Name: Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: Aprenda a diferenciar células pluripotentes humanas em progenitores hematopoiéticos CD34+ primitivos e definitivos usando manipulação específica da sinalização WNT. Este método robusto avança a pesquisa em hematopoiese humana.

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Este trabalho foi apoiado pelo departamento de medicina interna, divisão de Hematologia, Washington University School of Medicine. CD foi apoiada pelo T32HL007088 de nacional do coração, pulmão e Instituto de sangue. CMS foi apoiado por uma sociedade americana de hematologia estudioso Award.

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li>
<li>Ditadi, A., Sturgeon, C. M., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+of+human+haematopoietic+development+from+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A view of human haematopoietic development from the Petri dish.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (1), 56-67 (2017).</li>
<li>Chen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythroid%2Fmyeloid+progenitors+and+hematopoietic+stem+cells+originate+from+distinct+populations+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).</li>
<li>McGrath, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Sources+of+Hematopoietic+Progenitors+Emerge+before+HSCs+and+Provide+Functional+Blood+Cells+in+the+Mammalian+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo.</a> Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).</li>
<li>McGrath, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+definitive+erythroid+lineage+with+unique+regulation+of+the+beta-globin+locus+in+the+mammalian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transient definitive erythroid lineage with unique regulation of the beta-globin locus in the mammalian embryo.</a> Blood. 117 (17), 4600-4608 (2011).</li>
<li>Palis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+emergence+of+high+proliferative+potential+hematopoietic+precursors+during+murine+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal emergence of high proliferative potential hematopoietic precursors during murine embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (8), 4528-4533 (2001).</li>
<li>Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+erythroid+and+myeloid+progenitors+in+the+yolk+sac+and+embryo+proper+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse.</a> Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).</li>
<li>Boiers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphomyeloid+contribution+of+an+immune-restricted+progenitor+emerging+prior+to+definitive+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lymphomyeloid contribution of an immune-restricted progenitor emerging prior to definitive hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (5), 535-548 (2013).</li>
<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).</li>
<li>Hadland, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+requirement+for+Notch1+distinguishes+2+phases+of+definitive+hematopoiesis+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A requirement for Notch1 distinguishes 2 phases of definitive hematopoiesis during development.</a> Blood. 104 (10), 3097-3105 (2004).</li>
<li>Kumano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1+but+not+Notch2+is+essential+for+generating+hematopoietic+stem+cells+from+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Notch1 but not Notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells from endothelial cells.</a> Immunity. 18 (5), 699-711 (2003).</li>
<li>Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origin+of+the+adult+hematopoietic+system%3A+advances+and+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions.</a> Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).</li>
<li>Robert-Moreno, A., Espinosa, L., de la Pompa, J. L., Bigas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBPjkappa-dependent+Notch+function+regulates+Gata2+and+is+essential+for+the+formation+of+intra-embryonic+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RBPjkappa-dependent Notch function regulates Gata2 and is essential for the formation of intra-embryonic hematopoietic cells.</a> Development. 132 (5), 1117-1126 (2005).</li>
<li>Chadwick, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+BMP-4+promote+hematopoietic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells.</a> Blood. 102 (3), 906-915 (2003).</li>
<li>Davis, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+GFP+reporter+gene+to+the+MIXL1+locus+of+human+embryonic+stem+cells+identifies+human+primitive+streak-like+cells+and+enables+isolation+of+primitive+hematopoietic+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors.</a> Blood. 111 (4), 1876-1884 (2008).</li>
<li>Kaufman, D. S., Hanson, E. T., Lewis, R. L., Auerbach, R., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+colony-forming+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (19), 10716-10721 (2001).</li>
<li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).</li>
<li>Ledran, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+hematopoietic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+on+stromal+cells+derived+from+hematopoietic+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 85-98 (2008).</li>
