Name: Swab método de amostragem para a detecção do norovírus Humano em Surfaces (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Aprenda o método de amostragem com swab de macroespuma para detectar norovírus em superfícies ambientais. Este protocolo melhora a recuperação viral e auxilia na investigação de surtos de gastroenterite.

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Os autores não têm agradecimentos.

1. Swab Amostragem no campo <ol><li> Usar um par limpo de luvas. </li><li> Medir o tamanho da área de amostragem, sem tocar na superfície utilizando uma fita de medição ou régua. Tente estimar a área com a maior precisão possível e preencher um formulário de relatório (Tabela Suplementar 1). </li><li> Verifique o kit cotonete para possíveis fugas e amostras rótulo sacos de transporte e kits de esfregaço. </li><li> Mover a haste de toda a área de amostragem, como segue: um acidente vascular cerebral em direcção horizontal, um acidente vascular cerebral em direcção vertical, e um acidente vascular cerebral em um sentido diagonal. Não pincelar uma maior área de superfície de 700 cm2. </li><li> Coloque cada mecha em um tubo e aperte a tampa de segurança. </li></ol> 2. Armazenamento e Transporte de cotonetes para o Laboratório <ol><li> Manter cotonetes a 4 ° C durante até 48 h. Se for necessário o armazenamento por períodos mais longos, armazenar os cotonetes a -20 ° C (ou -70 ° C). </li><li> Mantenha os tubos a 0-4 ° C (ou seja,. , Use compressas frias) em um recipiente isolado durante o transporte para o laboratório e navio dentro de 24-48 h da coleta. </li></ol> 3. concentração de vírus, Viral RNA extração e purificação NOTA: Todos os passos de centrifugação usar uma centrífuga de bancada a 5000 xg durante 5 min à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma. Tenha cuidado extra quando se trabalha com o tampão universal extração de ácidos nucléicos (UNEX). Usar óculos ou viseira. <ol><li> Rotular um tubo de 15 mL e uma coluna RNA Midi para cada amostra. Incluir um controlo de extração negativo em cada experimento. </li><li> Para preparar a solução de lise durante 10 esfregaços, misturar 25 mL de tampão de UNEX com 25 mL de PBST (PBS, pH 7,2, contendo 0,02% de Tween-80). </li><li> Adicionar 50 ul de suspensão colifago MS2 (10 6 PFU / mL) a 50 ml de solução de lise. </li><li> Coloque um algodão embebido em um tubo de 15 ml e 5 ml da solução de Lise. Misturar e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li>Adicionar 5 ml de etanol a 100% a cada tubo e agitar com vortex durante 10 s. </li><li> Cuidadosamente retire o cotonete do tubo de 15 mL (contém tampão UNEX) pressionando-o suavemente contra o lado do tubo para remover o excesso de líquido e, em seguida, descartar o cotonete. Os volumes restantes deve ser entre 9-10 mL. </li></ol> 4. Coluna Midi viral Nucleic Acid Extraction <ol><li> Transferir cuidadosamente 4,5 mL UNEX mistura / etanol a partir do passo 3.6 para uma coluna de midi, centrífuga e descartar o filtrado. </li><li> Carregar mais 4,5 ml a partir da mesma mistura na mesma coluna, centrifugação, e descartar o filtrado. </li><li> Para a primeira lavagem, adicionar 3,5 mL de etanol a 70% para a coluna Midi, centrifugar e rejeitar-se o filtrado. </li><li> Para a segunda lavagem, adicionar outros 3,5 mL de etanol a 70% para a coluna Midi. Centrífuga e descartar o filtrado. </li><li> Para o spin seca, centrifugar as colunas Midi para remover todos os vestígios de etanol (que pode afetar negativamente a sua recuperação RNA viral). </li><li>Colocar a coluna Midi em um novo tubo de centrífuga de 15 ml. Adicionar 250 ul de tampão de eluição na coluna Midi; aguarde 1 min antes da