Preparação e observação de amostras biológicas Grosso por Scanning Transmission Electron Tomografia
12 de março de 2017
Este relatório descreve um protocolo de preparação de amostras e condições específicas de imagem para a realização de tomografia eletrônica de transmissão de varredura de espécimes biológicos espessos.
O objetivo geral deste procedimento é obter uma reconstrução tridimensional com recuperação de profundidade de campo de um espécime biológico espesso usando tomografia eletrônica de transmissão de varredura de feixe convergente. Este método pode responder a questões-chave no campo da biologia estrutural sobre tomografia eletrônica de espécimes biológicos espessos. A principal vantagem dessa técnica é que as imagens podem ser adquiridas no modo de bits convergentes e o processamento dos dados pode ser realizado na maioria dos softwares dedicados à tomografia.
Para começar a preparar a amostra de cultura de células, centrifugue a amostra a 5000 x g por cinco minutos. Use esses parâmetros de centrifugação durante a preparação da amostra. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em um mililitro de PBS enriquecido com 4% de paraformaldeído e 2% de gluteraldeído.
Incubar a suspensão durante 30 minutos à temperatura ambiente. Centrifugue a mistura, descarte o sobrenadante e lave o pellet três vezes com porções de um mililitro de PBS. Utilizando as mesmas condições de incubação e procedimento de lavagem, incubar o pellet num mililitro de PBS, enriquecido com tetróxido de ósmio a 1%, e num mililitro de PBS enriquecido com acetato de uranilo a 2%.
Em seguida, resfrie a amostra a quatro graus Celsius. Desidratar o pellet por incubações sucessivas em soluções de etanol cada vez mais concentradas. Manter a temperatura da amostra de quatro graus Celsius durante a incubação, centrifugação e lavagem.
Ressuspenda o pellet desidratado em um mililitro de etanol puro e incube durante a noite a 4 graus Celsius. Em seguida, deixe a amostra aquecer até a temperatura ambiente e centrifugue a amostra. Incube o pellet em soluções de resina epóxi cada vez mais concentradas à temperatura ambiente.
Após a lavagem final, ressuspenda o pellet em um mililitro de resina epóxi pura e incube durante a noite em temperatura ambiente. Centrifugue a amostra e remova o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda o pellet em 200 microlitros de resina epóxi e endurecedor. Transfira a suspensão para a cápsula.
Incube a cápsula de plástico a 60 graus Celsius por 48 horas para polimerizar a resina. Remova a cápsula da incubadora e verifique a polimerização da resina. Adicione uma camada de resina epóxi e endurecedor sobre a amostra incorporada e incube a cápsula novamente nas mesmas condições.
Monte a amostra embebida em resina de cabeça para baixo em um suporte de amostra. Fixe com segurança a amostra no bloco de corte de um ultramicrótomo. Corte a cápsula de plástico da amostra na resina.
Molde a resina exposta em uma pirâmide. Em seguida, transfira a cápsula e o suporte da amostra para o braço móvel do ultramicrótomo. Instale uma faca de corte e guiado por um microscópio, refine a forma da pirâmide.
Substitua a faca de corte por uma faca de histologia. Sob o microscópio, ajuste o ângulo de inclinação da cápsula para que a pirâmide fique perpendicular ao fio da faca. Defina a velocidade de corte e corte a amostra.
Depois de seccionar a amostra, transferir a secção escolhida para uma grelha de cobre tratada sobre papel de filtro. Deixe a amostra secar e, em seguida, carregue-a no microscópio eletrônico. Para projetar a série de inclinação focal, primeiro calcule a profundidade de campo do feixe de elétrons e a espessura aparente máxima da amostra.
Com base nesses valores, selecione um intervalo de foco e determine o número de etapas focais necessárias para obter imagens de toda a amostra na espessura aparente máxima. Em seguida, em baixa ampliação, localize a região de interesse dentro da amostra. Ajuste a altura eucêntrica para que o ROI não pareça se mover quando a amostra for girada.
Verifique se o ROI permanece visível em toda a faixa de inclinação. Preencha os parâmetros da série de inclinação focal para coleta automatizada de imagens e adquira as imagens. Importe a série de imagens para um programa de processamento de imagens e alinhe as imagens coletadas no mesmo ângulo de inclinação em uma hierarquia piramidal.
Encontre o alinhamento em cada ângulo de inclinação empilhando as imagens alinhadas. Navegue pela pilha para garantir que apenas a região focada se mova de uma imagem para outra e realinhe as imagens conforme necessário. Depois que o alinhamento for verificado em toda a amostra, mescle as informações em foco nas configurações altas para produzir a série com uma única imagem por ângulo de inclinação.
Execute o alinhamento de localização da série de inclinação com base em marcadores mínimos ou fiduciais locais. Execute uma reconstrução 3D e inspecione a imagem resultante. Se a reconstrução parecer borrada ou deformada, realinhe a série de imagens original.
Uma amostra de T. brucei foi fotografada e analisada usando este método. Em um ângulo de inclinação de zero grau, vários detalhes da bolsa flagelar são visíveis.
No ângulo de inclinação mais alto de 70 graus, apenas uma parte de cada imagem coletada na série focal direta está em foco. Essa posição muda ao longo da série. Ao mesclar as seções em foco, uma única imagem com uma zona de foco maior é produzida.
