Name: Desenvolvimento de um sistema de entrega de DNA Economical por Acufection e sua aplicação à Skin Research (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Aprenda a entregar genes imunológicos em tecido cutâneo de camundongo usando DNA plasmidial por acufection. Este método econômico auxilia pesquisadores a estudar funções gênicas em inflamação cutânea e desenvolver terapias para doenças como psoríase.

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Este trabalho foi apoiado pelo subsídio do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). Agradecemos Drs. Betty Wu-Hsieh e Chien-Kuo Lee em NTU, Leigh Zerboni na Universidade de Stanford e Dr. Peter Hoffmann, da Universidade do Havaí para a leitura do manuscrito, Yun Chien em NTU para assistência técnica, e Dr. Wen-Chi Wei na Agricultura Biotecnologia Centro de pesquisa da Academia Sinica para aconselhamento técnico.

ratinhos fêmea, com 8 - 12 semanas de idade foram usados ​​para este estudo. C57 / BL6 de tipo selvagem (WT) e IL-15 deficientes (IL-15 - / -) foram adquiridos a partir de National Center Animal Laboratory (NLAC), Taiwan e Taconic Farm, respectivamente. -IL-15 deficientes (IL-15 - / -) e IL-15 dominante (+/- IL-15 e IL-15 + / +) mostrou uma proporção de 1: 3 na segunda geração a partir do cruzamento de heterozigotos de IL-15 +/-. O genótipo de IL-15 - / - ratos foi confirmada por análise de PCR. Camundongos foram mantidos na instalação Specific Pathogen gratuito (SPF) no Laboratório animal Center (LAC), Universidade Nacional de Taiwan (NTU) College of Medicine. Todos os procedimentos animais, incluindo os materiais e métodos anestésicos foram realizados de acordo com o protocolo de animais aprovado pela Taiwan University College Nacional de Medicina e Faculdade de Animal Care Institucional Saúde Pública e Use Committee (IACUC) (Declaração de Aprovação do Protocolo animal 20130225). &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 1. Preparação de agulhas de acupuntura NOTA: agulhas de acupunctura são dispositivos médicos constituídos por uma pega e uma ponta de agulha (Figura 1A). Os diâmetros da agulha de acupuntura variou entre 0,2 mm (36 L) a 0,35 mm (28 G). Nós seleccionar o ponto mais fino do que a agulha, para evitar o dano celular excessivo potencial durante a punção da pele. Existem 4 comprimentos diferentes da agulha de 0,2 mm, sendo 13 mm (0,5 polegada), 25 mm (1,0 pol), de 40 mm (1.5 in) e 50 mm (2,0 in) de comprimento. Um conjunto de agulhas 10 com comprimento de 13 milímetros desde a aderência melhor confortável durante a oscilação da agulha na pele do ratinho C57BL / 6. Os parâmetros podem ser modificados se o método é aplicado à pele de animais maiores ou realizado por pesquisadores com as mãos maiores. <ol><li> Remover agulhas de acupunctura a partir da embalagem estéril, não pirogénico. Colocar as agulhas em um campo estéril. </li><li> Utilizar fita adesiva para ligar rotulagem 10 agulhas em conjunto ifeixe na (Figura 1B). NOTA: As agulhas 10 são geometricamente dispostos de modo a formar uma forma de cilindro. Por conveniência, utilizar uma peça de película de parafina para estabilizar o arranjo antes de aplicar a fita adesiva. Certifique-se de todos os pontos de agulha estão no mesmo plano. Usando um pacote, em vez de uma única agulha facilita infusão ADN máxima, aumentando a área de contacto entre as agulhas e a pele. </li></ol> 2. Preparação de uma quantidade grande e livre de Endotoxina O DNA de plasmídeo <ol><li> Transformar células bacterianas quimicamente competentes com o plasmídeo de ADN. </li><li> Seleccionar e inocular uma única colónia bacteriana em 3 ml de meio LB contendo antibióticos e incubar a 37 ° C num agitador durante a noite. </li><li> Dimensionar-se a cultura por diluição da cultura bacteriana em 1: 100 em 250 ml de meio LB com antibióticos e agitando durante a noite a 37 ° C. </li><li> Prepara-se uma grande quantidade de ADN, utilizando um elevado Qy, kit de preparação de plasmídeo livre de endotoxina seguindo as instruções do fabricante. NOTA: protocolo Acufection exige elevado grau de pureza e uma grande quantidade de DNA de plasmídeo. Uso de uma alta qualidade, endotoxina livre e o DNA de plasmídeo purificado em coluna é recomendado. </li><li> Elui-se