centrifugação para obter o maior recuperação de RNA viral. </li><li> Armazenar o ácido nucleico extraído a -70 ° C ou prosseguir imediatamente para a etapa 5. </li></ol> 5. Concentração de Ácido Nucleico Utilizando Viral RNA limpo e Concentrador Kits <ol><li> Adicionar 500 uL de ARN de Tampão de Ligação para 250 ul de ARN eluída no passo 4.7 acima e vortex durante 10 s. </li><li> Adicionar 750 uL de 100% de etanol e agitar com vortex durante 10 s. </li><li> Rotular uma coluna de centrifugação para cada amostra. Coloque a amostra de 750 mL para uma coluna de spin. </li><li> Centrifugar as colunas de spin a 12.000 xg por 1 min. Descartar o fluxo de passagem. </li><li> Carregar os restantes 750 uL numa coluna de centrifugação e centrifugar a 12000 xg durante 1 min. </li><li> Para a pré-lavagem, adicionar 400 ul de tampão de ARN Prep para cada coluna de centrifugação e centrifugar a 12000 xg durante 1 min. Descartar o fluxo de passagem. </li><li> Para a primeira lavagem, adicionar 800 uL de ARN tampão de lavagem para cada coluna de centrifugação e centrifugar a 12000 xg durante 1 min. Descartar o fluxo de passagem. </li><li> Para a segunda lavagem, adicionar 400 uL de ARN de Tampão de Lavagem a girar coluna e centrifugar a 12000 xg durante 1 min. Descartar o fluxo de passagem. </li><li> Para o spin seco, centrifugar a coluna de centrifugação para remover todos os vestígios de tampão de lavagem a 12.000 xg durante 2 min. </li><li> Transferir cuidadosamente coluna de rotação para um tubo de microcentrífuga limpo 1,5 mL. </li><li> Adicionar 25 ul de tampão de eluição na coluna de rotação e incuba-se durante 1 minuto à temperatura ambiente. Isto irá aumentar a recuperação de RNA viral a partir da coluna. </li><li> Recolha de ARN por centrifugação a coluna de centrifugação a 10.000 xg durante 1 min. </li><li> Ou prosseguir directamente para RT-qPCR (passo 6) ou ARN armazenar a -70 ° C. </li></ol> 6. MULTIPLEX Detecção RT-qPCR de genogrupo I e II norovírus, e colifagos MS 2 (Tabela Complementar 2) <ol><li> superfícies de trabalho limpas, pipetaes, e centrífugas com solução de descontaminação RNase para reduzir a possibilidade de contaminação. </li><li> Descongelar reagentes RT-qPCR em gelo. RNA Thaw no gelo (em uma área / sala separada). </li><li> Determinar o número de reacções e adicionar pelo menos 10% mais deles (por exemplo, se são necessários 10 reacções, certifique-master mix para 11). </li><li> componentes master mix Vortex individuais, com exceção de 25x enzima RT-qPCR, por 5 s. Misturar cuidadosamente a enzima sacudindo o tubo com um dedo. </li><li> Resumidamente componentes Mix Master centrífuga por 5 s. </li><li> Preparar a mistura de mestre para a detecção em tempo real de RT-PCR do GI e GII norovírus de acordo com as instruções do kit e adicionar iniciadores oligonucleotídicos específicos do norovírus e sondas num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (Tabela 3 Complementar). </li><li> Misture a mistura principal pipetando 5-10 vezes para cima e para baixo (vórtice não é recomendado). Aliquota de 22 uL da mistura principal em cada poço de PCR em tempo real placa de 96 poços. </li><li> RNA amostra Vortexdurante 5 seg, e recolher por breve (5 s) de centrifugação. </li><li> Adicionar 3 mL da amostra de RNA e GI e GII controlos positivos para a placa de RT-qPCR (siga molde a partir da Tabela 2). Adicionar 3 mL de nuclease-freewater nos poços não-molde-controlo (NTC). </li><li> Selar a placa em tempo real com película adesiva óptica. </li><li> Cuidadosamente centrifugar a placa em tempo real a 1.300 xg durante 1 min para remover quaisquer bolhas de ar ou gotas de líquido que podem estar presentes nos