O campo local microscopia de fluorescência: Geração de sinais de celular em corações intactos
8 de março de 2017
No coração, os eventos moleculares coordenar a função contráctil e eléctrica do órgão. Um conjunto de técnicas de microscopia de fluorescência de campo locais aqui apresentadas permite a gravação de variáveis de celular em corações intactos. Identificação de mecanismos que definem a função cardíaca é fundamental na compreensão de como o coração trabalha em situações patológicas.
O objetivo geral desta técnica de imagem de microscopia de fluorescência de campo local é usar sondas moleculares para medir os níveis de cálcio intracelular ou potenciais de membrana de regiões cardíacas de difícil acesso em todo o nível do coração. Este método pode nos ajudar a responder às principais questões cardiovasculares relacionadas à parada cardíaca e isquemia. A principal vantagem dessa técnica é que as propriedades cardíacas são medidas a partir de eventos celulares no órgão intacto, onde as células continuam a ser acopladas elétrica, mecânica e metabolicamente.
Primeiro, prepare o aparelho de Langendorff horizontal. Carregue a solução de Tyrode recém-preparada nas seringas de 60 mililitros e adicione todos os tubos associados da configuração. Depois de preenchido, elimine todas as bolhas de ar.
Em seguida, equilibre a solução carregada com gás oxigênio puro fornecido por uma pedra de ar de plástico submersa. Em seguida, coloque uma sutura cirúrgica não absorvível ao redor de uma agulha. Isso servirá como uma cânula para retroperfundir o coração quando conectado ao aparelho.
Em seguida, colete o coração após injetar heparina e sacrificar o animal. Primeiro, limpe o peito com etanol. A demonstração é com um rato, mas o mesmo procedimento funciona para a colheita do coração do periquito.
Em seguida, usando uma tesoura de dissecação, faça uma incisão na parte inferior do abdômen e, em seguida, corte as laterais em direção ao pescoço. Em seguida, abra cuidadosamente o diafragma, evitando o coração. Agora, puxe o tecido cortado para trás e prenda-o.
Em seguida, remova os pulmões e os tecidos circundantes para expor o coração. Uma vez exposto, use uma pinça para retirar o coração sem apertá-lo. Separe-o do animal cortando a aorta e deixe o máximo possível de aorta presa ao coração.
Em seguida, carregue o coração em um pequeno barco de pesagem com um mililitro de solução de Tyrode. Sob um microscópio de dissecação, remova rapidamente o sangue e o tecido adiposo ao redor do coração usando uma pinça e uma tesoura. Usando uma sutura cirúrgica inabsorvível e uma agulha, prenda a aorta à conexão horizontal do aparelho de Langendorff.
Prenda o nó usando duas pinças finas. Em seguida, inicie a retroperfusão abrindo a válvula para liberar a solução de Tyrode. Limpe o tecido circundante e aspire os detritos para manter a câmara horizontal limpa enquanto o coração se estabiliza por 10 minutos.
Faça o corante fresco. Para Rhod-2 AM, adicione 20 microlitros de 20% Pluronic e DMSO ao pacote de 50 microgramas de corante do fabricante. Misture pipetando, evitando bolhas.
Em seguida, transfira o corante liquefeito para um frasco de vidro transparente e adicione um mililitro de solução de Tyrode. Dissolva completamente o corante nesta mistura usando 15 a 20 minutos de sonicação. Em seguida, perfunda o corante preparado usando uma bomba peristáltica em temperatura ambiente.
Primeiro, carregue o corante na câmara de tingimento e, em seguida, prenda todas as linhas de tubulação conectadas ao coletor e mantenha os grampos acima do coletor para evitar o refluxo. Em seguida, ligue a bomba e feche imediatamente a válvula de três vias abaixo da seringa de 60 mililitros. Posicione o pequeno tubo preso à extremidade de sucção da bomba ao lado do coração para recircular o corante depois de ter sido perfundido.
Pegue uma agulha de calibre pequeno e aperte-a através do ápice para aliviar a pressão. Em seguida, deixe o coração perfundir com corante por 30 minutos. Durante esse período, é muito importante avaliar o nível do corante para que as bolhas não entrem no tecido, o que causaria isquemia e danos aos tecidos.
Depois de perfundir o corante, retroperfundir o coração com a solução de Tyrode. Remova o clamp acima do coletor. Abra a válvula e deixe o coração se estabilizar por 10 minutos.