o ADN em água estéril. ADN loja em pequenas alíquotas a -20 ° C até estar pronto para acufection. NOTA: Evite repetidos de congelamento e descongelamento de DNA para garantir a expressão de DNA plasmídeo consistente. </li><li> Dilui-se DNA de plasmídeo a 1 mg / ml em PBS estéril para acufection. </li></ol> 3. Procedimento para Acufection NOTA: A quantidade óptima de ADN e a área da superfície da pele o alvo pode variar para diferentes genes e precisam de ser ainda mais optimizado. A força de perfurao e o número de vezes para soltar a camada córnea da pele também pode variar dependendo da espessura da pele. Estas condições devem ser cuidadosamente determinada depois de avaliar o nível de gene transcri acufected expressãopts por qRT-PCR. <ol><li> Pesar os ratinhos e administrar tribromoetanol (400 ug por g de peso corporal) por injecção peritoneal. NOTA: 2,2,2-tribromoetanol é um agente anestésico injectável que foi utilizada em ratinhos. As soluções são preparadas por dissolução de um grau não-farmacêuticos 2,2,2-tribromoetanol (2,5 g) em água destilada (200 ml) contendo 2,5% de 2-metil-2-butanol. </li><li> Use vet oftalmológico pomada nos olhos para evitar a secura sob anestesia. NOTA: O efeito anestésico vai ser induzida em 1-2 min. Verifique o aperto reflexo dedo do pé para garantir profundidade suficiente de anestesia antes da operação. </li><li> Raspar a pele do flanco dorsal e aplica o creme depilatório para dissolver proteínas de queratina na haste do cabelo. NOTA: O uso de creme depilatório para remover o cabelo vai facilitar a infusão de DNA na pele. </li><li> Use bolas de algodão embebidas em água para limpar o creme depilatório. NOTA: O creme depilatório é solúvel em água. A remoção completa do wil cremel evitar uma superfície gordurosa e garantir um resultado melhor picada. </li><li> Usar uma mecha de algodão estéril embebido em etanol a 70% para desinfectar a superfície da pele. </li><li> Mark área alvo (1 centímetro x 1 cm) sobre a pele depilada com uma matriz pré-medido. NOTA: Marcando o site de destino ajudará a aplicar o pacote agulha para cima e para baixo dentro de uma área definida. Isto é importante para assegurar a entrega da mesma quantidade de ADN para uma área de superfície específica para minimizar a variação da experiência-a-experimento. </li><li> Colocar uma gota de 10 ul de ADN de plasmídeo (10 ug) sobre a pele marcada. NOTA: A quantidade de ADN para acufection varia com diferentes genes e o tipo de vector de expressão. A quantidade de ADN utilizado deve ser cuidadosamente ajustado antes de realizar a experiência de interesse. A 10 uL é uma pequena gota de líquido e situa-se bem sobre a pele raspada e depiladas sem rolar para baixo enquanto picar. Incluem um grupo de controlo de ratinhos tratados com 10 uL de ADN vector vazio para comparar com ratinhos umacufected com o gene estudo. </li><li> Segurar o feixe de agulhas de acupuntura (Figura 1B) e picar a superfície marcada com um movimento para cima e para baixo para 100 vezes ou até que a humidade a partir do ADN em PBS na pele desaparece. NOTA: Alguns vermelhidão da superfície da pele podem ocorrer. Evite fazer cortes profundos que sangram. O número de cima e para baixo da punção movimentos sobre a superfície da pele está operativamente determinada quando a humidade a partir do ADN em PBS (10 mL) desaparece na pele. Decidimos 100 vezes em 30 s, porque ele tem dado os resultados mais consistentes de genes entregou-acufection. Se for o caso, as agulhas podem ser reutilizados para até 6 picadas na pele-alvo (1 cm x 1 cm cada). Lavam-se as agulhas em etanol a 70% e PBS entre acufection. Mudar para novas agulhas quando eles são opaca ou por DNA de plasmídeo diferente a fim de evitar a contaminação cruzada. </li><li> Coloque ratinhos acufected sobre uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo até acordado. </li><li> Voltar ratos para sua gaiola quando eles têmconsciência suficiente recuperou. Nota: Observar ratinhos acufected em gaiola separada (menos de 5 animais por gaiola) da gaiola de ratinhos acufected-un. </li><li> Coloque a garrafa de água no lugar e voltar a gaiola para o IVC (gaiola ventilado individualmente) rack. </li></ol> Cuidados 4. Pós-operatório <ol><li> Durante