Name: O campo local microscopia de fluorescência: Geração de sinais de celular em corações intactos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprenda microscopia de fluorescência de campo local para medir cálcio intracelular e potenciais de membrana em corações intactos. Esta técnica preserva o acoplamento elétrico e metabólico das células cardíacas.

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Agradecemos ao Dr. Alicia Mattiazzi para a discussão crítica do trabalho apresentado. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do NIH (R01 HL-084487) para ALE.

Este protocolo e todo o tratamento ratos foi aprovado pelo Comitê Animal Care Institucional e Use a UC Merced (No. 2008-201). Experimentos com periquitos foram realizadas em 1999, de acordo com as condições gerais do uso de animais estabelecida pela comissão científica do Instituto Venezuelano de Pesquisas Científicas (IVIC). 1. Langendorff Set Up Preparação <ol><li> Preparar a solução de Tyrode contendo as seguintes concentrações de soluto em mM: 140 de NaCl, 5,4 de KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 0,33 Na 2 HPO 4, 10 de glucose, 10 de HEPES. Ajuste o pH da solução de Tyrode a 7,4 com NaOH e filtra-se a solução através de um filtro de 0,22 um. </li><li> Carregar a solução de Tyrode para as seringas 60 mL e toda a tubagem de Langendorff o plano horizontal definido 11, 12 ilustradas na Figura 4. Certifique-se de eliminar todas as bolhas de ar. </li><li><strong&gt; Equilibrar solução de Tyrode com 100% de O2 usando um &quot;pedra de ar&quot; plástico submerso tal como ilustrado na Figura 4. <ol><li> Ligar a tubagem de plástico para um tanque de O2. </li><li> Adicionar um adaptador T de plástico para reduzir a &quot;tubo 5 na solução de Tyrode na seringa de 60 mL. </li><li> Anexar uma pedra de ar de plástico para o fim do &quot;tubo 5 de modo O2 vai borbulhar para dentro da solução de Tyrode. </li></ol></li><li> Coloque uma sutura cirúrgica não absorvível em torno de uma agulha usada como uma cânula. A agulha é acoplado ao colector (ver Figura 4) que permite que retro-perfusão com soluções diferentes. Finalmente, aorta do coração vai ser transferida por cânula para a agulha. </li></ol> 2. Preparação Animal e Coração Dissecção <ol><li> Pesar e injetar o mouse com heparina (ex. Rato de peso de 20 g, injetar com 20 unidades ou 200 ul) 15 min antes da eutanásia por deslocamento cervical. Anestesiar periquitos de acordo com to guias uso de animais de seu protocolo IACUC e então prosseguir com deslocamento cervical. NOTA: Use 8 semanas ratos velhos ou 20 g de periquitos. </li><li> Tiraram o coração do interior da cavidade torácica após a eutanásia. Extrair corações parakeet exactamente da mesma maneira como descrito para os ratos. <ol><li> Limpe o peito do rato com etanol. </li><li> Com uma tesoura de dissecção, fazer uma incisão no abdômen inferior e, em seguida, cortar os lados em direção ao pescoço. </li><li> Puxe o tecido cortado e fixá-lo. </li><li> Cortar o diafragma. Tenha cuidado ao cortar o diafragma para evitar danificar o coração. </li><li> Remover os pulmões e do tecido circundante. </li><li> Use uma pinça para colher o coração sem apertar. Cortar a aorta tanto tempo quanto possível. </li></ol></li><li> Transportar o coração em um pequeno pesar barco com cerca de 1 mL de solução de Tyrode. </li><li> Usando uma sutura cirúrgica não absorvível, amarrar a aorta para o aparelho de Langendorff horizontal através de umagulha. Amarre a aorta do coração com o auxílio de duas pinças finas. Comece retro-perfusão através da abertura da válvula situado em série com as seringas de 60 ml contendo solução de Tyrode. </li><li> Permitir que o coração estabilizar durante 10 min. Use esse tempo para limpar o sangue e o tecido gordo em torno do coração antes do carregamento do corante. Puxar o tecido adiposo perto da base do coração com pinças e cortadas usando pequenas tesouras de dissecação. Certifique-se de fazer isso sob o ponto de vista de um microscópio de dissecação. </li></ol> 3. Ca citosólico 2 + Medidas: Preparando Dye Rhod-02:00 <ol><li> Adiciona-se 20 uL da plurónico a 20% (um agente tensioactivo não-iónico) em DMSO para um frasco de plástico embalados especial fornecida pelo fabricante de corante contendo 50 g do corante. </li><li> Misturar por pipetagem cima e para baixo, evitando bolhas. </li><li> Transferir o DMSO misturado com o agente tensioactivo não iónico e do corante a partir do frasco de plástico embalados especial para um frasco de vidro transparente. Adicionar 1 ml de Tyrode solução para o frasco de vidro transparente. </li><li> Sonicar durante 15-20 min num sonicador de banho. </li><li> Perfundir o corante utilizando bombas peristálticas durante 30 min à temperatura