Um glóbulo vermelho simples método de lise para o estabelecimento de linhas celulares linfoblastóides B

O objetivo geral deste método simples é estabelecer linhagens celulares linfoblastóides B, ou B-LCLs, com alta eficiência de imortalização, usando apenas uma pequena quantidade de sangue e economizando tempo entre o início e a criopreservação. Este é um novo método para imortalizar células B humanas do sangue total, lisando os glóbulos vermelhos. Os B-LCLs fornecem uma fonte valiosa de biomateriais para realizar vários estudos.

A principal vantagem desse método é que apenas 0,5 mililitros de sangue são suficientes para obter B-LCLs com eficiência de imortalização e alta viabilidade celular. Estabelecer B-LCLs pelo vírus Epstein-Barr, ou EBV, transformando linfócitos B, o método amplamente utilizado em células mononucleares separadas do sangue periférico ou PBMC, por centrifugação com gradiente de densidade de Ficoll. No entanto, quando a amostra é inferior a um mililitro da lise dos glóbulos vermelhos, a adição falhará.

Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando descobrimos que isolar o PBMC de pequenos glóbulos vermelhos é difícil usando um método de separação por gradiente de densidade. Para preparar o EBV, no primeiro dia, comece descongelando as células B95-8 e cultive-as em um frasco de cultura T25 em seis mililitros de meio RPMI 1640 completo suplementado com 10% de FBS, dois milimolares de L-glutamina e antibióticos. Incube a cultura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

No segundo dia, ao microscópio, observe a morfologia celular. As células estão em boas condições quando são brilhantes e redondas. Adicione 10 mililitros de RPMI 1640 Medium completo à cultura.

No quarto dia, adicione 10 mililitros de meio fresco e transfira as células para um frasco de cultura T75. Então, no oitavo dia, adicione mais 20 mililitros de meio e mantenha as células por oito dias sem adicionar meio fresco. No dia 16, verifique as células ao microscópio.

Em seguida, colete 12 mililitros de células em tubos de centrífuga de 15 mililitros. Em seguida, criopreserve as células a menos 80 graus Celsius por uma hora e descongele rapidamente as culturas a 37 graus Celsius. Repita o congelamento e descongelamento, mais três vezes até que as partículas do vírus sejam liberadas das células.

Centrifugar as culturas a 240 vezes g à temperatura ambiente durante 10 minutos. Em seguida, filtre o sobrenadante através de um filtro de 0,22 mícron. Alíquota de 12 mililitros do filtrado por tubo e armazene os tubos a menos 80 graus Celsius.

A um tubo de 50 mililitros, adicione 0,5 mililitros de sangue total que foi anticoagulado por EDTA K2. Adicione um mililitro de tampão de lise de glóbulos vermelhos ao sangue total e misture bem. Incube a mistura em temperatura ambiente por quatro minutos. Em seguida, adicione rapidamente cinco a sete mililitros de 1x PBS para interromper a reação de lise.

Depois de adicionar tampão de lise de glóbulos vermelhos ao sangue, certifique-se de misturar bem. A inversão garante que a reação seja encerrada em tempo hábil. Em seguida, centrifugue o tubo a 240 vezes g à temperatura ambiente por cinco minutos.

Os glóbulos brancos precipitarão no fundo do tubo. Rejeitar o sobrenadante e lavar o precipitado adicionando sete mililitros de meio básico 1640. Em seguida, centrifugue a solução antes de repetir a lavagem.

Com 300 microlitros de meio de transformação, ressuspenda o pellet celular. Em seguida, para realizar a infecção por EBV, adicione 60 microlitros de 20 microgramas por mililitro de ciclosporina A à suspensão celular. Descongele rapidamente uma alíquota de EBV a 37 graus Celsius e adicione 240 microlitros do vírus às células.

Misture bem a suspensão e transfira 200 microlitros por poço para uma placa de 96 poços. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Durante o primeiro mês após a infecção por EBV, troque metade do meio na cultura de células uma vez por semana.

No sétimo dia, apenas uma espessa camada de fragmentos de células é visível ao microscópio. Após um mês de infecção, aglomerados de células linfoblastóides são visíveis sob uma espessa camada de fragmentos de células. Deste ponto em diante, troque metade do meio a cada três dias até que os aglomerados de células sejam claramente visíveis ao microscópio.

Depois de ressuspender as células, transfira a suspensão para os poços de uma placa de 24 poços. Então, dependendo da taxa de crescimento celular, quando o meio de cultura ficar amarelo, dobre o volume do meio RPMI 1640 completo. Quando os aglomerados de células linfoblastóides forem visíveis a olho nu, transfira a cultura para um balão de cultura T25.

À medida que o meio de cultura ficar amarelo, dobre o volume do meio até que o volume se expanda para 10 a 15 mililitros. Antes de congelar, troque o meio 24 horas antes de cada vez. Em seguida, para congelar as células, centrifugue a suspensão celular e use um contador de células para contar as células.

Com a solução estoque congelada contendo 90% de FBS e 10% de DMSO, ajuste a suspensão para uma densidade de cinco a 10 vezes 10 elevado à sexta célula por mililitro. Em seguida, congele a suspensão a uma taxa de um grau Celsius por minuto a menos 80 graus Celsius antes de transferir as células congeladas diretamente para o nitrogênio líquido. Durante o processo de transformação, as mudanças morfológicas das células são visíveis por microscopia de luz.

Após sete dias de infecção, pequenos aglomerados de células são claramente visíveis usando o método de separação por gradiente de densidade, enquanto apenas uma espessa camada de fragmentos de células é visível a partir do método de lise de glóbulos vermelhos. 30 dias após a infecção, aglomerados de células linfoblastóides são visíveis sob a espessa camada de fragmentos celulares. Com mudanças de meio mais frequentes, os detritos celulares são reduzidos e os aglomerados de células são claramente visíveis e parecem semelhantes à cultura estabelecida pela separação do gradiente de densidade.

Finalmente, o ensaio MTT foi usado para avaliar a viabilidade de B-LCLs. Os resultados aqui mostrados indicam que as células B-LCLs cultivadas usando o método de lise do sangue vermelho foram significativamente mais viáveis do que a cultura estabelecida usando o método de separação por gradiente de densidade. Uma vez dominado, o processo de transformação viral do EBV pode ser feito em 30 minutos quando é realizado corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estabelecer B-LCLs com um método simples e de lise de glóbulos vermelhos que economiza tempo sem purificação prévia de linfócitos. Após seu desenvolvimento, essa técnica acelerou o progresso do estudo genômico, transcriptômico e proteômico das doenças associadas ao EBV e essa aplicação na produção de anticorpos mononucleares. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos humanos, como o EBV, pode ser extremamente perigoso e as precauções devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.