Peptídeos virais-derivado acoplados ao anticorpo-conjugados (ACs) é uma abordagem ganhando impulso devido ao potencial de entregar cargas moleculares com acumulação de células de tumor aumento. Utilizando métodos comuns para avaliar a conjugação do peptide, AC e acúmulo intracelular de carga e direcionamento do tumor, este protocolo ajuda pesquisadores durante as fases de desenvolvimento inicial chave.

Avaliação inicial do anticorpo cojugado modificado com peptídeos virais-derivado para aumentar a acumulação celular e melhorando o direcionamento do Tumor

Este protocolo descreve a síntese e caracterização de um trans- cyclooctene (TCO)-anticorpo e uma 177tetrazine Lu-rotulado (Tz) radioligantes para pretargeted radioimmunotherapy (Thayse) modificados. Além disso, ele detalha o uso dessas duas construções para na vivo biodistribuição e estudos longitudinais terapia em um modelo murino de câncer colorretal.

Pretargeted Radioimmunotherapy baseado na reação de Diels-Alder de demanda inversa elétron

Neste protocolo, descreveremos a síntese de vagens, phenyoxadiazolyl metil sulfona-baseado reagente para a ligação local-seletivo de cargas para os tióis de biomoléculas, especialmente de anticorpos. Além disso, descreveremos a síntese e caracterização de um quelante bifuncional PODS-rolamento e sua conjugação com um anticorpo de modelo.

Síntese e Bioconjugation dos reagentes Thiol-reativa para a criação de Site-seletivamente modificado Immunoconjugates

Apresentamos aqui um protocolo para radiomarcar células com um radioisótopo de tomografia por emissão de pósitrons (PET), 89 Zr (t1/2 78,4 h), usando um sintetizador de radiomarcação pronto para uso, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN). A radiomarcação de células com [89Zr]Zr-DBN permite rastreamento não invasivo e imagens de células radiomarcadas administradas no corpo com PET por até 7 dias após a administração.

Imagem por Tomografia por Emissão de Pósitrons do Tráfico Celular: Um Método de Radiomarcação Celular

Aprenda a radiomarcar tetrazinas com tecnécio-99m para imagem pré-alvo usando química bioortogonal. Este método permite visualizar órgãos e tecidos com alta especificidade em aplicações radiofarmacêuticas.

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