ambiente. <ol><li> Coloque o corante na câmara de corante. </li><li> Usar um grampo mecânico para comprimir todas as outras linhas de tubos ligados ao colector. O grampo é colocado acima do colector. Isto irá evitar qualquer refluxo para a tubagem ligada para as seringas de 60 ml. </li><li> Ligar a bomba peristáltica para começar a perfusão de circulação do corante. Imediatamente fechar a válvula de 3 vias abaixo da seringa de 60 mL. </li><li> Posicionar um pequeno tubo que está ligado à bomba peristáltica de sucção ao lado do coração para recircular o corante que tenha sido perfundidos no coração. </li></ol></li></ol> 4. Intra-SR Ca 2+ Medidas: Preparando Dye Mag-Fluo4AM <ol><li> Prepara-Mag Fluo4AM da mesma maneira como Rhod-02:00. Consulte a seção 3 para obter instruções passo a passo. </li><li> afteR carregamento do corante, abrir a válvula situada em série com as seringas de 60 ml contendo solução de Tyrode para começar a retro-perfusão. Certifique-se de remover o grampo acima do colector. </li><li> Adicionar solução de Tyrode com a câmara horizontal e aquecer até 37 ° C. </li><li> Retro-aspergir com solução de Tyrode durante 45 minutos para remover o corante citosólica. </li></ol> 5. potencial de membrana Medidas: Preparando Dye Di-8-ANEPPS <ol><li> Adicionar 5 ml de etanol a 99% para o frasco de tinta que contém 5 mg de corante. </li><li> Alíquota de 10 uL em 500 frascos de plástico 1 mL individuais utilizando uma pipeta de repetidor. </li><li> Desidratar no vácuo velocidade e armazenar a -20 ° C. </li><li> Adicionar 20 uL de 20% de Pluronic em DMSO para um frasco de plástico com 10 ^ g do corante dessecada. </li><li> Misturar por pipetagem cima e para baixo, evitando bolhas. </li><li> Transferir a mistura contendo DMSO com Pluronic e corante a partir do tubo de plástico a um cilindro graduado (10 mL). Adicionar uma solução de Tyrode a VO definitivalume de 5 mL. </li><li> Sonicate para 20-25 min num sonicador de banho. </li><li> Perfundir para o coração durante 30 minutos utilizando bombas peristálticas. Consulte as instruções passo a passo na Seção 3.5. </li></ol> 6. Gravar sinais epicárdicas <ol><li> Após o carregamento do corante, retro-perfundir o coração com solução de Tyrode, removendo o grampo por cima do colector. Abrir a válvula situada em série com a seringa de 60 ml contendo solução de Tyrode. solução de Tyrode-rociar retro durante 10 minutos para estabilizar o coração. </li><li> Encher a câmara horizontal com solução de Tyrode e ligar o aparelho de Peltier para trazer a temperatura do banho para 37 ° C. </li><li> Posicionar a fibra óptica na superfície do coração. <ol><li> Coloque a fibra óptica dentro de uma pipeta de 2 ml e em seguida, anexar a pipeta para um micromanipulador. </li><li> Use o micromanipulador para pressionar ligeiramente o fibra óptica contra a superfície do VE. </li></ol></li><li> Externamente andar pelo heata com um estimulador controlado por um gerador de ondas. <ol><li> Programar o gerador de onda para fornecer um impulso quadrado com uma largura de 1 ms. </li><li> Defina o estimulador para ser sincronizado externamente e ligar a entrada externa para o gerador de onda. </li><li> Para cada uma das saídas do estimulador, ligar um fio com uma agulha de acupunctura soldada no final. </li><li> Coloque as duas agulhas de acupuntura no ápice do coração aproximadamente 3 mm de distância um do outro. </li><li> Só depois de as agulhas são colocadas no tecido, ligar a saída do estimulador para evitar o choque eléctrico. </li></ol></li><li> No software de aquisição, ajustar a frequência de aquisição até 10 kHz. </li></ol> 7. Gravar sinais endocárdicos <ol><li> Consulte a etapa 6,1 e 6,2 para estabilizar o coração após o carregamento do corante. </li><li> Utilizando um ponto afiado 23Ga sobre o tamanho da fibra óptica, faça um pequeno orifício na superfície do coração no ventrículo esquerdo perto do septo. </li> &lt;li&gt; Coloque um adaptador cirurgia esclerotomia intravítrea para auxiliar no posicionamento da primeira fibra óptica no endocárdio usando um micromanipulador. </li><li> Externamente ritmo do coração. Consulte o passo 6.4. </li><li> Em software de aquisição, ajustar a frequência de aquisição até 10 kHz. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Este artigo é centrada em descrever as técnicas de fluorescência de campo locais para avaliar a função dos miócitos cardíacos ex vivo. O estudo destas células em um ambiente acoplado é não só mais fisiológico, mas também é altamente adequada para a avaliação de nível patologias de órgãos. Os eventos celulares subjacentes acoplamento de excitação-contracção (ECC) pode ser avaliado em todo o nível do órgão com o uso de sondas moleculares que monitoram Ca2 + intracelular dinâmica (Rhod 2 citosólica <sup...