poços. </li><li> Configurar um tempo real instrumento de PCR e set-up as seguintes condições ciclos térmicos: 1) etapa RT por 10 min. a 45 ° C (2) activação da polimerase Taq, 10 min. a 95 ° C e (3) 45 ciclos de 15 s a 95 ° C, e 60 s a 60 ° C. </li></ol> 7. Quantificação de norovírus em amostras de swab <ol><li> Confira os resultados dos controlos positivos e negativos para validar os resultados RT-qPCR (Tabela Complementar 3). </li><li> Determinar se cada curva padrão encontra ovalores aceitáveis dada no quadro suplementar 2 e calcular o desvio padrão geral para a curva padrão, usando a Equação 1. (Equação 1)% de eficiência = 100 x 10 (média Ct Valores-Intercept) / Slope. </li><li> Se o software termociclador PCR não calcula a inclinação para cada curva padrão, determinar encosta e R 2 valores por regressão usando software estatístico (por exemplo, Excel, SPSS ou SAS). Além disso, o cálculo da% de eficiência para as curvas de padrão seguinte equação I </li><li> Grave o número de cópias de RNA calculado pelo software termociclador para todas as amostras de teste com base em curvas padrão que atendem aos critérios especificados na Tabela Complementar 4. Execute novamente todas as amostras com curvas padrão chapéu de t, não satisfazem os critérios ou ter controles de falso-positivos. Verifique os valores Ct de colifago MS2, que foi adicionado como um controlo interno para monitorar a inibição PCR. </li><li> Determinar o número total de cópias de RNA per amostra pela multiplicação do número de cópias de ARN calculada no passo 7.2 pela razão entre o volume (25 a 50 ul) de eluente de ARN total para o ARN que de (3-5 uL) utilizado para a reacção de RT-qPCR. Em alternativa, o cálculo da densidade ARN dividindo o número total de cópias de ARN por área de superfície do objecto (2 cm) analisados. </li></ol> 8. A genotipagem de tempo-real amostras RT-PCR positivos por Hemi Nested convencional PCR Amplification <ol><li> Preparar a primeira rodada de master mix para cada conjunto de primers do ensaio de RT-PCR (Tabelas complementares 2 e 5). </li><li> Adicionar 5 mL de RNA positiva norovirus para 20 l de mistura principal. </li><li> Executar o RT-PCR sob as seguintes condições: (1) passo de RT durante 30 min a 42 ° C (2) activação da polimerase Taq, em 15 min a 95 ° C, e (3) 40 ciclos de 30 s a 95 ° C , 30 s a 50 ° C, e 60 seg a 72 ° C. Após 40 ciclos, incubar durante um adicional de 10 min a 72 ° C. </li><li>Prepare a segunda rodada de mix mater para cada conjunto de primers do ensaio de RT-PCR (Tabelas complementares 2 e 5). </li><li> Adicionar 23 mL master mix e adicionar 2 mL de primeira rodada produtos de RT-PCR (da primeira rodada) a cada tubo (o ideal é o produto da primeira rodada deve ser diluído 1/10 em água RNase-free). </li><li> Repita o passo 8.3. </li><li> Preparar um gel de agarose a 2% em 100 ml de EDTA 1x Tris-acetato (Tris 40 mM, ácido acético 20 mM, e EDTA 1 mM, a pH 8,3). Após a dissolução de agarose por aquecimento da mistura num forno de micro-ondas, adicionam-se 10 ul de mancha de ácido nucleico por 100 ml de gel preparada depois de se arrefecer a mistura para 60-70 ° C, verter o gel e inserir os pentes. Deixe o gel se contentar com, pelo menos, 30 min. </li><li> Misturar 15 uL de cada produto de RT-PCR com 3 ul de corante de carga de 6x. Carga de 15 uL de cada amostra e electroforese do gel de agarose, a 100 V durante 1 h. </li><li> fragmentos alvo especial sobre o consumo de RT-PCR de tamanho adequado (330 pb para GI e 341 pb para GII) a partir do geld purificar RNA usando um kit de extracção de gel comercial. O produto de PCR purificado pode agora ser utilizada para a sequenciação de Sanger. </li></ol>