Durante a retroperfusão, encha a câmara horizontal com solução de Tyrode e ligue a unidade Peltier para levar a temperatura do banho a 37 graus Celsius. Para preparar a luz de fibra óptica para o experimento, primeiro coloque a fibra óptica dentro de uma pipeta de dois mililitros. Em seguida, conecte a pipeta a um micromanipulador.
Use o micromanipulador para pressionar levemente a fibra óptica contra a superfície do ventrículo lateral. Em seguida, programe um gerador de ondas para fornecer um pulso quadrado com uma largura de um milissegundo. E defina um estimulador cardíaco para ser sincronizado externamente e conectado ao gerador de ondas.
Em cada uma das duas saídas do estimulador, conecte um fio com uma agulha de acupuntura soldada na extremidade. Prenda duas agulhas de acupuntura no ápice do coração, a cerca de três milímetros de distância. Somente depois que as agulhas forem colocadas, inicie o estimulador, evitando choques acidentais.
Agora, para registrar o sinal epicárdico, ajuste a frequência de aquisição no software para 10 kilohertz. Para coletar o sinal endocárdico, siga o mesmo procedimento, mas use uma agulha de calibre 23 para fazer um orifício no ventrículo lateral próximo ao septo. E então, usando um micromanipulador, posicione a segunda fibra óptica no endocárdio.
Para acessar a função transmural, a morfologia dos potenciais de ação registrados no endocárdio e no epicárdio foi comparada. Os registros de fluorescência foram feitos após o tratamento do coração com di-8-ANEPPS usando a técnica CLFFM. O potencial de ação foi mais lento no endocárdio, particularmente na fase um.
A duração do potencial de ação foi descrita como o tempo que leva para o potencial de ação se repolarizar até certo ponto. Quando as durações foram normalizadas e deslocadas para se sobrepor na fase zero, elas puderam ser comparadas. Houve de fato uma diferença significativa durante a primeira fase.
Em seguida, o Rhod-2 AM foi usado para monitorar o cálcio intracelular. Para comparar as diferenças regionais no cálcio intracelular, a cinética da transitoriedade do cálcio foi avaliada. Em comparação, o tempo para o pico da transitoriedade foi cerca de dois milissegundos maior no endocárdio.
No geral, a transitoriedade do cálcio do endocárdio teve uma cinética significativamente mais lenta do que o epicárdio. Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para registrar a transitoriedade do cálcio intracelular e os potenciais de ação em regiões de difícil acesso no coração. A parte de Langendorff da configuração torna muito prático perfundir diferentes produtos químicos no coração e avaliar os efeitos nas propriedades cardíacas.
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Visão Geral
Este artigo apresenta uma técnica de microscopia de fluorescência de campo local para medir os níveis intracelulares de cálcio e potenciais da membrana no coração. Este método permite a investigação da função cardíaca em órgãos intactos, essencial para compreender condições como parada cardíaca e isquemia.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Fisiologia cardiovascular
- Microscopia de fluorescência
- Técnicas de imagem celular
Contexto
- Compreender a função cardíaca é essencial para abordar doenças do coração.
- Os métodos tradicionais podem não acessar todas as regiões do coração de forma eficaz.
- A microscopia de fluorescência de campo local oferece uma abordagem inovadora para estudar células cardíacas.
- Essa técnica mantém a integridade do acoplamento celular no coração.
Objetivo do Estudo
- Medir o cálcio intracelular e os potenciais da membrana no coração.
- Explorar os mecanismos da função cardíaca em condições patológicas.
- Fornecer insights sobre eventos cardiovasculares como parada cardíaca e isquemia.
Métodos Utilizados
- Preparação do aparelho Langendorff horizontal.
- Carregamento da solução de Tyrode em seringas.
- Eliminação de bolhas de ar do sistema.
- Utilização de sondas moleculares para medições.
Resultados Principais
- Medição bem-sucedida de variáveis celulares em corações intactos.
- Demonstração da eficácia da técnica no acesso a regiões de difícil alcance.
- Conhecimentos obtidos sobre as propriedades elétricas e mecânicas das células cardíacas.
- Aplicações potenciais no entendimento de patologias cardíacas.
Conclusões
- A técnica de microscopia de fluorescência de campo local é valiosa para a pesquisa cardíaca.
