Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

O objetivo geral deste método é direcionar a diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas para o Programa Hematopoiético Primitivo ou Definitivo usando uma abordagem de manipulação de sinal específica do estágio. Este método pode abordar muitas questões-chave no campo, como a compreensão do sinal e dos reguladores transcricionais da hematopoiese definitiva humana. A principal vantagem dessa técnica é que ela usa manipulação específica do estágio instantaneamente.

Demonstrando este procedimento está Carissa Dege, uma pós-doutoranda em meu laboratório. Para iniciar o protocolo, obtenha linhagens de células-tronco pluripotentes humanas ou HPSCs previamente preparadas cultivadas em fibroblastos embrionários de camundongos ou MEFs a 70% a 80% de confluência em uma incubadora de 37 graus Celsius com cinco por cento de CO2. Aspire o meio HPSC e adicione um mililitro de EDTA de tripsina a 37 graus Celsius 0,25% a cada poço por um minuto.

Após um minuto, aspire a tripsina e adicione um mililitro de mídia estoque a cada poço. Usando um raspador de células, raspe as células da placa. Em seguida, adicione um mililitro de tampão de lavagem a cada poço.

Com uma pipeta sorológica de dois mililitros, triture as células de três a cinco vezes para quebrar grandes aglomerados. E transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar os HPSCs a 330 x G durante cinco minutos.

Após a rotação, adicione o meio HPSC e ressuspenda as células. Em seguida, adicione dois mililitros de HPSCs ressuspensos a cada poço do material plástico codificado MAT e incube as células durante a noite. Após 24 horas, aspire o meio e substitua-o por 37 graus Celsius 0,05% de tripsina EDTA por um minuto.

Aspirar a tripsina EDTA. Adicione um mililitro de mídia de estoque e raspe as células vigorosamente com um raspador de células. Em seguida, adicione um mililitro de mídia de lavagem.

Com uma pipeta sorológica de dois mililitros, triturar as células três vezes e transferi-las para um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar as células a 220 x G durante cinco minutos. Em seguida, aspire o meio, adicione 20 mililitros de meio de lavagem e use uma pipeta sorológica de cinco mililitros para ressuspender suavemente as células.

Após centrifugação e aspiração, ressuspenda cuidadosamente os corpos embrióides ou EBs em meio de dia zero. Dispense dois mililitros de meios de diferenciação contendo EBs em cada poço de uma placa de cultura de células de baixa aderência de seis poços usando uma pipeta sorológica de dez mililitros. Coloque os EBs em uma incubadora multigás de 37 graus Celsius, cinco por cento de CO2 e cinco por cento de O2.

Vinte e quatro horas depois, adicione dois mililitros de mídia do primeiro dia. Incubar as células durante a noite em uma incubadora multigás. Após 18 horas, colher suavemente os EBs com uma pipeta sorológica de cinco mililitros e girá-los a 100 x G por cinco minutos.

Lave e combine toda a cultura com dez mililitros de Dulbecco Medium Modificado de Iscove ou IMDM. Depois de girar a cultura novamente a 100 X G por cinco minutos para remover os detritos, aspire o meio. Ressuspenda suavemente os EBs com o meio do segundo dia usando uma pipeta P1000.

Em seguida, dispense dois mililitros dos EBs por poço em placas de cultura de células de baixa aderência de seis poços. Adicione três CHIR99021 micromolares ou IWP2 para especificar progenitores hematopoéticos definitivos ou primitivos, respectivamente. Incube a placa em uma incubadora multigás de 37 graus Celsius por 30 horas.

Após 30 horas, isolar os EBs com uma pipeta sorológica de dois mililitros, transferindo-os para um tubo cônico de 50 mililitros e centifugando-os a 330 x G por cinco minutos. Ressuspenda suavemente os EBs e lave-os com 10 mililitros de IMDM. Ressuspenda os EBs no meio do dia três e dispense dois mililitros em cada poço de placas de seis poços de baixa aderência.

Incube as células em uma incubadora multigás de 37 graus Celsius por 72 horas. Após 72 horas de incubação, adicione dois mililitros de Day Six Media a cada poço. Em seguida, incube os EBs em uma incubadora multigás de 37 graus Celsius por mais 48 horas.

Isole os EBs tratados com CHIR99021 no oitavo dia de diferenciação e prossiga para a próxima seção. Centrifugar os EBs a 330 x G durante cinco minutos. Aspire o sobrenadante.

Em seguida, adicione dois mililitros de 0,25% de tripsina EDTA aos EBs. Vortex os EBs por cinco segundos e incube os Ebs em banho-maria a 37 graus Celsius por oito minutos. Em seguida, adicione cinco mililitros de solução de parada e centrifugue os EBs.