as primeiras 48 h após o procedimento, ratos acompanhar de perto para qualquer desconforto incluindo alterações comportamentais (agitação, agitação ou eating disorder) ou aparência anormal (pelagem áspera ou postura arqueada). </li></ol> 5. Imiquimod (IMQ) Tratamento de Pele de IL-15ΔE7-acufected NOTA: expressão transcricional e produção de proteína do gene acufected são detectáveis ​​no dia 3. Os ratinhos acufected com o plasmídeo de interesse podem ser tratadas com diferentes tipos de estimulantes 3 dias após a transfecção. Nós ilustramos aqui tratando a pele IL-15ΔE7-acufected rato com creme IMQ. IMQ é um f imidazoquinolin amina aprovadoou o tratamento de verrugas genitais externas e perinatais 13. Tratamento IMQ tópica é mostrado para induzir doenças de pele com psoríase de tipo humano em ratinhos com a manifestação de pele escamosa, proliferação epidérmica e infiltração 12, 14, 15 de neutrófilos dérmica. NOTA: O vector plasmídeo continha-rato de comprimento completo de ADNc de IL-15, sob a regulação do factor de alongamento 1 α (PEF), flanqueado com um péptido sinal de IL-2 e uma etiqueta FLAG no terminal C (pEF-IL 15, 5859 pares de bases), que foi construído como descrito por Bamford et al. 16. O plasmídeo é utilizado como um modelo de IL-15 para eliminar os primeiros 16 aminoácidos nos resíduos 33-48 do exão 7 do gene da IL-15 para IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5,811 pares de bases) por SOE (síntese por extensão de sobreposição) método de PCR de 17. colônias de bactérias que estavam com sucessotransformada com IL-15ΔE7 foram verificadas por digestão com enzimas de restrição e sequenciação de ADN, seguido por 12, 18. Uma grande quantidade de DNA de plasmídeo isento de endotoxina foi preparado como descrito no passo 2 do protocolo. <ol><li> Anestesiar ratos acufected por injecção intraperitoneal de tribromoetanol (400 ug por g de peso corporal) e aplicar veterinário pomada oftalmológica em olhos para evitar a secura sob anestesia. Verifique o aperto reflexo de igual para assegurar profundidade suficiente de anestesia antes do início dos procedimentos operatórios. Observação: Uma vez que a pele de 2 cm x 2 cm de vão ser tratados para IMQ, 2 doses de pIL-15ΔE7 plasmídeo de ADN (10? G em 10? L de PBS por dose) é acufected em 2 locais-alvo (1 cm x 1 cm cada). </li><li> Mark flanquear pele (2 cm x 2 cm), cobrindo a área acufected. </li><li> Use aplicador Q-tip para aplicar topicamente creme IMQ sobre a área de superfície marcada. Nota: passo 5.1 só é levada a cabo durante a primeira dose (60 mg / dose).As doses seguintes consecutivos são aplicados aos ratos não-anestesiados. </li><li> Documentar as alterações de pele dorsal-tratada IMQ diariamente com uma câmara de vídeo de alta definição. Nota: Uma pessoa segura o mouse enquanto outro está gravando. As imagens estáticas são filmados e editados em um momento posterior. </li><li> Eutanásia ratos por injecção de uma overdose de tribromoetanol (800 ug por g de peso corporal) seguida por deslocamento cervical no dia 4 ou dia 7 após o tratamento IMQ. A pele é retirado e processados ​​(Passos 4,1-4,5). </li></ol> 6. homogeneizado rato Pele <ol><li> Use um par de tesouras cirúrgicas para fazer um corte horizontal da base da cauda. Proceder bilateralmente para a base do membro posterior e continuar a cortar verticalmente ao longo do flanco para a base do membro anterior. </li><li> Cuidadosamente tirar a pele a partir do tecido subjacente de posterior para o anterior. Use a tesoura para cortar a pele dorsal. Coloque a pele em uma placa de Petri estéril. </li><li> Use um bisturi para extirpar-alvopele e congelá-lo em azoto líquido imediatamente. Nota: O mesmo tamanho de pele sem acufected (1 cm x 1 cm) ou com tratamento IMQ (2 cm x 2 cm) é fixada para cada rato para minimizar variações experimento-a-experimento. </li><li> Colocar o tecido de pele congelado no centro de uma argamassa de compartimento 2 pré-refrigerada com alças e um pilão. Use um martelo de chumbo na argamassa para pulverizar o tecido. </li><li> coloque rapidamente o tecido pulverizado para um novo tubo contendo 500 ul de reagente de lise de células para a extracção de RNA ou a um tubo contendo 50 uL de PBS e 1x cocktail inibidor de protease