O coração é o órgão central do sistema cardiovascular. A contracção do coração é iniciado por um aumento intracelular [Ca2 +]. A relação entre a excitabilidade elétrica e as mudanças no intracelular liberação de Ca2 + tem sido historicamente estudado em células enzimaticamente dissociada 1, 2. No entanto, as células cardíacas estão electricamente, metabolicamente e mecanicamente acoplada 3, 4. Quando isolado, os miócitos não são só fisicamente desacoplado, mas miócitos de diferentes camadas são misturados durante a dissociação 5. Além disso, apesar das enormes vantagens que surgiram a partir do estudo de células isoladas, sob condições de fixação de tensão, 6, 7, 8 a natureza intrínseca do coração como um alwa sincício elétricays coloca a questão de como funcionalmente diferentes são células dissociadas das presente no tecido 3. Neste artigo, descrevemos os avanços obtidos no conhecimento da fisiologia cardíaca através da utilização de técnicas de microscopia de fluorescência de campo locais (LFFM) no coração intacto. LFFM utiliza indicadores fluorescentes para medir múltiplas variáveis fisiológicas, como citosólica de Ca2 +, intra retículo sarcoplasmático (RS) Ca 2+ e potencial de membrana. Estas medições podem ser obtidos simultaneamente e em conjunto com a pressão ventricular 9, 10, eletrocardiogramas 9, potenciais de ação elétricos (APs), gravações atuais iónicos e fotólise de compostos enjaulados 4, 11. Além disso, estas medidas podem ser obtidas pelo ritmo do coração intacto em frequências mais altas pertor para taxas fisiológicas. Apesar de vários artigos 9, 11, 12, 13, 14 foram publicados pelo nosso grupo usando técnicas LFFM, a presunção de complexidades técnicas associadas com esta técnica tem impedido a sua utilização maciça em estudar fenômenos fisiológicos ex vivo no coração e outros órgãos. A técnica LFFM (Figura 1) é baseado em medidas epifluorescência obtidos usando uma fibra óptica multimodo em contacto com o tecido. Como qualquer técnica de imagiologia de fluorescência de contacto, a resolução óptica depende do diâmetro e a abertura numérica (NA) da fibra. Um diâmetro maior e menor de NA da fibra irá aumentar a resolução espacial das medições. AEs e diâmetro das fibras pode variar 0,22-0,66 e de 50 um a 1 mm, respectivamente. Dentrovincar a AN irá melhorar a relação sinal-ruído (S / N), aceitando fotões que chegam a partir de um ângulo sólido maior. A fim de actuar como um dispositivo de epifluorescência, o feixe de luz é focado na fibra óptica com uma lente asférica ou um objectivo epifluorescência onde a NA da lente e o fósforo de fibra. Esta correspondência maximiza a transferência de energia para a excitação e para recolher de volta os fótons emitidos pelo fluoróforo. A fim de excitar os indicadores fluorescentes exógenos carregados no tecido, diferentes fontes de luz e modos de iluminação pode ser utilizada. Nossos estudos pioneiros utilizando a microscopia pulsada de campo local de fluorescência 3, 12 (PLFFM) empregue um laser low-cost de picossegundos (Figura 1a, PLFFM). Este tipo de fonte de luz tem a enorme vantagem de excitar uma grande fracção de moléculas fluoróforo sob a área de iluminação, sem branqueamento substancialmente o corante devidoao pulso curto durações 12. Além disso, a utilização de impulsos ultracurtos permitiu a avaliação do tempo de vida de fluorescência do corante 12. O tempo de vida de fluorescência é uma propriedade