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Os autores não têm interesses conflitantes. As descobertas e conclusões deste relatório são de responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças.

Os norovírus têm uma dose infecciosa humana 50% entre 18 e 10 3 partículas de vírus 20. Portanto, mesmo a contaminação de baixo nível de superfícies podem representar um risco para a saúde pública. Vários aspectos do protocolo de amostragem swab foram avaliados, incluindo: 1) diferentes materiais de esfregaço, 2) cotonetes condição de armazenamento durante o transporte, 3) concentração de RNA viral, e 4) colifago MS2 como controle de extração interno. Até r...

<html> Noroviruses humanos são uma das principais causas da epidemia e gastroenterite aguda esporádica em todo o mundo 1, 2, 3. O vírus é extremamente contagiosa ea transmissão ocorre por meio de pessoa direta a interacção pessoa ou indirectamente, através de contacto com os alimentos contaminados, água ou superfícies ambientais. Norovírus pode ser derramado por longos períodos e prolongada sobrevivência do vírus em superfícies ambientais tem sido documentada 1, 2, 3. Durante derramamento de pico, bilhões de partículas de vírus são liberados por grama de fezes e vômito também contém um número suficiente de partículas virais para causar a infecção 4, 5, 6, 7, 8,ef &quot;&gt; 9, 10. Além disso, a transferência do vírus entre as superfícies inanimadas e pele humana pode ocorrer facilmente 2, 11, 12. Por isso, o monitoramento de contaminação ambiental pode ajudar na investigação de surtos e na avaliação da eficácia da limpeza e procedimentos de desinfecção. Vários protocolos de amostragem ambientais foram descritos para a detecção de rotavírus, colifago MS2, calicivírus felino (FCV), e bacteriófago P22 13, 14, 15, 16. No entanto, as condições de validação descritos nestes estudos, incluindo a dessecação rápida (&lt;1 hora) e da superfície reduzida (25 x 100 cm 2), pode não representar adequadamente as configurações de campo. Além disso, a baixos níveis de contaminação de Enviro esperadosuperfícies nmental requerem protocolos que são capazes de detectar muito poucas partículas de vírus. Foi desenvolvido um método de amostragem de superfície à base de macro-espuma para a detecção e tipagem de norovírus. Este método foi validado durante vários surtos de norovírus. O protocolo inclui 1) como coletar amostras de esfregaço de superfícies ambientais (2) a melhor forma de manter a integridade das amostras durante a recolha e envio para o laboratório, e 3) testes de laboratório e tipagem de norovirus.