para obter lisado de proteína. </li></ol> 7. H &amp; E e imuno-histoquímica Coloração de Secção de pele <ol><li> Colocar o tecido da pele de uma cassete e mergulhá-lo em paraformaldeído a 4% durante a noite. </li><li> Incorporar e seco de tecido, que, no nosso caso, foi realizada pelo Laboratório de Patologia no LAC, NTU. Nota: A secção é cortada a uma espessura de 5? M. seç tecido lugarons em linas carregadas positivamente. </li><li> Aquecer as lâminas a 65 ° C durante 15 min. </li><li> Colocar as lâminas em um suporte de coloração. Imergir a cremalheira para dentro do tanque correspondente contendo substituto de xileno durante 5 minutos duas vezes, seguido por imersão sequencial em 100%, 95%, 80%, 75%, 60% e 50% de etanol (5 min cada) para re-hidratação. Mergulhar as lâminas em água da torneira durante 3 min antes da coloração. </li><li> Execute hematoxilina e eosina. Nota: H &amp; E mancha foi realizado a pedido no Laboratório de Patologia no LAC, NTU. </li><li> Para coloração imuno-histoquímica, bloquear a secção com uma solução de bloqueio à temperatura ambiente durante 5 min para reduzir a colorao de fundo n especica. Nota: A solução de bloqueio é comercialmente desenvolvidas com técnicas de imunocoloração. Nenhum soro animal é contido neste produto. </li><li> Dip slide em PBS para lavar a solução de bloqueio. </li><li> Dilui-se a solução bloco em PBS a 1:10 e adiciona soro fetal de bovino a 2% (FBS) (solução diluente). </li><li&gt; Pipeta o anticorpo primário diluído apropriadamente para a secção e incubar durante 60 min à temperatura ambiente. Nota: Os anticorpos são diluídos em solução diluente. As concentrações de anticorpos para esta coloração foram optimizados em 1: 800 e 1: 200 para Ki-67 (clone SolA15) e Ly6G (clone 1A8), respectivamente. Estas concentrações são encontrados para mostrar mancha distinta, sem coloração de fundo. <ol><li> Corar uma secção de série no mesmo ensaio com a mesma solução omitindo o anticorpo primário para controlar a ligação não específica do anticorpo secundário. </li></ol></li><li> Lave as lâminas três vezes em TBS mais 0,1% de Tween-20 (solução de TBST) durante 5 minutos cada. Mudança solução entre as lavagens. </li><li> Pipetar uma gota de polímeros marcados para cada secção e incubar à temperatura ambiente durante 40 min. Nota: O polímero marcado está comercialmente preparada por combinação de polímeros de aminoácidos com peroxidase e anticorpo secundário o qual é reduzido a um fragmento Fab&#39;. O reagente está pronto a ser usado paracoloração imuno-histoquímica de secções de tecido de ratinho. </li><li> Lave as lâminas três vezes em TBST, durante 5 minutos cada. Mudança solução entre as lavagens. </li><li> Pipeta 3,3&#39;-diaminobenzindine tetracloridrato solução (DAB) na seco de tecido e deixe repousar à temperatura ambiente até que um precipitado castanho é visível sob um microscópio de campo brilhante. Nota: O tempo para DAB para precipitar na presença de peroxidase é de cerca de 30 min. </li><li> Imergir as lâminas em água para parar a atividade da peroxidase. Dip slides em solução verde de metilo para coloração nuclear. Lave as lâminas três vezes em PBS durante 5 min cada. </li><li> Coloque uma lamela sobre a secção corada que é coberta com meio de montagem permanente (8 mL por secção). </li></ol> 8. Foto e análise do tecido Seção manchado <ol><li> Visualizar secções de tecidos coradas H &amp; E e IHC sob um microscópio de campo brilhante. As imagens de captura usando dispositivo de acoplamento da câmara de carga (CCD) ligado ao microscópio. para qanálise quantitativas, software de imagem pode ser usado <ol><li> Digitalizar todo o secções coradas usando um scanscope com um objetivo 20X. </li><li> Medir a espessura da epiderme dentro de um segmento de 1 mm da epiderme e contar o número de células imunorreactivas-Ki67 no interior do segmento. NOTA: Quantitative análise é realizada usando microscopia de automação e imagem software de análise. A espessura da epiderme é definida pela distância entre a camada basal e a camada mais externa da epiderme. </li><li> Contar o número de células imunorreactivas Ly6G na área dérmica (230 x 270? M 2 rectângulo) imediatamente abaixo tópico da pele tratados com IMQ. </li></ol></li></ol>