que pode ser utilizada para quantificar a fracção de moléculas de corante ligado ao Ca2 +. Infelizmente, a tremulação temporal dos pulsos e das variações na amplitude de impulso-para-impulso de limitar a aplicação desta estratégia experimental para casos em que a alteração na fluorescência produzida pela ligação com o ligando corante é grande. Onda contínua (CW) lasers são usados geralmente como a principal fonte de iluminação em LFFM (Figura 1b, CLFFM). O feixe de laser pode continuamente iluminar o tecido ou pode ser modulado ferroelectrically. A modulação ferroeléctrica do feixe permite a geração de impulsos de luz microssegundos. Esta modulação pode ser controlada pelo hardware externo. Este procedimento não só reduz drasticamente tele jittering temporal dos pulsos de luz, mas também permite misturar vigas de diferentes comprimentos de onda. A mistura de vigas é feito por multiplexagem de diferentes raios laser. Como consequência, vários corantes possuindo diferentes propriedades espectrais pode ser animado para realizar medições de uma variedade de variáveis fisiológicas, por exemplo, Rhod-2 para o Ca2 + citosólico, MagFluo4 para administração intra-SR Ca 2+ e di-8-ANEPPS para potencial de membrana. Embora lasers apresentam várias vantagens como a fonte de luz em LFFM, outros tipos de fontes de luz podem ser utilizados, incluindo díodos emissores de luz (LEDs). Neste caso, a fonte de luz de excitação consistiu de um LED InGaN (Figura 1c, PLEDFM). Em LEDs, os fótons são espontaneamente emitida quando elétrons da banda de condução recombinar com furos na banda de valência. A diferença com lasers de estado sólido é que a emissão não é estimulada por outros fotões. Isto resulta num feixe coerente e não-uma emissão espectral mais amplo para os LEDs. Podem ser usados ​​diferentes tipos de LEDs de alta potência. Para as gravações PA usando Di-8-ANEPPS e para Ca 2+ transientes registados utilizando Fluo-4 ou MAG-Fluo-4, utilizou-se um diodo emissor de luz que tem um pico de emissão a 485 nm típico (azul) e uma meia largura de 20 nm (Figura 1D). Para Ca 2 + transientes gravados com Rhod-2, o LED teve um pico de emissão típica a 540 nm (verde) e uma meia largura de 35 nm (Figura 1d). LEDs emitem em um comprimento de onda de banda e, portanto, exigem filtros para reduzir sua emissão espectral. Além disso, a luz pulsada pode ser gerado a uma taxa de 1,6 kHz com duração de 20 uS. Os LEDs foram pulsadas com uma potência MOSFET de efeito de campo transistor rápido. gravações em simultâneo com diferentes indicadores pode ser realizada por tempo-de multiplexação os LEDs. Infelizmente, a luz emitida pelos LEDs é mais difícil de foco para uma fibra óptica em relação a um feixe de laser. Assim, a principal desvantagem de nósing LEDs é que os seus perfis de emissão têm deslocamentos angulares (± 15 °) em relação ao eixo principal, e uma óptica auxiliar deve ser usada para corrigir o problema. Em todas as configurações ópticas anteriormente descritos, a luz de excitação é reflectida com a ajuda de um espelho dicróico. O feixe é subsequentemente focada por uma lente asférica e uma objectiva de microscópio sobre uma fibra óptica multimodo que é posicionada sobre o tecido. Como em qualquer arranjo de epifluorescência, o espelho dicróico também serve para separar a excitação da luz emitida. O espectro de luz emitida viaja de volta através de um filtro de barreira para remover qualquer