<li>Ng, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primitive+streak+gene+Mixl1+is+required+for+efficient+haematopoiesis+and+BMP4-induced+ventral+mesoderm+patterning+in+differentiating+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The primitive streak gene Mixl1 is required for efficient haematopoiesis and BMP4-induced ventral mesoderm patterning in differentiating ES cells.</a> Development. 132 (5), 873-884 (2005).</li>
<li>Pick, M., Azzola, L., Mossman, A., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+in+serum-free+medium+reveals+distinct+roles+for+bone+morphogenetic+protein+4%2C+vascular+endothelial+growth+factor%2C+stem+cell+factor%2C+and+fibroblast+growth+factor+2+in+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells in serum-free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein 4, vascular endothelial growth factor, stem cell factor, and fibroblast growth factor 2 in hematopoiesis.</a> Stem Cells. 25 (9), 2206-2214 (2007).</li>
<li>Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+CD34%2B+cells%3A+efficient+production+in+the+coculture+with+OP9+stromal+cells+and+analysis+of+lymphohematopoietic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential.</a> Blood. 105 (2), 617-626 (2005).</li>
<li>Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukosialin+%28CD43%29+defines+hematopoietic+progenitors+in+human+embryonic+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures.</a> Blood. 108 (6), 2095-2105 (2006).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+enhances+the+generation+of+hematopoietic+progenitors+from+human+embryonic+stem+cell-derived+hemato-vascular+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors.</a> Blood. 116 (23), 4786-4794 (2010).</li>
<li>Zambidis, E. T., Peault, B., Park, T. S., Bunz, F., Civin, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+progresses+through+sequential+hematoendothelial%2C+primitive%2C+and+definitive+stages+resembling+human+yolk+sac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development.</a> Blood. 106 (3), 860-870 (2005).</li>
<li>Sturgeon, C. M., Ditadi, A., Awong, G., Kennedy, M., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+Signaling+Controls+the+Specification+of+Definitive+and+Primitive+Hematopoiesis+From+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Wnt Signaling Controls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From Human Pluripotent Stem Cells.</a> Nat Biotechnol. 32 (6), 554-561 (2014).</li>
<li>Choi, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+hemogenic+endothelial+progenitor+and+its+direct+precursor+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).</li>
<li>Ditadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Definitive+Haemogenic+Endothelium+and+Arterial+Vascular+Endothelium+Represent+Distinct+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human Definitive Haemogenic Endothelium and Arterial Vascular Endothelium Represent Distinct Lineages.</a> Nat Cell Biol. 17 (5), 580-591 (2015).</li>
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<li>Schmitt, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T+cell+development+and+establishment+of+T+cell+competence+from+embryonic+stem+cells+differentiated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro.</a> Nat Immunol. 5 (4), 410-417 (2004).</li>
<li>Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OP9-DL1+system%3A+generation+of+T-lymphocytes+from+embryonic+or+hematopoietic+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), (2009).</li>
<li>Polychronopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+synthesis+of+indirubins+as+potent+and+selective+inhibitors+of+glycogen+synthase+kinase-3+and+cyclin-dependent+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and cyclin-dependent kinases.</a> J Med Chem. 47 (4), 935-946 (2004).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-mediated+disruption+of+Wnt-dependent+signaling+in+tissue+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer.</a> Nat Chem Biol. 5 (2), 100-107 (2009).</li>
<li>Sugimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+and+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Ohgushi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathway+and+cell+state+responsible+for+dissociation-induced+apoptosis+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).</li>
<li>Peschle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic----Fetal+Hb+switch+in+humans%3A+studies+on+erythroid+bursts+generated+by+embryonic+progenitors+from+yolk+sac+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Embryonic----Fetal Hb switch in humans: studies on erythroid bursts generated by embryonic progenitors from yolk sac and liver.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (8), 2416-2420 (1984).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Este protocolo descreve um método de rápida, livre de soro, estroma-livre para a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivos ou definitivos. Mesodérmicas especificação de progenitores hematopoiéticos primitivos ou definitivas pode ser confiantemente alcançada usando nosso protocolo, que explora com exclusividade a inibidores de pequenas moléculas de sinalização de WNT canônico. Activação do WNT estágio específico com o inibidor de GSK3β CHIR9902133 dá origem a mesoderme hematopoiética...