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Os autores não têm interesses financeiros para divulgar.

A etapa mais crítica para assegurar a expressão do DNA de plasmídeo acufected é a oscilar de forma uniforme e soltar a camada córnea da pele. Ao empurrar as agulhas suavemente sem cortar a pele, a força deve ser forte o suficiente para deprimir a superfície. Para facilitar a absorção de ADN em 10 de soluo de em um 1 cm x 1 centímetro a área de superfície, as agulhas devem oscilar para cima e para baixo para cerca de 100 vezes em 30 s. Pode-se determinar a força que tem de picar a pele e anotando o número de vezes que é ...

A pele é a primeira linha de defesa do hospedeiro. Os queratinócitos (KCs) são o tipo de célula principal na pele de seres humanos e ratinhos. Em resposta a estímulos ambientais (por exemplo, luz solar, oxigénio, produtos químicos e invasão patogénico), KCs são activados e produzir uma vasta gama de citocinas prinflamatias e quimiocinas, tais como IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF- α e GM-CSF 1. Juntos, desencadear o recrutamento de células do sistema imunológico para a pele. Inflamação cutânea agravada é muitas vezes associada com numerosas doenças humanas, incluindo a dermatite de contacto ectópico aguda e inflamação mediada por células T crónica (por exemplo, dermatite de contacto alérgica e psoríase) 2. Modular as respostas pró-inflamatórias da pele através da inibição da activação KC é uma abordagem aceitável para tratar a inflamação cutânea. Este protocolo descreve uma nova abordagem para expressar transitoriamente um gene de citoquina na epiderme, a fim de estudar res imunesponse como consequência de um tal tratamento na pele. A epiderme compõe a camada mais superficial da pele. Ele serve como uma barreira física manter as substâncias externas, tais como os ácidos nucleicos e os agentes patogénicos de entrar nas camadas mais profundas da pele. Várias técnicas sem agulha foram estabelecidas para a transferência de ADN epidérmico 3, 4. ADN em solução ou associado com lipossomas catiónicos ou vectores de adenovus foi directamente aplicado à epiderme modificados com técnicas tais como a remoção do estrato córneo ou para o tratamento com depilating reagente. A remoção do epitélio córneo facilita ADN de atravessar a barreira epidérmica e interacção com queratinócitos e células de Langerhans para induzir respostas imunes 5. Enquanto uma grande área de superfície está disponível para transferência de DNA e esta abordagem não envolve agulhas, há desvantagens, incluindo a exigênciapara as grandes quantidades de ADN (10 - 100), o tratamento dura sobre a pele por decapagem e os resultados inconsistentes na indução da resposta imunitária nos animais imunizados, sem reforço de entrega de ADN 6. Entrega intracelular mediada por micropartícula de ADN nu para a pele tem sido mostrado para ser altamente eficiente e reprodutível para a indução de resposta imune 7, 8. Uma pistola de genes de mão tem sido usado para bombardear o local alvo da pele com partículas de ouro revestidas com ADN de plasmídeo de 2 um de diâmetro em tamanho por meio de hélio pressurizado fluxo de ar 9. O DNA de plasmídeo é presumivelmente absorvidos pelas células dendríticas (DC) KCsand na pele e a proteína é expressa localmente ou ser transportado para nódulos linfáticos de drenagem por DCs 10. Embora o sistema arma gene é simples e requer experiência técnica limitada, o custo para a preparação e entrega dos &quot;bul DNAlet &quot;(isto é, pós de ouro, de gás hélio) e para a pistola de genes em si tem limitado a sua aplicação geral. Além disso, o requisito de um sistema de fornecimento de gás hélio limita a facilidade de transporte pistola de genes quando as experiências são realizadas em locais diferentes. microdispersão demonstrou-se conseguir uma maior eficiência de transferência de genes que única injecção e bombardeamento de partículas 11. microdispersão utiliza uma pistola de tatuagem para entregar ADN para a pele sem o uso de grânulos de partículas 11. oscilante as microagulhas na pele utilizando esta abordagem é provável raspar directamente a membrana celular e assim transferir DNA para várias células, ao mesmo tempo. no entanto, a dor associada com o grande número de injecções com agulhas 0,254 mm de diâmetro é uma desvantagem. Aqui nós fornecemos uma abordagem alternativa para a entrega de ADN in vivo. O &quot;acufection&quot; </strong&gt; protocolo que descrito aqui oferece uma maneira económica e eficaz para entregar o ADN de plasmídeo na pele do rato. Resumidamente, dez agulhas de acupunctura (0,2 mm de diâmetro x 13 mm de comprimento) foram ligados em conjunto por uma fita adesiva. Um volume de 10? L de PBS com 10 ug de ADN de plasmídeo contendo o transgene de interesse foi colocado sobre a pele tratada com creme de barba, creme depilatório flanco. Utilizando o feixe de agulhas de acupuntura para oscilar a superfície (1 cm x 1 cm) da pele, as queratinas na camada córnea foram soltos e o DNA de plasmídeo aplicada à superfície foi absorvido para dentro da epiderme. os danos da pele foi monitorado e encontrado para ser mínima. A expressão do gene transfectado na pele acufected foi confirmada por tanto quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) e ELISA. Os efeitos imunomoduladores dos entregue-acufection IL-15ΔE7 na inflamação cutânea foram demonstrada utilizando o modelo de ratinho tratado com IMQ 12. Enquanto acufection prova ser um dema fácil e menosnding método para entrega de ADN in vivo, a quantidade óptima de ADN para genes diferentes e os tempos para picar a pele tem que ser cuidadosamente optimizadas para obter resultados reprodutíveis.