excitação reflectida. Por fim, a luz emitida é focada, com uma objectiva para um fotodetector (Figura 1). A transdução de luz a corrente eléctrica é feita pelos fotodíodos de avalanche de silício. Estes diodos têm uma resposta rápida e uma alta sensibilidade permitindo a detecção de pouca luz. ofotocorrente produzida pelos fotodiodos de avalanche pode ser amplificado em duas formas: um amplificador de transimpedância resistiva tendo um elemento de retorno (Figura 1e) ou por um integrador para converter a corrente em tensão (Figura 1F). Usando o primeiro método, a tensão de saída é proporcional à fotocorrente e a resistência de realimentação. Um exemplo típico de detecção resistiva de pulsos de laser de picossegundos é mostrado nas Figuras 2a, 2b e 2c. Painel 2a ilustra a saída do amplificador de transimpedância e o painel 2b mostra uma expansão no tempo do intervalo indicado com um asterisco (*). Um algoritmo de rastreamento de pico foi implementada para detectar o pico (vermelho) e a base (verde) para as respostas fluorescentes 12. A medição da fluorescência de base fornece informações tanto da corrente escura do fotodiodo avalanche e as interferências introduzido por lig ambienteht e acoplamento electromagnético. Uma representação de picos e bases é mostrado na Figura 2c. Esta figura ilustra a fluorescência emitida pelo corante (Rhod-2) ligado ao Ca2 + durante o ciclo cardíaco de um coração a bater periquito. No segundo método, a tensão de saída do integrador é uma função de realimentação de corrente e capacitiva (Figuras 2d, 2e, 2f). Figura 2f mostra dois ciclos de integração consecutivos: o primeiro sem iluminação exterior eo segundo com pulsos de luz aplicada a partir de um diodo emissor de luz pulsada. Uma descrição detalhada é apresentada nas Figuras 2G e 2H. Esta abordagem, apesar de mais laborioso, proporciona uma maior S / N devido à ausência de ruído térmico no condensador de realimentação. O instrumento inclui um estágio de tempo que gera todo o controle e multiplexação da luz de excitação e comanda a integração headstage e resperíodos et. Esta é normalmente realizada com um circuito de processamento de sinal digital que executa também uma diferenciação digital do sinal de saída integrado calculando uma regressão on-line dos dados. No caso de se utilizar um gabarito resistiva, qualquer de A / D placa de aquisição pode ser usado. Finalmente, a técnica LFFM é altamente versátil e pode ser adaptado para gravar a partir de mais do que uma região. Adicionando um divisor de feixe no caminho da luz nos permite dividir a luz em duas fibras ópticas. Cada fibra óptica pode então ser colocado em diferentes regiões de tecido para um, independentemente, excita e emissão ficha das sondas fluorescentes exógenos. Esta modificação permite-nos avaliar como anatômica diferenças regionais influenciam variáveis ​​fisiológicas. A Figura 3 mostra um separador de feixe a ser utilizado para separar a luz de excitação CW de tal modo que duas fibras ópticas são utilizados para medir transmural intracelular eléctrica ou [Ca 2+] níveis with minor-invasivo. transmurais sinais podem ser gravados pela colocação de uma fibra no endocárdio e a outra na camada epicárdio da parede ventricular. Portanto, a técnica LFFM tem a capacidade de medir o curso de tempo dos sinais celulares em diferentes regiões e pode ser utilizado para testar se as alterações regionais ocorrer em situações patológicas.

