Modelos agudos e crônicos de hiperglicemia no peixe-zebra: um método para avaliar o impacto da hiperglicemia na neurogênese e a biodisponibilidade das moléculas radiomarcadas

O objetivo geral do procedimento a seguir é avaliar a remodelação cerebral em condições hiperglicêmicas e seguir moléculas marcadas radioativamente em peixes-zebra. A hiperglicemia é caracterizada por uma concentração excessiva de glicose no sangue. A hiperglicemia crônica pode ser decorrente de condições diabéticas e causa diferentes disfunções vasculares, que podem, por sua vez, desencadear complicações clínicas, como infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral ou úlceras do pé diabético.

Além disso, a hiperglicemia aguda devido ao estresse pode promover complicações hemorrágicas no AVC isquêmico. O peixe-zebra é um modelo interessante para entender as doenças humanas e seu impacto no sistema nervoso central. É particularmente verdade, dado que o cérebro de peixes adultos apresenta uma intensa capacidade neurogênica e uma excelente capacidade de mecanismos de reparo cerebral, em comparação com mamíferos, portanto, o peixe-zebra representa um bom modelo para investigar a remodelação cerebral, após o estresse em condições agudas e hiperglicêmicas.

Também permite investigar a biodistribuição de moléculas radiomarcadas e potenciais agentes terapêuticos. Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes da comunidade francesa e europeia para o uso de animais em pesquisa e aprovados pelo comitê de ética local para experimentação animal. Pegue um peixe suavemente com uma rede de pesca.

Coloque o peixe em um pequeno volume de anestésico tricaína, diluído na concentração final de 0,02% na água. Espere até que o peixe pare de se mover. Retire o peixe, usando uma pipeta cortada, e coloque-o suavemente sobre papel absorvente para remover o máximo de água.

Pese o peixe para preparar uma seringa de d-glicose para injeção, de 50 microlitros de 2,5 gramas por quilo de peso corporal. Por exemplo, um peixe de 0,6 grama receberá 50 microlitros de uma solução de PBS a 3% de d-glicose. Coloque o peixe de costas e mantenha-o com uma mão.

Com a outra mão, insira a agulha da seringa na cavidade intraperitoneal e injete lentamente a solução de d-glicose PBS. Remova a agulha e coloque o peixe de volta na água do peixe. Verifique o peixe até que ele se recupere completamente.

Seus níveis de glicose no sangue são geralmente medidos após 1 hora e meia. Para imitar a hiperglicemia crônica, prepare um tanque de dois litros de d-glicose, a uma concentração final de 111 milimolar. Para isso, pese 40 gramas de d-glicose e coloque-o em um tanque vazio.

Encha o tanque com dois litros de água de peixe e coloque até sete peixes nele. Troque a solução de glicose a cada dois dias, a fim de evitar o crescimento de bactérias ou outros microrganismos. A hiperglicemia crônica é obtida por um tratamento de 14 dias com d-glicose.

Pegue um peixe com uma rede de pesca e coloque-o no gelo. Cubra o peixe com gelo para uma eutanásia rápida. Pegue o peixe e limpe-o, a fim de remover quaisquer gotas de água que possam diluir as amostras de sangue.

Remova um olho com uma pinça de dissecação e espere até que a cavidade ocular esteja cheia de sangue. Coloque uma tira de teste no glicosímetro e insira a tira na cavidade ocular. Observe o valor da concentração de glicose no sangue.

Para hiperglicemia aguda, uma injeção intraperitoneal de d-glicose induz um aumento significativo nos níveis de glicose no sangue, conforme mostrado, 1 hora e meia após a injeção. Para hiperglicemia crônica, a imersão de peixes em uma solução de d-glicose resulta em um aumento significativo nos níveis de glicose no sangue, conforme mostrado após 14 dias de tratamento. Ao final do procedimento, separar o corpo da cabeça com uma tesoura de dissecação e colocar a cabeça em 4% de paraformaldeído, diluído em PBS para experimentos de imuno-histoquímica.

Incube durante a noite a quatro graus Celsius. Alternativamente, o cérebro pode ser extraído diretamente e congelado para outros experimentos, como a extração de mRNA. No dia seguinte, as cabeças fixas são enxaguadas com PBS e mantidas com uma agulha sob um microscópio de dissecação.

O olho restante é removido e a parte superior do crânio é suavemente aberta com uma pinça. O cérebro é então cuidadosamente extraído e colocado em 1x PBS. Os cérebros fixos são desidratados gradualmente, em uma série de concentrações crescentes de etanol, seguidas por dois banhos de tolueno de 30 minutos.