Células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) são definidas como englobando tanto células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSCs) e tem a capacidade única de não só passando por auto-renovação sob condições adequadas de crescimento, Mas também, a capacidade de se diferenciar em todos os tipos de células derivadas das três camadas germinativas: endoderme, mesoderme e ectoderme1. Devido a essas habilidades únicas, hPSCs segurar a grande promessa para a medicina regenerativa, modelagem de doença e de terapias baseadas na célula2. Enquanto vários tipos de células têm sido diferenciados com êxito de hPSCs, um desafio significativo é a especificação em vitro de exclusivamente como adulto hPSC-derivado tronco células hematopoiéticas (linfócitos) e progenitores hematopoiéticos definitivos.
Um provável barreira para o desenvolvimento de linfócitos humanos de hPSCs é a presença de múltiplos programas hematopoiéticas dentro do embrião humano3. O primeiro programa que emerge, denominado "hematopoiese primitivo," origina-se dentro do tecido extraembryonic saco vitelino e melhor caracteriza-se por sua produção transiente de progenitores eritroblasto (EryP-CFC), macrófagos e megacariócitos. Notavelmente, este programa não dá origem a linfócitos, nem dá origem a progenitores linfoides T e B. No entanto, o saco vitelino transitoriamente originar restritos definitivas progenitores hematopoiéticos, tais como o progenitor mieloide-Eritro (EMP4,5,6,7,8) e o deficiente eritroide linfoide-aprontadas multipotent progenitor (LMPP9). No entanto, EMPs nem LMPPs são totalmente multipotentes, ou capaz de HSC-como enxertia em adultos destinatários. Em contraste, mais tarde, em desenvolvimento, o programa hematopoiético "definitivo" classicamente definido é especificado na região da aorta-gônada-mesonephros do embrião propriamente dito, dando origem a todas as linhagens hematopoéticas adultas, incluindo o HSC. A especificação dessas células hematopoiéticas definitivo intra embrionário ocorre em uma forma de entalhe-dependentes, através de uma transição endotelial-para-hematopoiéticas do hemogenic endotélio (ele)3,10,11 ,12,13,14. Além da capacidade de reconstituição, o potencial de multilineage e entalhe-dependência destas células podem ser usado para distinguir estes progenitores hematopoiéticos definitivos o EMP e o LMPP (revisto em referências3,13 ).
Compreender o mecanismo (s) que regem a especificação hematopoiética primitiva e definitiva de hPSCs é provável crítica à produção reprodutível de progenitores hematopoiéticos definitivas através de uma variedade de linhas hPSC. Até recentemente, hPSC protocolos de diferenciação que poderiam separar multipotentes progenitoras hematopoiéticas primitivas e definitivas não existia15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. Muitas abordagens usando soro fetal bovino (FBS) e/ou do estroma co-cultura primeiro delineou o potencial hematopoiético do hPSC diferenciação, com misturas de primitivo e definitivo hematopoiéticas potencial15,16, 17,19,22,23,25. Além disso, muitos protocolos isento de soro hematopoiéticos têm descrito os requisitos de sinal para a especificação da mesoderme de hPSCs que abriga hematopoiéticas potencial18,20,21, 24. no entanto, como esses métodos ainda deram origem a misturas heterogêneas de ambos os programas, seu uso em aplicações clínicas e mecanismos de compreensão do desenvolvimento pode ser limitado.
Temos recentemente construído sobre esses estudos, tendo descrito os requisitos específicos do estágio sinal para União/NODAL e sinalização de WNT na especificação hematopoiética primitiva e definitiva de hPSC-derivado do mesoderma18,26 . Este último foi particularmente original, como seu uso de manipulação de sinal WNT estágio específico permite a especificação de exclusivamente primitivo ou de progenitores hematopoiéticos definitivo exclusivamente26. Durante a especificação de mesoderme, a inibição da sinalização de WNT canônico com o inibidor PORCN IWP2 resulta na especificação de CD43+ EryP-CFC e progenitores mieloides, sem potencial linfoide detectável. Em contraste, estimulação de sinalização WNT canônico com o inibidor de GSK3β, CHIR99021, durante a mesma fase de diferenciação resultou na completa ausência de CD43 detectável+ EryP-CFC, enquanto simultaneamente levando para o especificação de CD34+CD43− . Esta população possuía mieloide, HBG-expressando eritroide e potencial T-linfoide. Análises subsequentes identificaram isso como falta a expressão de seu potencial hematopoiética e CD18428e CD7327,28 era entalhe-dependente28. Além disso, a única célula análises clonais demonstraram que estas linhagens hematopoiéticas definitivas podem ser derivadas de células únicas multipotentes28. Tomados em conjunto, estes estudos indicam que estágio específico WNT sinalização manipulação pode especificar progenitores hematopoiéticos primitivos puros, ou progenitores hematopoiéticos definitivos multipotentes de entalhe-dependente.
Aqui, nós esboçamos nossa estratégia de diferenciação que produz exclusivamente primitivos ou definitivas progenitores hematopoiéticos, através da manipulação de WNT canônico sinalização durante a padronização mesodérmicas e sua linhagem a jusante hematopoiética ensaios. Este protocolo é de grande valor para os investigadores que estão interessados na produção de progenitores hematopoiéticos primitivos ou definitivos de hPSCs para aplicações de medicina regenerativa.