- Este método aprimora nossa compreensão da função cardíaca na saúde e na doença.
- Estudos futuros podem aproveitar esta técnica para obter insights mais profundos sobre a saúde cardiovascular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microscopia de fluorescência de campo local permite a medição de cálcio intracelular e potenciais de membrana em corações intactos, preservando o acoplamento celular essencial para o entendimento da isquemia e das arritmias. Esta abordagem auxilia na validação de alvos ao fornecer dados fisiologicamente relevantes de tecidos eletrica e mecanicamente acoplados, aumentando a confiança preditiva em modelos pré-clínicos. A técnica facilita a redução de riscos mecanicistas ao vincular sinais moleculares à função de órgão inteiro na pesquisa de doenças cardiovasculares.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas mediante a medição de transientes de cálcio e potenciais de ação no miocárdio intacto sob acoplamento fisiológico.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos em sistemas relevantes para doenças, onde modelos de células isoladas não conseguem capturar a dinâmica em nível tecidual.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao identificar compostos que normalizam a cinética intracelular de cálcio nas regiões endocárdica e epicárdica.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para triagem subsequente, estabelecendo sinais de fluorescência de referência em corações perfundidos.
- Saída Quantitativa: Gera medições reprodutíveis da cinética dos transientes de cálcio e da duração do potencial de ação para avaliação do efeito de compostos.
- Reutilização da Plataforma: Permite escalabilidade entre modelos de roedores por meio da perfusão Langendorff, possibilitando a aquisição consistente de sinais em cascatas de triagem cardiovascular.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela mecanismos de isquemia e arritmia por meio do monitoramento de diferenças regionais no manuseio de cálcio e repolarização em corações intactos.
- Continuidade Translacional: Conecta a descoberta e a validação pré-clínica ao manter o acoplamento eletrotônico e metabólico durante intervenções farmacológicas.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Orienta critérios de avanço por meio de alterações quantificáveis na morfologia do potencial de ação e na transitoriedade de cálcio em tecido doente versus tratado.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se aos fluxos de trabalho de descoberta cardiovascular, desde a investigação inicial do alvo até a validação pré-clínica, apoiando a identificação de compostos líderes mediante a entrega de dados de sinalização contextualizados fisiologicamente.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a medição de cálcio específica por compartimento (citossólica versus retículo sarcoplasmático) e potencial de membrana em tecido intacto.
- Triagem: Fornece preparações prontas para ensaio com leituras de fluorescência estáveis para avaliar os efeitos de compostos sobre a eletrofisiologia cardíaca e o manuseio de cálcio.
- Análises: Fornece variáveis dependentes quantitativas, incluindo o tempo até o pico da transiente de cálcio, duração do potencial de ação e métricas de repolarização por fase específica, para comparação entre grupos.
- Pesquisa Translacional: Conecta medições moleculares à função de órgão inteiro, permitindo o alinhamento de biomarcadores em modelos pré-clínicos de disfunção cardíaca.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliação de risco cardiovascular em diferentes áreas terapêuticas por meio de detecção fluorescente padronizada baseada no método Langendorff.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao correlacionar sinais subcelulares com a fisiologia intacta do órgão em modelos de doenças cardiovasculares.
- Valor Operacional: Garante a reprodutibilidade por meio do carregamento padronizado de corantes, perfusão e posicionamento de fibras ópticas no sistema Langendorff.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de prosseguir/interromper ao identificar precocemente falhas eletrofisiológicas e no manuseio de cálcio antes de falhas dispendiosas em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base na normalização da cinética do potencial de ação e dos transientes de cálcio em corações doentes versus recuperados.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação cardíaca, perfusão Langendorff e preparação de corantes fluorescentes (por exemplo, Rhod-2 AM, di-8-ANEPPS).
- Depende de um sistema de microscopia com fibra óptica, geradores de onda para estimulação e sistemas de aquisição de alta frequência (10 kHz).
- Necessita padronização interdisciplinar entre equipes de fisiologia, imagem e farmacologia para garantir consistência do sinal.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes espécies (camundongo, periquito) e regiões ventriculares (epicárdio, endocárdio) ao medir gradientes transmurais.
- Limitado pela eficiência da carga do corante e artefatos de movimento durante a perfusão, os quais devem ser controlados para evitar isquemia ou corrupção do sinal.