Este efeito é ainda mais pronunciado quando as áreas de alta frequência da série de inclinação focal são destacadas. As informações de alta frequência abrangem a maior parte da imagem combinada, indicando que a série de inclinação focal foi bem processada. Uma vez dominada, a parte de processamento de imagem pode ser feita em cerca de três a quatro horas, dependendo dos parâmetros de alinhamento e reconstrução escolhidos.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a qualidade da reconstrução final depende muito da qualidade dos testes de alinhamentos anteriores. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a coleta e o processamento de imagem de uma série de inclinação focal.
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Visão Geral
Este relato descreve um protocolo de preparação de amostra e condições específicas de imageamento para realizar tomografia por microscopia eletrônica de transmissão com varredura de espécimes biológicos espessos. O método tem como objetivo obter uma reconstrução tridimensional com recuperação da profundidade de campo, abordando questões fundamentais na biologia estrutural.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Estrutural
- Tomografia Eletrônica
- Técnicas de Preparação de Amostras
Antecedentes
- A tomografia por transmissão eletrônica com feixe convergente é utilizada para a obtenção de imagens de espécimes biológicos espessos.
- Esta técnica permite a recuperação da profundidade de campo em reconstruções tridimensionais.
- Ela fornece informações sobre a organização estrutural de amostras biológicas.
- O processamento de dados pode ser realizado utilizando software padrão de tomografia.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo confiável de preparação de amostras para tomografia eletrônica.
- Aprimorar técnicas de imageamento para espécimes biológicos espessos.
- Facilitar reconstruções tridimensionais que possam contribuir para pesquisas em biologia estrutural.
Métodos Utilizados
- Centrifugação de amostras de cultura celular a 5000 x g durante cinco minutos.
- Ressuspendimento das células em PBS com 4% de paraformaldeído e 2% de glutaraldeído.
- Aplicação de condições específicas de imagem para tomografia eletrônica.
- Utilização do modo de feixe convergente para aquisição de imagens.
Resultados Principais
- Preparação bem-sucedida de amostras para tomografia por microscopia eletrônica de transmissão com varredura.
- Demonstração da recuperação da profundidade de campo em reconstruções tridimensionais.
- Aquisição de imagens de alta qualidade adequadas para análise estrutural.
- Validação do método para responder questões fundamentais em biologia estrutural.
Conclusões
- O protocolo desenvolvido é eficaz para o preparo de espécimes biológicos espessos.
- A tomografia por microscopia eletrônica de transmissão com feixe convergente aprimora as capacidades de imageamento.
- Este método pode contribuir significativamente para a pesquisa em biologia estrutural.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a obtenção de imagens tridimensionais de alta resolução de espécimes biológicos espessos, apoiando pesquisas em biologia estrutural para a caracterização de alvos terapêuticos e estudos sobre mecanismos de ação. Ao recuperar a profundidade de campo por meio de séries de inclinação focal, melhora a qualidade dos dados para amostras complexas que desafiam a microscopia eletrônica convencional. A abordagem aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao fornecer um contexto ultraestrutural detalhado para observações fenotípicas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da arquitetura subcelular em estados semelhantes aos naturais, esclarecendo a localização do alvo e o contexto da via.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional do alvo ao correlacionar fenótipos estruturais com perturbações genéticas ou farmacológicas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho de microscopia correlativa de luz e elétrica, enriquecendo os resultados dos ensaios.
- Valor Operacional: Padroniza a preparação de amostras para triagem ultraestrutural reprodutível de alterações morfológicas induzidas por compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Fornece detalhes ultraestruturais relevantes para a doença, alinhando-se com achados histopatológicos e estudos de biomarcadores.
- Valor Operacional: Permite a redução de riscos mecanicistas ao visualizar os efeitos do engajamento do alvo na arquitetura celular em modelos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a avaliação pré-clínica, oferecendo insights estruturais que orientam a otimização do fármaco líder e a avaliação de segurança.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a visualização da distribuição do alvo e da remodelação de organelas em resposta a moduladores.
- Triagem: Fornece resultados morfológicos quantitativos para análise de alto conteúdo de bibliotecas de compostos em sistemas relevantes para doenças.
- Análises: Gera dados volumétricos tridimensionais que permitem análise morfométrica e comparação estatística entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro à patologia em nível tecidual por meio de fenótipos ultraestruturais conservados.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma padronizada para caracterização estrutural iterativa em múltiplos projetos e classes de alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos ao fornecer visualização direta das consequências estruturais da modulação.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de fixação, contraste e inclusão compatíveis com fluxos de trabalho de instalações centrais.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de avançar/não avançar ao identificar precocemente efeitos estruturais adversos na fase inicial do processo de descoberta.
- Impacto no Portfólio: Apoia o avanço com ajuste de risco ao fornecer evidências ultraestruturais de especificidade do alvo e margens de segurança.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência na preparação de amostras para microscopia eletrônica e na coleta de dados de tomografia.
- Depende do acesso a microscópios eletrônicos de transmissão com porta-amostras para tomografia e estágios estáveis.
- Necessita padronização entre equipes distintas, como grupos de biologia e de imagem, para manipulação consistente das amostras.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes tipos celulares, densidades teciduais e compatibilidade com resinas.
- Limitado pelas restrições de espessura das amostras e pela possível sensibilidade à radiação durante a aquisição prolongada de séries de inclinação.