<table><tbody><tr><td>Nome genérico para kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macrofoam swab</td><td>Prewetened EnviroMax Swab kit&nbsp;</td><td>Puritan</td><td>2588060PFUW</td></tr><tr><td>RNA Lysis buffer&nbsp; </td><td>CDC UNEX buffer</td><td>Microbiologics</td><td>Cat No MR0501</td></tr><tr><td>RNA extraction spin column</td><td>Midi column</td><td>Omega Biotek</td><td>Cat No R6664-02</td></tr><tr><td>RNA purification spin column</td><td>Zymol RNA Clean and Concentrator kit&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>Cat No R1016</td></tr><tr><td>Kit RT-PCR em tempo real</td><td>AgPath kit de RT-PCR de uma etapa</td><td>Life Technologies</td><td>Cat No 4387391</td></tr><tr><td>Kit de RT-PCR convencional</td><td>Kit de RT-PCR de uma etapa Qiagen</td><td>Kit Qiagen</td><td>Cat No 210212</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel</td><td>Qiagen QIAquick kit de extração de gel</td><td>Qiagen kit Cat</td><td> N.º 28704 ou 28706</td></tr><tr><td></td><td>Coliphage MS2</td><td>ATCC</td><td>Cat No 15597-B1</td></tr><tr><td></td><td>Transcrições</td><td></td><td></td>de escoamento de RNA</tr><tr><td>Plataforma de PCR em tempo real</td><td>Applied Biosystems</td><td>Modelo ABI 7500</td>Placa de reação óptica de 96 poços Thermo Scientific Cat No 4316813<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td><a href="http://www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/%20https:/www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/lt?cmd=catProductDetail&amp; showAddButton=true& productID=4306311&CódigoDoProduto _bcs_=H4sIAAAAAAAAAI1RTWvDMAz9Nb4srDg2yXpNW3rZVyHbuRhHSQx2HWwnJf9%2BUkO6scMYGEmWnqX3%0A5Mec8e0p%2BGbUKWZMlFkNYTIa4h%2F5PqWByYqJI57r9bpJPQTnWxPRb7R3mB4jGrig6b0DdD40WOyT%0As9iBCUmHb1MYge78iYi06ZznPEdd. 0exacF6LkD5h%2BNTr4yg1II0DH5C6rmh6imSA7GuuInsIq5TUy%0AjD6Yf%2FKU1Zav3NBrlZT13cr8s0ajGhNAJ4xsYvKoXcPkAYEHEwer5jrNFuWVdF1ieajNpbPwAhPY%0AvUrQ%2BTAjAt88w4zlm8Ly%2FYRha2yiyeUSUJM35ajHt%2BZiUS0KuWNityrHkLSjuyHUDbkgfuxgbfwx% 0AD9Q0vydo9rrs4te675%2FTKhvpd74AhB0C9yUCAAA%3D& returnURL=http%3A%2F%2Fwww.thermofisher.com%3A80%2Forder%2Fcatalog%2Fen%2FUS%2Fadirect%2Flt%3Fcmd%3DcatDisplayStyle%26catKey%3D101%26filterType%3D1%26OP%3Dfilter%26filter%3Dft_1101%252Ff_2005260*">MicroAmp Clear Adhesive Film&nbsp; </a></td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat No 4306311</td></tr></tbody></table>

swab método de amostragem para a detecção do norovírus humano em surfaces

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

noroviruses humanos são uma das principais causas da epidemia e gastroenterite esporádica em todo o mundo. Porque a maioria das infecções são ou transmitida diretamente por via da pessoa-a-pessoa ou indirectamente através de superfícies ambientais ou alimentos, fômites contaminados e superfícies inanimadas são veículos importantes para a propagação do vírus durante surtos de norovírus. Nós desenvolvido e avaliado um protocolo com cotonetes macro-espuma para a detecção e tipagem de norovírus humanos de superfícies duras. Comparado com cotonetes com ponta de fibra ou toalhetes anti-estáticos, compressas macro-espuma permitir a recuperação de vírus (intervalo 1,2-33,6%) das superfícies de assento de sanita de até 700 cm2. O protocolo inclui passos para a extracção do vírus a partir dos cotonetes e ao aumento da concentração do RNA viral utilizando colunas de centrifugação. No total, 127 (58,5%) das 217 amostras de esfregaço que tinham sido recolhidas a partir de superfícies em navios de cruzeiro e instalações de cuidados de longo prazo, onde norovirus gastroenterite tinham sidorelatado testou positivo para GII norovirus por RT-qPCR. Destes 29 (22,8%) poderia ser genotipados com sucesso. Em conclusão, a detecção de norovírus em superfícies ambientais utilizando o protocolo desenvolvido que pode ajudar a determinar o nível de contaminação do meio ambiente durante surtos, bem como a detecção de vírus quando as amostras não estão disponíveis clínicos; pode também facilitar o acompanhamento da eficácia de estratégias de remediação.

A Figura 1 apresenta um fluxograma do protocolo de amostragem cotonete. Este protocolo consiste em quatro etapas principais; 1) coleta de amostra, 2) o armazenamento de amostras e transporte, 3) purificação viral RNA e concentração e 4) ensaio de RT-qPCR e genotipagem. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55205/55205fig1.jpg" /> Figura 1: Fluxograma do protocolo final para amostragem de supe...

Uma metodologia de amostragem baseada em macroespuma foi desenvolvida e avaliada para a detecção e quantificação de norovírus em superfícies duras ambientais.