<table><tbody><tr><td>Accu Handy Needle</td><td>Accu</td><td>36Gx0.5</td><td>Dispositivo médico</td></tr><tr><td>NairTM Loção</td><td>Igreja & Dwight</td><td>N/A</td><td>Use para remover o cabelo</td></tr><tr><td>Shandon Substituto de xilina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6764506</td><td>Desparafinização</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-Tribromethanol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4,840-2</td><td>Anestesia</td></tr><tr><td>2-metil-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td>Solvente para a dissolução de avertin</td></tr><tr><td>DifcoTM LB caldo, Miller</td><td>BD</td><td>244620</td><td>Propagação e manutenção de E. coli para biologia molecular</td></tr><tr><td>Kit ELISA Ready-SET-Go complexo de camundongo IL-15/IL-15R</td><td>eBioscience</td><td>88-7215</td><td>Medir proteína IL-15</td></tr><tr><td>Anti-camundongo Ly6G</td><td>BioLegend</td><td>127601</td><td>Anticorpo usado para coloração imuno-histoquímica</td></tr><tr><td>anti-camundongo Ki-67</td><td>eBioscience</td><td>14-5698-80</td><td>Anticorpo usado para coloração imuno-histoquímica</td></tr><tr><td>Coloração simples Mouse MAXPO (Rato)</td> <td>Nichirei Biosciences</td><td>414341F</td><td>Reagente para bloquear o sinal de fundo na coloração de camundongo</td></tr><tr><td>para camundongo Kit de substrato DAB Peroxidase (HRP)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>Substrato de peróxido para coloração imuno-histoquímica</td></tr><tr><td>Bloco Ultra V</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-060-UB</td><td>Reduzir coloração de fundo inespecífica</td></tr><tr><td>Metil verde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8884</td><td>Coloração nuclear</td></tr><tr><td>Vecta MountTM</td><td>Vector Laboratories</td><td>M-5000</td><td>Preservando permanentemente as manchas histoquímicas Comprimidos</td></tr><tr><td>de coquetel inibidores de protease</td><td>Roche</td><td>04-693-116-001</td><td>Inibe a atividade da protease no lisado celular</td></tr><tr><td>Aldara creme</td><td>3M Parmaceuticals</td><td>N/A</td><td>5% imiquimod creme</td></tr><tr><td>Bessman Tissue Pulverizer</td><td>Spectrum Labs</td><td>189475</td><td>Use para pulverizar o ciclador de ABI7900HT de tecido da pele</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>ensaio de PCR quantitativo em tempo real</td></tr><tr><td></td><td>Filmadora Panasonic</td><td>HDC-SD60</td><td>Documentação de imagem</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>ZEISS</td><td>N/A</td><td>Microscopia de campo claro</td></tr></tbody></table>

desenvolvimento de um sistema de entrega de dna economical por &quot;acufection&quot; e sua aplicação à skin research

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

A desregulação da resposta imune em pele está associado com numerosas desordens da pele humanos. transferência directa de genes imuno-relacionados no tecido da pele é uma abordagem fascinante para investigar a modulação imune de inflamação cutânea em modelos de ratinho de doenças humanas. Aqui apresentamos um protocolo de baixo custo que entregue DNA nu na pele do rato e leva a expressão do transgene. O método é cunhado &quot;acufection&quot;, que denota ADN mediada por punção trans fecção acu. Para realizar acufection, pele de ratinho foi infundido em primeiro lugar com ADN em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e depois picado levemente com um feixe de agulhas de acupunctura para facilitar a absorção de ADN e transfeco em culas. O DNA de plasmídeo é presumivelmente retomado pelo queratinócitos e células dendríticas (DC) na pele e expressa em proteína. Picada mecânica com o agulhas per se não causar danos à pele ou induzir a ativação de queratinócitos. A expressãodos genes transfectados foi detectado na pele, tanto a nível da transcrição e tradução seguintes acufection durante 2 dias e mantiveram-se a 7 dias. O objectivo principal para o desenvolvimento deste método acufection foi investigar uma isoforma anteriormente indefinido de IL-15. Usando este método, um splicing alternativo de IL-15 isoforma com remoção parcial do exão 7 (IL-15ΔE7) foi expressa na pele e subsequentemente tratado com um receptor de tipo Toll 7 (TLR7) agonista, imiquimod (IMQ), para induzir a inflamação. Acufection-entregue IL-15ΔE7 na pele suprimiu a proliferação de queratinócitos, a espessura da epiderme e o recrutamento de neutrófilos na inflamação cutânea induzida por IMQ. Com o aumento do interesse em identificar os mecanismos de regulação da inflamação cutânea, o protocolo aqui descrito proporciona um custo alternativo eficaz e versátil para o sistema de canh de genes ou microdispersão para entrega de ADN in vivo. Ele pode potencialmente permitir a descoberta da função de um romancegene na pele ou para a investigação de novos tratamentos para doenças cutâneas.