<table><tbody><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glicose</td><td>Sigma</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio</td><td>Sigma</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Solução de cloreto de cálcio</td><td>Sigma</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>Solução de cloreto de magnésio</td><td>Sigma</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma</td><td>S-8045</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &mu; Filtro de Membrana de Nylon M</td><td>Whatman</td><td>7402-004</td><td></td></tr><tr><td>Manifold MPP</td><td>Warner</td><td>64-0216&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>21G1.5 Agulha de deslizamento de precisão</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Corda de seda trançada preta (sutura cirúrgica não absorvível)</td> <td>AllMech Tech</td><td>LOOK-SP105</td><td></td></tr><tr><td>Injeção de heparina sódica 1000USP / mL</td><td>AllMech Tech</td><td>NDC63323-540-11</td><td></td></tr><tr><td>DMSO D8779</td><td>Sigma</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Sigma</td><td>856925-71-8</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 Solução a 20%</td><td>Biotium</td><td>59004</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica Materflex C/L</td><td>Cole-Parmer</td><td>77122-26</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador Isostim</td><td>World Precision Instruments</td><td>A320RC</td><td></td></tr><tr><td>Gerador de forma de onda</td><td>Teledyne Lecroy</td><td>WaveStation 2012</td><td></td></tr><tr><td>Limpador ultrassônico FS20</td><td>Fisher Scientific</td><td>1533530</td><td></td></tr><tr><td>ID da tubulação Tygon: 1/32 "OD: 3/32" Parede 1/32 "</td><td>Fornecimento de componentes</td><td>TET-031A</td><td></td></tr><tr><td>ID da tubulação Tygon: 3/32" OD: 5/32 "Parede 1/32"</td> <td>Fornecimento de componentes</td><td>TET-094A</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador luer lock para válvula de 3 vias</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-31200-80</td><td></td></tr><tr><td>Adaptadores Tee e conexões de plástico</td><td>Cole-Parmer</td><td>6365-90</td><td></td></tr><tr><td>Braçadeira de plástico</td><td>WaterZoo</td><td>2465</td><td></td></tr><tr><td>Peltier</td><td>TE Technology</td><td>TE-127-2.0-2.5</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-2AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R1245MP</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D3167</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Fluo-4AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M14206</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de acupuntura</td><td>LHASA</td><td>TC1.20x13</td><td></td></tr><tr><td>Seringa BD de 60 mL com luer-lok</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-820-11</td><td></td></tr><tr><td>LabView</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Velocidade vácuo Eppendorf Vagufuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-748-13</td><td></td></tr><tr><td>Circuito de processamento de sinal digital DSP TMS 320</td><td>Texas Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Longpass Espelho dicróico 567 nm</td><td>ThorLabs</td><td>DMLP567L</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective</td><td>Edmund Optics</td><td>Stock# 33-437</td><td></td></tr><tr><td>Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective</td><td>Edmund Optics</td><td>Stock# 33-438</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de vidro colorido Longpass 590 nm&nbsp;</td><td>ThorLabs</td><td>FGL590</td><td></td></tr><tr><td>Laser Nd-YAG Verde 532 nm, 500 mW</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador para laser</td><td>Siskiyou</td><td>MX130R</td><td></td></tr><tr><td>Fibra óptica multimodo 200 &micro; m NA 0.39</td><td>ThorLabs</td><td>FT200UMT</td><td></td></tr><tr><td>LEDs azul</td><td>Lumileds</td><td>L135-B475003500000</td><td></td></tr><tr><td>LEDs verde</td><td>Lumileds</td><td>L135-G525003500000</td><td></td></tr><tr><td>Divisor de feixe de cubo, não polarizador</td><td>ThorLabs</td><td>BS007</td><td></td></tr><tr><td>36" Comprimento, Trilho Óptico Dovetail</td><td>Edmund Optics</td><td>54-402</td><td></td></tr><tr><td>2.5" Largura, Portador Dovetail</td><td>Edmund Optics</td><td>54-404</td><td></td></tr><tr><td>0.75" Travel, estágio micrométrico</td><td>Edmund Optics</td><td>37-983</td><td></td></tr><tr><td>Trilho óptico Dovetail 3"</td><td>ThorLabs</td><td>RLA075/M</td><td></td></tr><tr><td>Portador de trilho Dovetail 1"</td><td>ThorLabs</td><td>RC1</td><td></td></tr><tr><td>Avalanche fotodiodo Helix 902</td><td>Digi-Key</td><td>HELIX-902-200</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de objetiva XY Tradutor& nbsp;</td><td>ThorLabs</td><td>ST1XY-S</td><td></td></tr><tr><td>Placa de ensaio de alumínio 6" x 6"</td><td>ThorLabs</td><td>MB6</td><td></td></tr><tr><td>Nexus mesa otpical 4' x 6'ThorLabs</td><td></td> <td>T46HK</td><td></td></tr><tr><td>Parafusos de tampa de aço inoxidável</td><td>ThorLabs</td><td>HW-KIT5/M</td><td></td></tr><tr><td>Folha de acrílico&nbsp;</td> Kit de elastômero de silicone <td>Home Depot/Lowes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td> Gel epóxi <td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Walmart/Home Depot</td><td>2-partes 5 min clr 1oz</td><td></td></tr><tr><td>21G1.5 Agulha de precisão</td><td>deslizante B-D</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>23G Agulha de precisão</td><td>deslizante B-D</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Base de montagem, 25 mm x 75 mm x 10 mm</td><td>ThorLabs</td><td>BA1/M</td><td></td></tr><tr><td>Postes de prateleira de arame 36"</td><td>Alera</td><td>AALESW59PO36SR</td><td></td></tr><tr><td>Prateleiras de arame</td><td>Alera</td><td>ALESW582424SR</td><td></td></tr><tr><td>Braçadeira de poste e ângulo</td><td>ThorLabs</td><td>SWC / M-P5</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de vidro para câmara de tingimento</td><td>Wheaton</td><td>W851020</td><td></td></tr><tr><td>Rolha de borracha</td><td>Home Science Tools</td><td>CE-STOP01C</td><td></td></tr></tbody></table>