Swab método de amostragem para a detecção do norovírus Humano em Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

O objetivo geral do nosso método de amostragem de superfícies baseado em macroespuma é identificar a etiologia do surto, avaliar globalmente a dinâmica da contaminação ambiental pelo vírus e a eficácia das estratégias de remediação para o norovírus. Este protocolo detalha como coletar amostras com swab de superfícies ambientais, como esses swabs devem ser armazenados e transportados, e qual protocolo laboratorial é recomendado para a detecção e tipagem do norovírus a partir dessas amostras. As principais melhorias deste protocolo de swab ambiental para norovírus são a determinação do melhor tipo de material do swab, a quantidade de norovírus que pode ser recuperada de superfícies duras e a comprovação de que o protocolo pode ser usado efetivamente para amostrar áreas superficiais maiores.Neste vídeo, dois dos meus cientistas da equipe, Geun Woo Park e Preeti Chhabra, demonstrarão o protocolo de swab para detecção e tipagem de norovírus. Para iniciar a coleta com swab, dirija-se à área de amostragem e passe o swab pela área de amostragem com um movimento na direção horizontal, um movimento na direção vertical e um movimento na direção diagonal. Coloque cada swab em um tubo separado e feche a tampa firmemente.Colete amostras de superfícies de aço inoxidável, de uma superfície de assento de vaso sanitário e de uma maçaneta. Em seguida, rotule um tubo de 15 mililitros e uma coluna RNA Midi para cada amostra. Inclua um controle negativo de extração em cada experimento.Prepare um frasco vazio para coletar o resíduo do tampão de extração universal de ácidos nucleicos ou UNEX. Para preparar a solução de lise para 10 cotonetes, misture 25 mililitros de tampão UNEX com 25 mililitros de PBST. Adicione 50 microlitros de suspensão de colifago MS2 a 50 mililitros da solução de lise.Coloque um swab em um tubo de 15 mililitros e adicione cinco mililitros de solução de lise. Misture o swab na solução e incube a mistura à temperatura ambiente. Adicione cinco mililitros de etanol a 100% em cada tubo e vortexe os tubos por 10 segundos.Remova cuidadosamente o swab do tubo de 15 mililitros, pressionando-o suavemente contra a parede do tubo para remover o excesso de líquido e, em seguida, descarte o swab. Transfira cuidadosamente 4,5 mililitros da mistura de etanol UNEX para uma coluna Midi e centrifugue a coluna. Após a centrifugação, descarte o filtrado.Carregue outros 4,5 mililitros da mesma mistura na mesma coluna e, em seguida, centrifugue a coluna. Descarte o filtrado. Para a primeira lavagem, adicione 3,5 mililitros de etanol 70% na coluna Midi e centrifugue a coluna.Após a centrifugação, descarte o filtrado. Para a segunda lavagem, adicione outros 3,5 mL de etanol 70% na coluna Midi. Centrifugue e descarte o filtrado.Para a centrifugação a seco, centrifugue as colunas Midi para remover todos os vestígios de etanol. Coloque a coluna Midi em um novo tubo de centrífuga de 15 mililitros. Adicione 250 microlitros de tampão de eluição sobre a coluna Midi e aguarde um minuto antes de centrifugar para obter a maior recuperação possível de RNA viral.Adicione 500 microlitros de tampão de ligação de RNA a 250 microlitros de RNA e vortexie a mistura por 10 segundos. Adicione 750 microlitros de etanol a 100% e vortexie por 10 segundos. Em seguida, rotule uma coluna de centrifugação para cada amostra.Carregue a amostra de 750 microlitros em uma coluna de centrifugação e centrifugue as colunas. Descarte o fluxo passante. Carregue os 750 microlitros restantes em uma coluna de centrifugação e centrifugue as colunas.Para a pré-lavagem, adicione 400 microlitros de tampão de preparação de RNA a cada coluna de centrifugação e centrifugue a coluna. Descarte o fluxo passante. Para a primeira lavagem, adicione 800 microlitros de tampão de lavagem de RNA a cada coluna de centrifugação e centrifugue as colunas.Descarte o fluxo inicial. Para a segunda lavagem, adicione 400 microlitros de tampão de lavagem de RNA a cada coluna de centrifugação e centrifugue-as. Descarte o fluxo inicial.Para a centrifugação a seco, gire a coluna de centrifugação para remover todos os vestígios do tampão de lavagem. Transfira cuidadosamente a coluna de centrifugation para um tubo microcentrífugo limpo de 1,5 mililitro. Adicione 25 microlitros de tampão de eluição sobre a coluna de centrifugação e incube a coluna por um minuto à temperatura ambiente para aumentar a recuperação de