<table><tbody><tr><td>Meio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMD)</td><td>Corning</td><td>10-016</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS), célula ES classificada</td><td>Gemini Bioproducts</td><td>100-500</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina, solução 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina, pele suína, Tipo A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>12000-022</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Corning</td><td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>Reposição de soro knock-out</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td>"KOSR"</td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais (NEAA)</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>b-mercaptoetanol, solução de 55 mM</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Fração V, Soro Bovino Albumina</td><td>Fisher Suplemento N2</td><td></td> F12 Corning 10-080 da Scientific BP1605 <td></td></tr><tr><td></td><td>da Ham Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27, sem vitamina A</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Stempro-34 (SP34)</td><td>Life Technologies</td><td>10639011</td><td>"SP34"</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>Fator de crescimento reduzido Matrigel Corning <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>354230</td> <td>"MAT"</td></tr> <tr><td>L-ácido absorvente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Transferrina de soro humano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10652202001</td><td></td></tr><tr><td>Monotioglicerol (MTG)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase B</td><td>Roche</td><td>11088831001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Life Technologies</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>R& D Systems</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>R& D Systems</td><td>255-SC</td><td></td></tr><tr><td>IGF-1</td><td>R& D Systems</td><td>291-G1</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>R& D Systems</td><td>203-IL</td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>R& D Sistemas</td><td>206-IL</td><td></td></tr><tr><td>IL-7</td><td>R& D Systems</td><td>207-IL</td><td></td></tr><tr><td>IL-11</td><td>R& D Systems</td><td>218-1L</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>R& D Systems</td><td>288-TP</td><td></td></tr><tr><td>EPO</td><td>Peprotech</td><td>100-64</td><td></td></tr><tr><td>Flt-3 ligante (FLT3-L)</td><td>R& D Systems</td><td>308-FK</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>IWP2</td><td>Tocris</td><td>3533</td><td></td></tr><tr><td>Angiotensina II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9525</td><td></td></tr><tr><td>Losartan Potássio</td><td>Tocris</td><td>3798</td><td></td></tr><tr><td>CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4</td><td>BD Biosciences</td><td>560650</td><td>Diluição 1:100; Ensaio de células T</td></tr><tr><td>CD8 PE Clone RPA-T8</td><td>BD Biosciences</td><td>561950</td><td>Diluição 1:10; Ensaio de células T</td></tr><tr><td>CD34 APC Clone 8G12</td><td>BD Biosciences</td><td>340441</td><td>Diluição 1:100; Ensaio EHT</td></tr><tr><td>CD34 PE-Cy7 Clone 8G12</td><td>BD Biosciences</td><td>348801</td><td>Diluição 1:100; Endotélio hemogênico</td></tr><tr><td>CD43 FITC Clone 1G10</td><td>BD Biosciences</td><td>555475</td><td>Diluição 1:10; Endotélio hemogênico</td></tr><tr><td>CD45 APC-Cy7 Clone 2D1</td><td>BD Biosciences</td><td>557833</td><td>Diluição 1:50; Ensaio de células T</td></tr><tr><td>CD45 eFluor450 Clone 2D1</td><td>BD Biosciences</td><td>642284</td><td>Diluição 1:50; Ensaio EHT</td></tr><tr><td>CD56 APC Clone B159</td><td>BD Biosciences</td><td>555518</td><td>Diluição 1:20; Ensaio de células T</td></tr><tr><td>CD73 PE Clone AD2</td><td>BD Biosciences</td><td>550257</td><td>Diluição 1:50; Endotélio hemogênico</td></tr><tr><td>CD184 APC Clone 12G5</td><td>BD Biosciences</td><td>555976</td><td>Diluição 1:50; Endotélio hemogênico</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>BD Biosciences</td><td>564907</td><td>Diluição 1:10.000; Ensaio de células T</td></tr><tr><td>OP9 Células</td><td></td><td></td> DL4 <td>Holmes, R. e JC Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156</td></tr><tr><td>MethoCult H4034</td><td>Stemcell Technologies</td><td>4034</td><td>"MeC"</td></tr><tr><td>Milli-Q sistema de purificação de água</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% CO2 incubadora</td><td></td><td></td><td>Conjunto em 37 C</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td> multigás <td>Conjunto em 37 C, 5% CO2, 5% O2</td></tr><tr><td>6 poço placa de cultura de tecidos</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 24 poços</td><td>Corning</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de baixa aderência de 6 poços</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de baixa aderência de 24 poços</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos de 35 mm</td><td>Corning</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de ponta romba, calibre 16</td><td>Seringas</td><td></td> Corning 305198 <td></td></tr><tr><td>3 cc</td><td>Corning</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>tubo de ensaio de polipropileno de 5 mL</td> Tubo <td>de ensaio de</td> poliestireno de 5 mL de 352063 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>15 mL de polipropileno cônico</td><td>Corning</td><td>430791 50</td><td></td></tr><tr><td>mL de polipropileno cônico</td><td>Corning</td><td>430921</td><td></td></tr><tr><td>pipeta sorológica de 2 mL</td><td>Corning</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 5 mL</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 10 mL</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 25 mL</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Raspadores de células</td><td>Corning</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>criogeniais de 2,0 mL</td><td>Tubo</td><td>de ensaio de 430488</td><td></td></tr><tr><td>de 5 mL com 40 &micro; Filtro de células M</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; Filtro de células M</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td>de cultura de células</tr><tr><td>Capuz de biossegurança</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS AriaII ou equivalente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSRii ou equivalente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software FlowJo</td><td>TreeStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td></td><td></td><td>Ajustado a 37 C</td></tr><tr><td>0,22 &micro; Sistema de filtragem</td><td>M Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 C geladeira-20</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>C Freezer-80</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>C Freezer</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Um dos objetivos principais para a medicina regenerativa é a geração e manutenção de células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) derivadas de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Até recentemente, os esforços para diferenciar hPSCs em linfócitos predominantemente geraram progenitores hematopoiéticos que faltam potencial HSC e em vez disso se assemelham a hematopoiese saco vitelino. Estes progenitores hematopoiéticos resultantes podem ter limitado utilitário para modelagem em vitro de doença de várias desordens hematopoiéticas adultos, particularmente aqueles das linhagens linfoides. No entanto, recentemente descrevemos métodos para gerar Eritro-Mielo-linfoide multilineage definitivos progenitores hematopoiéticos de hPSCs usando um protocolo de estágio específico dirigido diferenciação, que nós esboçamos aqui. Através de dissociação enzimática de hPSCs na membrana basal matriz-revestido plasticware, formam-se órgãos do embryoid (EBs). EBs são diferenciadas a mesoderme por recombinação BMP4, que posteriormente é especificado para o programa definitivo hematopoiético do inibidor de GSK3β, CHIR99021. Alternativamente, hematopoiese primitivo é especificado o inibidor PORCN, IWP2. Hematopoiese é impulsionado ainda mais através da adição de recombinação VEGF e citocinas hematopoiéticas solidária. Os progenitores hematopoiéticos resultantes gerados usando esse método tem o potencial para ser utilizado para a doença e a modelagem do desenvolvimento, em vitro.

