Modelos agudos e crônicos de hiperglicemia no peixe-zebra: um método para avaliar o impacto da hiperglicemia na neurogênese e a biodisponibilidade das moléculas radiomarcadas

O objetivo geral do procedimento a seguir é avaliar a remodelação cerebral em condições de hiperglicemia e acompanhar moléculas radioativas em peixes-zebra. A hiperglicemia caracteriza-se por uma concentração excessiva de glicose no sangue. A hiperglicemia crônica pode ser decorrente de condições diabéticas e provoca diversas disfunções vasculares, que por sua vez podem desencadear complicações clínicas, como infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral ou úlceras do pé diabético.

Além disso, a hiperglicemia aguda devido ao estresse pode promover complicações hemorrágicas no acidente vascular cerebral isquêmico. O peixe-zebra é um modelo interessante para compreender doenças humanas e seu impacto no sistema nervoso central. Isso é particularmente verdadeiro, dado que o cérebro de peixes adultos exibe uma capacidade neurogênica intensa e uma notável capacidade de mecanismos de reparação cerebral, em comparação com mamíferos; portanto, o peixe-zebra representa um bom modelo para investigar a remodelação cerebral após estresse em condições agudas e hiperglicêmicas.

Ele também permite investigar a biodistribuição de moléculas marcadas com radiação e agentes terapêuticos potenciais. Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes francesas e da comunidade europeia para o uso de animais em pesquisa, e aprovados pelo comitê de ética local para experimentação animal. Pegue um peixe suavemente com uma rede de pesca.

Coloque o peixe em um pequeno volume de anestésico com tricaina, diluído em uma concentração final de 0,02% na água. Aguarde até que o peixe pare de se mover. Remova o peixe utilizando uma pipeta cortada e coloque-o suavemente sobre papel toalha para remover a maior quantidade possível de água.

Pese o peixe para preparar uma seringa com d-glicose para injeção, com 50 microlitros de 2,5 gramas por quilo de peso corporal. Por exemplo, um peixe de 0,6 grama receberá 50 microlitros de uma solução de d-glicose a 3% em PBS. Coloque o peixe de costas e mantenha-o com uma das mãos.

Com a outra mão, insira a agulha da seringa na cavidade intraperitoneal e injete lentamente a solução de d-glucose em PBS. Remova a agulha e devolva o peixe à água. Observe o peixe até que ele se recupere completamente.

Os níveis de glicose no sangue são geralmente medidos após 1 hora e meia. Para imitar a hiperglicemia crônica, prepare um tanque de dois litros com d-glicose, numa concentração final de 111 milimolar. Para isso, pese 40 gramas de d-glicose e coloque-as em um tanque vazio.

Encha o tanque com dois litros de água para peixes e coloque até sete peixes nele. Troque a solução de glicose a cada dois dias, para evitar o crescimento de bactérias ou outros microrganismos. A hiperglicemia crônica é obtida por um tratamento de 14 dias com d-glicose.

Caia um peixe com uma rede de pesca e coloque-o sobre gelo. Cubra o peixe com gelo para uma eutanásia rápida. Pegue o peixe e seque-o, a fim de remover quaisquer gotas de água que possam diluir as amostras de sangue.

Remova um olho com pinças de dissecação e aguarde até que a cavidade ocular seja preenchida com sangue. Coloque uma tira reagente no glicosímetro e insira a tira na cavidade ocular. Anote o valor da concentração de glicose no sangue.

Para hiperglicemia aguda, uma injeção intraperitoneal de d-glicose induz um aumento significativo nos níveis de glicose sanguínea, conforme mostrado 1 hora e meia após a injeção. Para hiperglicemia crônica, a imersão dos peixes em uma solução de d-glicose resulta em um aumento significativo nos níveis de glicose sanguínea, conforme demonstrado após 14 dias de tratamento. Ao final do procedimento, separe o corpo da cabeça com tesoura de dissecação e coloque a cabeça em paraformaldeído a 4%, diluído em PBS, para experimentos de imunohistoquímica.

Incubar durante a noite a quatro graus Celsius. Alternativamente, o cérebro pode ser extraído diretamente e congelado para outros experimentos, como extração de mRNA. No dia seguinte, as cabeças fixadas são lavadas com PBS e mantidas com uma agulha sob um microscópio estereoscópico.

O olho restante é removido, e o topo do crânio é suavemente aberto com pinça. O cérebro é então cuidadosamente extraído e colocado em PBS 1x. Os cérebros fixados são desidratados de forma progressiva, em uma série de concentrações crescentes de etanol, seguidos por dois banhos de 30 minutos em tolueno.