Em seguida, aspire o sobrenadante. Ressuspenda os EBs em cinco mililitros de colagenase II. Vortex o tubo por cinco segundos e, em seguida, incube os EBs em banho-maria a 37 graus Celsius. Após 60 minutos, vórtice os EBs por cinco segundos e adicione cinco mililitros de solução de parada.

Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células num mililitro de tampão FACS. Passe as células por um filtro de células de 40 mícrons para remover aglomerados de células não dissociadas. Prossiga com a marcação de anticorpos e o isolamento FACS de progenitores endoteliais hemogênicos CD34-positivos.

Após o isolamento do FACS, ressuspenda as células no meio HE. Distribua as células em alíquotas de 50 microlitros em uma placa de cultura de baixa aderência de 96 poços e, em seguida, incube as células durante a noite. Na manhã seguinte, os progenitores hematopoiéticos devem se agregar em aglomerados de seis a dez células.

Transfira suavemente os volumes de 50 mirolitros de células reagregadas para o centro de uma placa codificada por MAT de 24 poços. Coloque suavemente a placa na incubadora multigás por quatro a seis horas até que as células estejam conectadas. Após quatro a seis horas, para permitir que as células se fixem, adicione lentamente um mililitro de meio HE recém-preparado a cada poço.

Incube as células na incubadora multigás até que as células hematopoéticas sejam visíveis. Em seguida, colha os progenitores hematopoéticos definitivos, removendo suavemente o meio HE das células e passando por um filtro de células de 40 mícrons para coletar o fluxo. Para as células aderentes restantes, adicione 0,5 mililitros de EDTA de 0,25% de tripsina às células e incube-as em uma incubadora de 37 graus Celsius por cinco minutos.

Após a tripsinização, adicione 0,5 mililitros de solução de parada a cada poço. Passe as células pelo mesmo filtro de células de 40 mícrons para agrupar todas as células aderentes e não aderentes e girar as células. Adicione 2.000 a 10.000 células isoladas FACS a um poço das células OP9 DL4 em meio OP9.

Incube em uma incubadora de 37 graus Celsius, 5% de CO2. Para passar as células a cada quatro a cinco dias, triture as células com uma pipeta de um mililitro. Passe por um filtro de 40 mícrons para remover grumos.

Após centrifugação, aspirar o meio. Ressuspenda as células em dois mililitros de meio de células T frescas e coloque-as em células OP9 DL4 novas. Após pelo menos 21 dias de cultura a frio, triturar as células vigorosamente e passar por um filtro de 40 mícrons para remover os detritos celulares.

Centrifugar a 330 x G durante cinco minutos, aspirar o sobrenadante e, em seguida, continuar com a citometria de fluxo padrão. A citometria de fluxo mostra que as culturas de diferenciação tratadas com IWP2 produzem uma população distinta de CD34 positivo, CD43 negativo e CD34 baixo CD43 positivo. Enquanto as culturas de diferenciação tratadas com CHIR têm menos de 1% de células positivas para CD43 no oitavo dia de diferenciação.

Progenitores hematopoiéticos primitivos derivados em condições IWP2 isoladas no nono dia darão origem a progenitores eritróides e mielóides predominantemente primitivos nos ensaios de metilcelulose. A população CD34 positiva CD43 negativa derivada do tratamento CHIR99021 é uma população heterogênea contendo progenitores endoteliais, bem como endotélio hemogênico CD34 positivo, CD43 negativo, CD73 negativo, CD184 negativo, que quando isolado por FACS formará inicialmente uma monocamada de células endoteliais que então sofrem uma transição endotelial para hematopoiética, resultando em endotélio redondo, refratário, células hematopoiéticas não aderentes. Essas células hematopoiéticas podem ser avaliadas por citometria de fluxo para a expressão de CD34 e CD45.

Os progenitores hematopoiéticos isolados dos ensaios EHT podem ser usados em ensaios de metilcelulose e dão origem a grandes unidades formadoras de colônias eritroides, semelhantes a explosões, pequenas unidades formadoras de colônias eritróides e progenitores mieloides. Essas análises representativas de citometria de fluxo do potencial de ensaios de linfócitos T de progenitores hematopoiéticos CD34 positivos, CD43 negativos, CD73 negativos, CD184 negativos derivados de CHIR99021, CD184 negativos e CD34 positivos e CD34 negativos derivados de IWP2 mostram a presença de uma população CD45 positiva, CD56 negativa, CD4 positiva, CD8 positiva em progenitores derivados de CHIR, indicativos do potencial hematopoiético dentro da população CD34 positiva de entrada. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como diferenciar células-tronco pluripotentes humanas em uma quantidade primitiva ou definitiva de progenitores hematopoiéticos.