o campo local microscopia de fluorescência: geração de sinais de celular em corações intactos

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

No coração, os estudos de sinalização molecular são geralmente realizadas em miócitos isolados. No entanto, muitas situações patológicas, tais como isquemia e arritmias só pode ser totalmente entendido a todo o nível do órgão. Aqui, apresentamos a técnica de espectroscopia de fluorescência microscopia de campo local (LFFM) que permite a medição de sinais celulares no coração intacto. A técnica baseia-se numa combinação de um coração perfundido de Langendorff e fibras ópticas para gravar sinais fluorescentes. LFFM tem várias aplicações no campo da fisiologia cardiovascular para estudar o coração em condições normais e patológicas. Várias variáveis ​​cardíacas pode ser monitorizada utilizando diferentes indicadores fluorescentes. Estes incluem citosólica [Ca2 +], retículo sarcoplasmático intra-[Ca 2+] e potenciais de membrana. As sondas fluorescentes exógenos são animado e a fluorescência emitida detectada com três arranjos diferentes de técnica LFFM epifluorescências apresentada neste artigo. As diferenças central entre estas técnicas são o tipo de fonte de luz utilizada para excitação e sobre a forma como a luz de excitação é modulada. O LFFM pulsada (PLFFM) usa pulsos de luz laser, enquanto onda contínua LFFM (CLFFM) usa luz laser contínuo para a excitação. Finalmente, diodos emissores de luz (LEDs) foram usadas como uma fonte de luz terceiro. Este arranjo não coerente é chamado pulsada microscopia de fluorescência LED (PLEDFM).

AP e Ca 2 + transientes em endocárdio e epicárdio A fim de comparar os sinais do outro lado da parede ventricular, uma fibra óptica é posicionada no endocárdio e a outra no epicárdio. Comparando-se a morfologia de um AP gravado a partir do endocárdio com um a partir do epicárdio é a melhor maneira de avaliar a função transmural. A parede ventricular é altamente heterog...

No coração, os eventos moleculares coordenar a função contráctil e eléctrica do órgão. Um conjunto de técnicas de microscopia de fluorescência de campo locais aqui apresentadas permite a gravação de variáveis ​​de celular em corações intactos. Identificação de mecanismos que definem a função cardíaca é fundamental na compreensão de como o coração trabalha em situações patológicas.

O campo local microscopia de fluorescência: Geração de sinais de celular em corações intactos

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and ...