Os cérebros são então colocados em uma cassete de inclusão, e a tampa é cuidadosamente fechada. Coloque a cassete na parafina derretida, a 58 a 60 graus Celsius. Durante a inclusão em parafina do cérebro, ligue a pinça de inclusão aquecida.

Coloque a cassete em um banho limpo de parafina. Ao final dos banhos de parafina, retire a cassete. Despeje um pouco de parafina líquida em um molde.

Abra a cassete e coloque o cérebro dentro da parafina derretida na forma. Oriente o cérebro com a pinça de inclusão aquecida. Complete a forma com parafina derretida e deixe endurecer na parte de resfriamento da máquina de inclusão.

Por razões técnicas, o cérebro deve ser posicionado de acordo com um eixo anterior-posterior. Após desmoldar o bloco de parafina, corte-o e fixe-o em uma cassete com parafina derretida, na orientação correta para permitir o corte transversal. Insira o bloco de parafina no braço de um micrótomo e corte secções de 50 micrômetros até atingir o nível da amostra cerebral.

Em seguida, corte o bloco de parafina para obter um trapézio e ajuste a espessura do corte a sete micrômetros. Colete as fitas de parafina com um pincel fino e coloque-as sobre um papel preto. Corte as fitas de parafina a cada três ou quatro seções.

Coloque uma lâmina em uma placa aquecida e cubra-a com água destilada. Posicione suavemente os cortes sobre a água na lâmina e aqueça até 40 graus Celsius. Quando as fitas de parafina estiverem suficientemente espalhadas, remova a água com papel absorvente.

As últimas gotas são removidas mecanicamente, conforme mostrado. Deixe a lâmina secar por pelo menos duas horas antes de realizar o procedimento de imunohistoquímica descrito no protocolo. Após a imunohistoquímica, as lâminas são analisadas em um microscópio de epifluorescência ou confocal, para estudar o impacto da hiperglicemia na proliferação de células cerebrais.

A quantificação de células cerebrais é realizada em pelo menos três cortes sucessivos ou em uma região de interesse. Aqui, as células proliferativas correspondentes às células positivas para PCNA aparecem em verde. Como é possível observar, a hiperglicemia crônica induz uma diminuição no número de células proliferativas, marcadas em verde com o anticorpo anti-PCNA, no telencéfalo ventral, no telencéfalo dorsal e no hipotálamo caudal, ao redor do recesso lateral e posterior.

Alternativamente, para estudar os efeitos da hiperglicemia na neurogênese induzida por lesão, uma lesão por punção no telencéfalo pode ser realizada durante o tratamento crônico de hiperglicemia. Para isso, anestesie um peixe tratado por sete dias e coloque-o sob um microscópio estereoscópico. Insira verticalmente uma seringa de calibre 30 através do crânio, até o centro do hemisfério telencefálico direito.

Após este procedimento, o peixe deve ser devolvido ao seu tanque pelo tempo necessário. Aqui, permitiu-se que o peixe sobrevivesse por sete dias em água com d-glicose, antes de ser sacrificado. A lesão por punção no telencéfalo aumenta fortemente a proliferação no hemisfério lesionado, sete dias após a lesão.

Nossos dados mostram que a hiperglicemia crônica induz uma diminuição significativa nos processos de cicatrização cerebral, reduzindo a proliferação celular após lesão por punção no telencéfalo. Peixes-zebra também podem ser utilizados para estudar a biodistribuição de moléculas marcadas com radiação. Aqui, decidimos estudar o metabolismo da glicose no organismo de peixe-zebra.

O peixe deve ser primeiramente anestesiado e colocado sobre um tecido embebido com anestésicos. Em seguida, o peixe é posicionado atrás de uma janela de proteção radiológica. A seringa contendo 50 microlitros de fluorodesoxiglicose é preparada.

O peixe é posicionado sobre as costas e injetado por via intraperitoneal com 50 microlitros de FDG a 20 megabecquerel. Em seguida, o peixe é colocado sobre outro tecido embebido com anestésicos. É envolvido suavemente e posicionado no braço do equipamento de imagem por PET.

O braço é inserido no escaneamento por PET, e o procedimento de imagem é realizado. Aqui, pode-se observar que o FDG é detectado não apenas no local da injeção, mas também na cabeça do peixe, notavelmente no cérebro, e ao longo de toda a medula espinhal. Neste estudo, apresentamos dois métodos diferentes para induzir hiperglicemia aguda e crônica em peixes-zebra, e demonstramos que a hiperglicemia prejudica a proliferação de células cerebrais em condições normais e sob estímulo de lesão.

Em conclusão, o peixe-zebra pode ser utilizado como um modelo relevante para investigar os efeitos deletérios da hiperglicemia no sistema nervoso central. Ele também permite avaliar a biodistribuição de moléculas radio-marcadas por meio de tomografia por emissão de pósitrons.