Enquanto alguns vermelhidão foi evidente durante a primeira hora depois da punção com agulhas de acupunctura, a pele foi afastada no dia 2, e não se observou qualquer reacção adversa da pele até ao dia 7 após repicagem (Figura 2A). Agulha de perfuração induzida nível muito baixo de ortoceratose epidérmica e dérmica infiltração mínima por meio de análise de H &amp; E em comparação com a pele não tratada (Figura 2B). A espessura d...

Este protocolo é uma alternativa de custo eficaz para a expressão de ADN de plasmídeo despido na pele do rato. O objectivo geral do protocolo é a entrega de genes imuno-relacionados no tecido da pele para delinear o papel funcional de um gene específico em inflamação cutânea.

Desenvolvimento de um sistema de entrega de DNA Economical por &quot;Acufection&quot; e sua aplicação à Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

O objetivo geral deste procedimento é introduzir genes relacionados ao sistema imunológico no tecido da pele para delinear o papel funcional de um gene específico na inflamação cutânea. Este método pode auxiliar na descoberta da função de um gene novo na pele, bem como no desenvolvimento de novas terapias para doenças cutâneas, como a psoríase.A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma maneira econômica de expressar DNA plasmidial na pele de camundongo. Para preparar o DNA plasmidial, inocular três mililitros de meio LB suplementado com antibiótico com a colônia bacteriana previamente transformada e selecionada. Incubar a cultura durante a noite em agitador a 37 graus celsius.Após a incubação prolongada, dilua o cultivo bacteriano em 250 mililitros de meio LB, suplementado com antibióticos, para amplificar o cultivo. Incube o cultivo durante a noite a 37 graus Celsius com agitação. Utilize um kit de preparação de plasmídeo livre de endotoxinas de alta qualidade para preparar uma grande quantidade de DNA.Dilua o DNA plasmidial obtido em PBS estéril até uma concentração final de um miligrama por mililitro. Após anestesiar o camundongo, aplique pomada oftálmica veterinária em seus olhos para prevenir ressecamento. Em seguida, depile a pele nas costas do animal.E aplique um creme depilatório para dissolver as proteínas de queratina nos folículos capilares remanescentes. Após a depilação, remova o creme com algodão umedecido em água. Usando um cotonete estéril, umedecido em etanol 70%, desinfete a superfície da pele e marque a área alvo da pele com o molde previamente preparado. Aplique 10 microlitros da solução de DNA contendo 10 microgramas de DNA plasmidial na área da pele desejada.Para acufectar o camundongo, segure o aparelho de acupuntura perpendicularmente à pele e realize punções repetidas na superfície designada. Faça isso 100 vezes em 30 segundos ou até que a solução aplicada na pele seja absorvida. Para obter uma expressão bem-sucedida do DNA plasmidial no tecido da pele, é importante evitar cortar profundamente na pele e garantir que a solução de DNA seja bem absorvida.Após concluir o procedimento, coloque o camundongo infectado sobre uma placa aquecida para manter sua temperatura corporal até a recuperação da anestesia. Quando o camundongo recuperar consciência suficiente, devolva-o à sua gaiola e forneça água e alimento. Monitore atentamente o camundongo quanto a quaisquer sintomas de desconforto, incluindo alterações comportamentais e aparência anormal, nas primeiras 48 horas após o procedimento.Marque a pele do flanco que cobre a área de dois centímetros por dois centímetros previamente afetada com IL-15deltaE7. Em seguida, usando um aplicador de algodão, aplique creme de imiquimode topicamente na área superficial designada. Para monitorar as alterações diárias da pele dorsal tratada com imiquimode, um pesquisador deve registrar enquanto o segundo segura o camundongo firmemente e expõe a área tratada à visão da câmera de vídeo de alta definição.Observe alterações como escamas prateadas, placas ou eritema na pele tratada. Após eutanasiar o camundongo conforme descrito, faça uma incisão horizontal na base da cauda usando uma tesoura cirúrgica e alargue o corte bilateralmente em direção à base de cada membro posterior. Em seguida, prossiga com cortes verticais alinhados aos flancos até alcançar a base dos quatro membros.Remova cuidadosamente a pele do tecido subjacente, começando pela cauda em direção à cabeça do animal. Com tesoura, excise a pele dorsal e transfira a amostra obtida para uma placa de Petri estéril. Com um bisturi, excise uma amostra apropriada da pele-alvo.Em seguida, congele imediatamente em nitrogênio líquido. Para pulverizar o tecido da