Os cérebros são então colocados em um embutido e a tampa é cuidadosamente fechada. Coloque o em parafina derretida, a 58 a 60 graus Celsius. Durante a incorporação de parafina do cérebro, ligue a pinça de inclusão de aquecimento.

Coloque o em um banho de parafina limpo. No final dos banhos de parafina, retire o. Despeje um pouco de parafina líquida em um molde.

Abra o e coloque o cérebro dentro da parafina derretida no molde. Oriente o cérebro com a pinça de inclusão de aquecimento. Encha o molde com parafina derretida e deixe-o endurecer na parte de resfriamento da máquina de incorporação.

Por razões técnicas, o cérebro deve ser posicionado de acordo com um eixo ântero-posterior. Depois de desenformar o bloco de parafina, corte-o e fixe-o em um com parafina derretida, na orientação correta para permitir o corte transversal. Insira o bloco de parafina no braço de um micrótomo e corte seções de 50 micrômetros, até atingir o nível da amostra de cérebro.

Em seguida, apare o bloco de parafina para obter um trapézio e ajuste a espessura do corte para sete micrômetros. Recolha as fitas de parafina com um pincel fino e coloque-as sobre um papel preto. Corte as fitas de parafina a cada três ou quatro seções.

Coloque uma lâmina em uma placa de aquecimento e cubra-a com água destilada. Posicione suavemente as seções na água no escorregador e aqueça até 40 graus Celsius. Quando as fitas de parafina estiverem suficientemente espalhadas, remova a água com tecido absorvente.

As últimas gotas são removidas mecanicamente, conforme mostrado. Deixe a lâmina secar pelo menos duas horas antes de realizar o procedimento de imuno-histoquímica descrito no protocolo. Após a imuno-histoquímica, as lâminas são analisadas em microscópio de epifluorescência ou confocal para estudar o impacto da hiperglicemia na proliferação de células cerebrais.

A quantificação das células cerebrais é feita em pelo menos três seções sucessivas ou em uma região de interesse. Aqui, as células proliferativas correspondentes às células positivas para PCNA aparecem em verde. Como você pode ver, a hiperglicemia crônica induz uma diminuição no número de células proliferativas, marcadas em verde com anticorpo PCNA, no telencéfalo ventral, no telencéfalo dorsal e no hipotálamo caudal, ao redor do recesso lateral e posterior.

Alternativamente, para estudar os efeitos da hiperglicemia na neurogênese induzida por lesão, uma lesão por facada do telencéfalo pode ser realizada durante o tratamento hiperglicêmico crônico. Para isso, anestesiar um peixe tratado por sete dias e colocá-lo sob um microscópio de dissecação. Empurre uma seringa de calibre 30 verticalmente através do crânio, no centro do hemisfério teleencefálico direito.

Após este procedimento, o peixe deve ser devolvido ao seu tanque pelo tempo necessário. Aqui, o peixe sobreviveu sete dias em água com d-glicose, antes de ser sacrificado. A lesão por arma branca do telencéfalo regula fortemente a proliferação no hemisfério lesado, sete dias após a lesão.

Nossos dados mostram que a hiperglicemia crônica induz uma diminuição significativa nos processos de cicatrização cerebral, diminuindo a proliferação celular após ferimento por arma branca do telencéfalo. O peixe-zebra também pode ser usado para estudar a biodistribuição de moléculas marcadas com rádio. Aqui, decidimos estudar o metabolismo da glicose no organismo do peixe-zebra.

O peixe deve ser primeiro anestesiado e colocado em um lenço embebido em anestésicos. O peixe é então colocado atrás de uma janela de proteção de rádio. A seringa contendo 50 microlitros de fluorodesoxiglicose é preparada.

O peixe é posicionado de costas e injetado por via intraperitoneal com 50 microlitros de FDG a 20 megabecquerel. O peixe é então colocado em outro tecido embebido em anestésicos. Ele é suavemente embrulhado e posicionado no braço de um gerador de imagens PET scan.

O braço é inserido na tomografia por emissão de pósitrons e o procedimento de imagem é realizado. Aqui, você pode notar que o FDG não é detectado apenas no local da injeção, mas também na cabeça do peixe, notadamente, no cérebro e ao longo de toda a medula espinhal. Neste estudo, fornecemos dois métodos diferentes para estabelecer hiperglicemia aguda e crônica em peixe-zebra e mostramos que a hiperglicemia prejudica a proliferação de células cerebrais em condições normais e induzidas por lesões.

Em conclusão, o peixe-zebra pode ser usado como um modelo relevante para investigar os efeitos deletérios da hiperglicemia no sistema nervoso central. Também permite avaliar a biodistribuição de moléculas radiomarcadas por PET scan.