RNA viral da coluna.Coletar o RNA por centrifugação da coluna de centrifugação a 10.000 vezes G durante um minuto. Prosseguir diretamente para a PCR em tempo real. Antes de continuar com a RTPCR multiplex em tempo real, limpar as superfícies de trabalho, pipetas e centrífugas com uma solução de descontaminação de RNase.Descongele os reagentes de PCR em tempo real no gelo. Descongele o RNA da amostra no gelo em uma área separada. Determine o número de reações e prepare pelo menos 10% a mais de reagente para a mistura mestra para compensar perdas durante a pipetagem.Em seguida, agite os componentes individuais da mistura mestra em vórtex por cinco segundos. Misture cuidadosamente a enzima batendo suavemente no tubo. Centrifugue brevemente os componentes da mistura mestra por cinco segundos.Em seguida, prepare a mistura-mestra para a detecção de norovírus G1 e G2 por RTPCR de acordo com as instruções do kit e adicione os oligonucleotídeos específicos para norovírus (primers e sondas) em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. A seguir, homogeneíze a mistura-mestra pipetando sete vezes para cima e para baixo. Aliquote 22 microlitros da mistura-mestra em cada poço da placa de PCR em tempo real.Vortexie a amostra de RNA por cinco segundos e recolha o conteúdo por centrifugação de cinco segundos. Adicione três microlitros de controles positivos de RNA da amostra e diluições seriadas de 10 vezes dos transcritos de RNA G1 e G2 à placa de PCR em tempo real. Adicione três microlitros de água livre de nucleases aos poços do controle sem molde, ou controles NTC.Selar a placa com filme adesivo óptico. Centrifugar cuidadosamente a placa a 1.300 × g por um minuto para remover quaisquer bolhas de ar ou gotículas de líquido que possam estar presentes nos poços. Em seguida, preparar a PCR em tempo real e inserir as condições de termociclagem.Determine as curvas padrão para os transcritos G1 e G2. Converta os valores de Ct em cópias de RNA utilizando a curva padrão respectiva. Calcule a razão entre o volume do eluente de RNA total e a quantidade total de RNA utilizada para o ensaio em tempo real, a fim de determinar o número total de cópias de RNA por amostra.Para genotipar as amostras positivas para norovírus utilizando RTPCR convencional hemi-nested, prepare primeiro uma mistura mestra para a primeira rodada de RTPCR e distribua alíquotas de 20 microlitros em tubos PCR previamente etiquetados. Adicione cinco microlitros de RNA a cada tubo. Após a conclusão da primeira rodada de RTPCR, prepare uma mistura mestra para a segunda rodada de PCR hemi-nested distribuindo alíquotas de 23 microlitros em novos tubos.Por fim, adicione dois microlitros do produto da PCR da primeira rodada a cada tubo. O método de coleta por swab baseado em macroespuma foi testado em campo em amostras coletadas de um navio de cruzeiro que havia relatado casos suspeitos de gastroenterite por norovírus. Quatro das 17 amostras de swab positivas para norovírus puderam ser genotipadas, e todas as amostras apresentaram sequências idênticas do tipo G2.A determinação da carga viral permitiu a avaliação de superfícies fortemente contaminadas, como assentos de vaso sanitário. A relação dos valores de limiar de ciclo, ou valores de Ct, foi determinada por RT-PCR em tempo real em relação à capacidade de sequenciar essas amostras. No total, 127 das 217 amostras de swab testaram positivo para norovírus G2.Amostras de swab com valores de Ct entre 24 e 27 e entre 28 e 31 foram genotipadas com taxas de 100% e 72,2%, respectivamente. Em contraste, apenas 22% e 1,6% das amostras de swab com valores de Ct entre 32 e 36 e entre 37 e 40 foram sequenciadas com sucesso. Como demonstramos, este protocolo permite determinar o nível de contaminação ambiental durante surtos de norovírus, detectar a causa provável de um surto quando amostras clínicas não estão disponíveis e, também, determinar a eficácia das práticas de limpeza.Para obter o resultado mais preciso, é muito importante seguir este protocolo exatamente para minimizar a variação dos resultados entre as diferentes amostras.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um Um passo-ensaio de RT-PCR para a detecção e identificação genogrupo de isolados Norovirus a partir de fezes de crianças, que utiliza iniciadores e sondas de TaqMan específicos para o quadro de leitura aberta 1 (ORF1)-ORF2 região de junção, a região mais conservada do genoma norovírus é descrito. A não-comercial, custo-efetivo método de extração de RNA é detalhado.