Um esquema representando a indução de progenitores hematopoiéticos primitivos e definitivos de hPSCs é ilustrado na Figura 1. Mesoderme padronização por WNT canônico sinalização ocorre durante os dias 2-3 de diferenciação, seguido de especificação progenitoras hematopoiéticas.
Representativa do fluxo cytometric análise e formadoras de ensaios de metilcelulose de culturas hPSC-derivado de diferenciaç...

Aqui, apresentamos pluripotentes humanas de protocolos de cultura de células-tronco (hPSC), usados para diferenciar hPSCs em CD34+ progenitores hematopoiéticos. Este método usa a manipulação de estágio específico de WNT canônico sinalização para especificar células exclusivamente para ambos o programa hematopoiética definitivo ou primitivo.

Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

O objetivo geral deste método é direcionar a diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas para o programa hematopoético primitivo ou definitivo, utilizando uma abordagem de manipulação de sinais específica para cada estágio. Este método pode responder a muitas questões fundamentais na área, como compreender os reguladores sinalizadores e transcripcionais da hematopoese definitiva humana. A principal vantagem desta técnica é que ela utiliza manipulação específica para cada estágio de forma imediata.Demonstrando este procedimento está Carissa Dege, pós-doutoranda no meu laboratório. Para iniciar o protocolo, obtenha linhagens de células-tronco pluripotentes humanas ou HPSCs previamente preparadas e cultivadas sobre fibroblastos embrionários de camundongo ou MEFs até atingirem de 70% a 80% de confluência em incubadora a 37 °C com 5% de CO₂. Aspire o meio das HPSCs e adicione um mililitro de tripsina-EDTA 0,25% a 37 °C a cada poço durante um minuto.Após um minuto, aspire a tripsina e adicione um mililitro de meio estoque a cada poço. Usando um espátula para células, desprenda as células da placa. Em seguida, adicione um mililitro de tampão de lavagem a cada poço.Com uma pipeta