O objetivo geral dessa técnica de imagem por microscopia de fluorescência de campo local é utilizar sondas moleculares para medir os níveis intracelulares de cálcio ou os potenciais de membrana em regiões do coração de difícil acesso no nível do coração inteiro. Este método pode nos ajudar a responder perguntas fundamentais sobre o sistema cardiovascular relacionadas à parada cardíaca e à isquemia. A principal vantagem dessa técnica é que as propriedades cardíacas são medidas a partir de eventos celulares no órgão intacto, onde as células continuam acopladas eletricamente, mecanicamente e metabolicamente.Primeiro, prepare o aparelho de Langendorff horizontal. Carregue a solução de Tyrode recém-preparada nas seringas de 60 mililitros e conecte todas as tubulações associadas ao conjunto. Após o preenchimento, elimine todas as bolhas de ar.Em seguida, equilibre a solução carregada com gás oxigênio puro fornecido por uma pedra de aeração de plástico submersa. Depois, coloque um fio cirúrgico não absorvível ao redor de uma agulha. Isso servirá como uma cânula para retroperfusão do coração quando conectado ao aparelho.Em seguida, colete o coração após injetar heparina e eutanasiar o anim

local-field-fluorescence-microscopy-imaging-cellular-signals-intact

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este artigo descreve uma técnica de alta resolução temporal e espacial, visualmente, movimento de ação potencial imagem sobre a superfície de corações de ratos perfundidos Langendorff-utilizando um corante potenciométrica (di-8-ANEPPS).

Mapeamento óptica de corações perfundidos Langendorff-Rat

Microscopia confocal é aplicada para imagens individuais em eventos mitocondriais coração perfundido ou músculos esqueléticos em animal vivo. Monitoramento em tempo real de processos mitocondriais único, como superóxido flashes e membrana possíveis flutuações permite a avaliação da função mitocondrial em um contexto fisiologicamente relevante e durante perturbações patológicas.

Imagem confocal de Solteiro mitocondriais superóxido Pisca em coração intacto ou In Vivo

Descrevemos um protocolo para obter imagens volumétricas de células marcadas com proteínas fluorescentes profundamente dentro de corações embrionários e pós-natais intactos. Utilizando métodos de limpeza de tecido em combinação com coloração de montagem inteira, células marcadas com proteína fluorescente única dentro de um coração embrionário ou pós-natal podem ser visualizadas com clareza e precisão.

Imagiologia Cleared embrionário e pós-natal Corações na resolução de célula única

Aqui, descrevemos uma abordagem de microscopia de folha clara para visualizar o infiltrado de leucócitos CD45 + cardíacos em um modelo murino de miocardite fulminante asséptica, que é induzida pelo tratamento de toxina diftônica intratraqueal de ratos CD11c.DTR.

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Aqui nós introduzimos um método para usar um cateter ótico do intra-ventrículo em corações perfundidos para executar a espectroscopia da absorvência através da parede do coração. Os dados obtidos fornecem informações robustas sobre a tensão do oxigênio tecidual, bem como a utilização do substrato e o potencial de membrana simultaneamente com medidas de desempenho cardíaco nesta preparação onipresente.

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Apresentamos a metodologia para o isolamento dos miócitos de urina e como obter traços de tensão ou cálcio simultaneamente com traços de encurtamento de sarcomeros usando fotometria de fluorescência com medições simultâneas de geometria celular digital.

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Aqui descrevemos a aquisição óptica e a caracterização de potenciais de ação a partir de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos usando um sistema de fotometria modular de alta velocidade.

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A reconstrução tridimensional (3D) do dano cardíaco no infarto agudo do miocárdio reperfundido (repIAM) permite a quantificação fiel e a co-localização dos padrões associados que afetam a doença. Aqui, uma abordagem de imagem guiada por folha de luz automatizável é fornecida para medição contemporânea de danos cardíacos, área de risco e resposta de células imunes.

Análise 3D Simultânea de Dano Cardíaco e Resposta Imune em Infarto Agudo do Miocárdio Reperfundido Usando Microscopia de Fluorescência de Folha de Luz

Aprenda microscopia de fluorescência de campo local para medir cálcio intracelular e potenciais de membrana em corações intactos. Esta técnica preserva o acoplamento elétrico e metabólico das células cardíacas.

O campo local microscopia de fluorescência: Geração de sinais de celular em corações intactos

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