Detecção e Genogrouping de norovírus a partir de fezes das crianças, Taqman Um passo-RT-PCR

Este vídeo demonstra um ensaio para quantificar a ligação de partículas semelhantes a vírus de norovírus humano (VLPs) a bactérias intestinais humanas. As suspensões bacterianas são misturadas com as VLPs e incubadas para permitir a formação de complexos VLP-bactérias. Os complexos são então marcados com anticorpos específicos de VLP marcados com fluoróforo, seguidos de visualização e quantificação baseadas em citometria de fluxo para identificar a porcentagem de bactérias ligadas à VLP.

Um ensaio para quantificar a ligação de VLPs de norovírus humano a bactérias intestinais

O método EPA 1615 usa um filtro eletropositivo para concentrar enterovírus e norovírus em águas ambientais e potáveis. Este manuscrito descreve o procedimento de coleta de amostras para análises do Método 1615.

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água pela cultura e RT-qPCR. I. Recolha de amostras de vírus

Aqui apresentamos um procedimento para medir o total de vírus cultiváveis usando a linha de células renais Buffalo Green Monkey. O procedimento fornece uma ferramenta padronizada para medir a ocorrência de vírus infecciosos em águas ambientais e potáveis.

EPA Método 1615. A medição do Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. II. De ensaio total de Vírus cultiváveis

Aqui apresentamos um procedimento para quantificar enterovírus e norovírus em águas ambientais e potáveis usando PCR quantitativo de transcrição reversa. A recuperação média do vírus das águas subterrâneas com este procedimento padronizado do Método EPA 1615 foi de 20% para o poliovírus e 30% para o norovírus murino.

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. Parte III. Detecção de vírus por RT-qPCR

Métodos de deteção de rotina utilizando a amplificação do genoma viral são limitados pela sua incapacidade de discriminar infecciosas de partículas não-infecciosas. O objetivo deste artigo é fornecer protocolos detalhados para métodos alternativos ajudar na discriminação de partículas infecciosas norovírus usando vinculação aptamer, espalhamento dinâmico de luz e microscopia eletrônica de transmissão.

Métodos de alternativas In Vitro para a determinação da integridade estrutural do capsídeo Viral

O objetivo deste protocolo é quantificar a ligação do norovírus humano eucaiótico às bactérias. Após a realização de um teste inicial de fixação vírus-bactéria, a citometria de fluxo é usada para detectar bactérias viralmente ligadas à população.

Quantificando partículas semelhantes a vírus norovírus humanos ligando-se a bactérias commensal usando citometria de fluxo

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O exercício é capaz de induzir a apoptose em células do sistema imunológico. Existem limitações de medição diversos, particularmente relacionadas com a quantidade de tempo necessário para isolar e tratar uma amostra de sangue antes da avaliação. Demonstrado é um procedimento rápido e minimamente invasivo para a análise do exercício apoptose induzida por linfócitos.

Ponta de dedo Metodologia de amostragem de sangue para a determinação da apoptose induzida pelo exercício de Linfócitos

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Swab método de amostragem para a detecção do norovírus Humano em Surfaces

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