pele, coloque a amostra congelada no centro de um pulverizador de tecidos com duas câmaras previamente resfriado, equipado com alças e um pilão, e use um martelo de chumbo sobre o almofariz. Transfira imediatamente o tecido pulverizado para novos tubos contendo os reagentes apropriados para qualquer análise subsequente.Inicie o procedimento de coloração aquecendo as lâminas com cortes de pele embebidos em parafina e fixados em formalina, preparados conforme detalhado no protocolo textual, a 65 graus celsius por 15 minutos. Mergulhe as lâminas duas vezes em xilol por cinco minutos. Em seguida, rehidrate as lâminas por meio de um gradiente de etanol.Por fim, lave as lâminas em água da torneira durante três minutos antes da coloração. Para a coloração imuno-histoquímica, primeiro desenhe um círculo ao redor do tecido com uma caneta à prova d'água e, em seguida, incube a seção com a solução bloqueadora para excluir a coloração de fundo não específica. Após o bloqueio, lave a lâmina em PBS.A seguir, pipete o anticorpo primário diluído sobre a seção e incube por 60 minutos à temperatura ambiente. Lave as lâminas três vezes em TBST durante cinco minutos. Em seguida, sobreponha uma gota do polímero marcado sobre a seção e incube a lâmina à temperatura ambiente por 40 minutos.Em seguida, lave a lâmina três vezes em TBST durante cinco minutos, trocando a solução entre cada lavagem. Então, adicione 100 microlitros de solução de DAB sobre as seções de tecido e deixe reagir à temperatura ambiente até que um produto marrom seja observado ao microscópio.Em seguida, lave as lâminas em água para interromper a atividade da peroxidase. Contracolora a seção em solução de Verde de Metila, que se liga especificamente ao DNA por cinco segundos. Lave as lâminas três vezes em PBS, durante cinco minutos cada.Cubra a seção corada com oito microlitros de meio de montagem permanente e coloque uma lamínula. Por fim, visualize as lâminas conforme descrito no protocolo textual. Na imagem estão um camundongo controle e um camundongo que foi acufetado por uma hora, dois dias, cinco dias ou sete dias antes da fotografia ser tirada.Como mostrado aqui, o procedimento de acufecção não causou dano cutâneo aparente. Além disso, a acufecção não influenciou nem a espessura da pele nem o número de células positivas para Ki67. Confirmando ainda que o procedimento não causa disruptura tecidual ou proliferação de células epidérmicas.A expressão de CXCL-1 e IL-6 foi medida utilizando qRT-PCR. Confirma a ativação mínima de queratinócitos observada sob acufecção. Por outro lado, qRT-PCR e ELISA demonstraram a expressão acentuada de IL-15 na pele de camundongos acufetados com o gene IL-15.No fim das contas, a entrega mediada por acufecção do gene IL-15deltaE7 ao tecido da pele impede o desenvolvimento de pele escamosa e a infiltração de neutrófilos em camundongos tratados com imiquimode. Uma vez dominado, este procedimento pode ser realizado em 12 minutos, se executado corretamente. Ao tentar realizar este procedimento, é importante lembrar-se de preparar um novo conjunto de agulhas para cada acufecção e um lote de DNA plasmidial de alta qualidade.Após este procedimento, outros métodos, como infecção por vírus, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a função de um gene novo na modulação da resposta imune antiviral. Após seu desenvolvimento, isso abrirá caminho para pesquisadores na área de imunologia explorarem a resposta imune na pele. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como induzir a expressão de DNA plasmidial na pele de camundongos de maneira economicamente viável.

development-an-economical-dna-delivery-system-acufection-its

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O vídeo demonstra um método para transferir diretamente o DNA do plasmídeo que codifica a interleucina-15 para o tecido da pele de um modelo de camundongo deficiente em interleucina-15 por meio de acupuntura usando microagulhas. Essas microagulhas geram micropunções na camada mais externa da pele, facilitando a absorção e transfecção do DNA do plasmídeo para as células epidérmicas, incluindo os queratinócitos, dentro do tecido cutâneo.

Entrega mediada por acufecção de genes relacionados ao sistema imunológico em tecidos de pele de camundongo

Tatuagem pele é um modo poderoso e seguro para a entrega de vacinas de ADN por via intradérmica. Aqui, um DNA que codifica EGFP plasmídeo é entregue por tatuagem na pele de um rato de laboratório, e a expressão de GFP em células da pele é então inspeccionado por microscopia confocal.

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