directed-differentiation-primitive-definitive-hematopoietic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Geração de linfócitos T de tronco pluripotentes induzidas (iPS) células dá uma abordagem alternativa de utilização de células-tronco embrionárias para T imunoterapia baseada em células. O método mostra que, utilizando...

Diferenciação de células Dirigido tronco pluripotentes induzidas no sentido de Linfócitos T

Nós, com base no conhecimento da biologia do desenvolvimento e pesquisas publicadas, desenvolvemos um protocolo otimizado para gerar com eficiência neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo A9 a partir de células-tronco embrionárias humanas e células-tronco pluripotentes induzidas humanas, o que seria útil para modelagem de doenças e terapia de substituição celular para a doença de Parkinson.

Dirigido neurônios dopaminérgicos Diferenciação de Células-Tronco pluripotentes humanas

Este protocolo descreve a indução eficiente de endotélio hemogênico e progenitores hematopoiéticos multipotenciais a partir de células-tronco pluripotentes humanas por meio da expressão forçada de fatores de transcrição.

A indução direta de hegemônicos endotélio e sangue por sobre-expressão de fatores de transcrição na pluripotentes humanas Células-Tronco

O protocolo descrito aqui detalha a indução de um programa hemogênico em fibroblastos embrionários de camundongos por meio da superexpressão de um conjunto mínimo de fatores de transcrição. Essa tecnologia pode ser traduzida para o sistema humano para fornecer plataformas para estudos futuros de hematopoiese, doenças hematológicas e transplante de células-tronco hematopoiéticas.

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

Aqui, nós apresentamos um protocolo para formar precisamente o endotélio hemogenic das pilhas de haste pluripotentes humanas em uma condição do alimentador-e do Xeno-livre. Este método terá amplas aplicações na modelagem de doenças e triagem para compostos terapêuticos.

Diferenciação do endotélio hemogênico de células-tronco pluripotentes humanas em um alimentador-e condição definida livre de Xeno

Aqui, nós apresentamos um protocolo para a caracterização immunophenotypic e a diferenciação induzida citocinas do sangue do cabo derivado CD34+ a haste hematopoietic e as pilhas do progenitor às quatro linhagens Myeloid. As aplicações deste protocolo incluem investigações sobre o efeito de mutações da doença Myeloid ou de moléculas pequenas na diferenciação Myeloid das pilhas de CD34+ .

Diferenciação Pan-Myeloid do sangue humano do cabo derivado CD34+ da haste hematopoietic e das pilhas do progenitor

Este protocolo demonstra a indução de um programa hemogenic em fibroblastos dérmicos humanos pela expressão forçada dos fatores de transcrição GATA2, GFI1B e FOS para gerar células-tronco e progenitoras hematopoiéticas.

Reprogramação hemogénica de fibroblastos humanos pela expressão forçada de fatores de transcrição

O objetivo deste artigo é fornecer uma abordagem padronizada para induzir a diferenciação de progenitor hepático humano das células-tronco pluripotentes. O desenvolvimento deste procedimento com formulações de mídia prontas para uso oferece ao usuário um sistema fácil de gerar células hepáticas humanas para pesquisa biomédica e tradução.

Especificação progenitora hepática de células-tronco pluripotentes usando um sistema de diferenciação definido

Apresenta-se aqui um protocolo simples para a diferenciação direcionada de células endoteliais hemogênicas de células-tronco pluripotentes humanas em aproximadamente 1 semana.

Diferenciação Dirigida de Células Endoteliais Hemogênicas de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Este protocolo apresenta a diferenciação de osteoclastos humanos de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) e descreve métodos para a caracterização de osteoclastos e precursores de osteoclastos.

Diferenciação e Caracterização de Osteoclastos de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas

Aprenda a diferenciar células pluripotentes humanas em progenitores hematopoiéticos CD34+ primitivos e definitivos usando manipulação específica da sinalização WNT. Este método robusto avança a pesquisa em hematopoiese humana.

Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

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