A Visual Guide to Classificando gravações eletrofisiológicas Usando 'SpikeSorter'

O objetivo geral deste vídeo é mostrar aos eletrofisiologistas como usar o programa, SpikeSorter, para detectar e classificar picos em gravações extracelulares de tecido neural feito com matrizes de microeletrodos. Nosso objetivo era fornecer uma solução simples para essa tarefa de classificação de picos usando um programa com uma interface amigável. O SpikeSorter pode ler arquivos em vários formatos e oferece uma variedade de estratégias de pré-processamento e detecção de eventos, além de opções de classificação e exportação de dados.

As implicações dessa técnica se estendem para a análise de comportamentos neurais, estudados por registros extracelulares com arranjos de multieletrodos. Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades devido à complexidade da tarefa e à falta de metodologia padrão e validação objetiva. Tivemos a ideia para esse método, quando nos deparamos com o problema de classificar nossas próprias gravações, feitas com matrizes de eletrodos múltiplos de 54 canais e não encontramos nenhuma solução disponível.

Para iniciar este procedimento, abra o programa. Vá para arquivo e abra e, em seguida, selecione o formato do arquivo de gravação na lista suspensa, no canto inferior direito da caixa de diálogo de arquivo aberto resultante. Em seguida, selecione o arquivo e clique em abrir.

Clique em OK quando a leitura terminar. Os sinais de gravação agora são mostrados na exibição da forma de onda de tensão. Se a gravação não estiver filtrada e contiver o potencial do campo local, remova-o clicando no ícone de filtro na barra de ferramentas.

Selecione o filtro butterworth passa-alta, uma frequência de corte adequada e o número de pólos e pressione Do It.Pressione OK, depois concluído e inspecione a forma de onda filtrada no visor. Os sinais de tensão podem ser inspecionados mantendo pressionado o botão esquerdo do mouse e arrastando. Use a roda de rolagem para aumentar o zoom em recursos específicos e diminuir novamente.

Passe o mouse sobre pontos de forma de onda específicos para exibir os valores de tensão correspondentes no canto superior esquerdo. Clicar duas vezes na janela abre uma caixa de diálogo que também pode ser usada para examinar rapidamente qualquer parte da gravação e examinar eventos específicos em canais ou clusters, uma vez que a detecção e classificação de eventos tenham sido concluídas. Em seguida, verifique se há canais que podem estar com defeito e precisam ser mascarados.

Clique no ícone de verificação de canal e inspecione o gráfico. Para mascarar um canal periférico, selecione o número do canal ou selecione-o na lista de problemas. Quando terminar, feche a caixa de diálogo e clique em sim no prompt para salvar os valores da máscara.

Os canais mascarados ficam esmaecidos no visor de tensão. Neste procedimento, vá para pré-processar a detecção de eventos para abrir a caixa de diálogo de detecção de eventos. Use o controle deslizante no canto superior direito para inspecionar o nível de ruído nos canais específicos.

A inspeção cuidadosa do voltage exibição também pode revelar canais silenciosos ou incomumente ruidosos que precisam ser mascarados. Escolha o limite de variável para detecção de eventos. A faixa recomendada de limites é de 4,0 a 6,0 vezes o ruído.

Selecione 4.5. Escolha o método de detecção de filtro multifásico dinâmico na lista suspensa. Defina a janela para ter aproximadamente metade da largura de uma forma de onda de pico típica, com os valores no intervalo, 0,15 a 0,5 milissegundos.

Depois disso, selecione o método de alinhamento escolhendo a opção que melhor identifica uma única feição localizada temporalmente dos picos que estão sendo classificados. Deixe outras opções com seus valores padrão e pressione Iniciar. Pressione Concluído para sair da caixa de diálogo.

A janela de forma de onda de tensão mostra os eventos detectados em cinza em seu canal central atribuído. Os parâmetros de detecção de eventos podem ser ajustados com base nos resultados vistos neste momento. Por exemplo, a detecção de eventos pode ser executada novamente com um limite de detecção mais baixo, a fim de detectar mais eventos.

A próxima etapa normalmente não é executada antes da classificação de rotina, mas é útil fazê-lo ao classificar pela primeira vez ou ao encontrar dados desconhecidos. Vá para classificar, converter canais em clusters, para criar um único cluster para cada canal de eletrodo desmascarado, supondo que cada canal tenha alguns eventos atribuídos a ele. Examine esses clusters revisando, exibindo, limpando e dividindo clusters para abrir outra caixa de diálogo.

Use o controle de rotação para selecionar o cluster a ser exibido. Selecione um cluster que tenha dois ou mais subclusters distintos e pressione o botão realinhar para alterar a hora de cada evento, de modo a melhor combiná-lo com a forma do modelo. Em seguida, pressione Autosplit para agrupar os eventos com base na distribuição dos componentes principais.

Em seguida, clique nas caixas de seleção para examinar as formas de onda nos subclusters. Use o controle deslizante para examinar as formas de onda correspondentes. Como exercício, use um dos pequenos botões divididos para criar um novo cluster e examine-o.

Observe como o cluster vermelho agora revela dois subclusters com mais clareza, depois que o verde é dividido. A classificação pode continuar manualmente dessa maneira, mas é preferível usar o procedimento Autosort mais rápido. Pressione Concluído e vá para Classificar, Classificação automática.

Deixe a opção ignorar detecção de eventos marcada se a detecção de eventos já tiver sido feita, como aqui. Se não estiver marcada, a detecção de eventos será executada automaticamente, usando valores de parâmetros e opções herdadas da caixa de diálogo de detecção de eventos. No painel de agrupamento abaixo, selecione uma janela temporal grande o suficiente para conter toda a forma de onda de pico, precedendo e seguindo o ponto de alinhamento.

Em seguida, selecione uma opção de realinhamento a ser usada durante o clustering e escolha um tamanho mínimo de cluster. Decida o número de dimensões no espaço do PC que serão usadas para clustering e deixe outras opções em suas configurações padrão. Depois disso, pressione Iniciar para iniciar a classificação automática.

Após a conclusão da classificação automática, pressione avançar para ir para o estágio de mesclagem e divisão guiado manualmente e pressione iniciar. Na nova caixa de diálogo, os pares de clusters que não são claramente semelhantes ou distintos serão apresentados em sequência. Para cada par apresentado, use os botões para escolher se deseja mesclar o par, mesclá-lo e dividi-lo novamente, para marcar o par como distinto ou ambíguo, se não estiver claro qual é a melhor decisão.

Clique nas caixas de seleção para exibir um gráfico da altura do pico do pico ou do primeiro ou segundo componente principal em relação ao tempo ou histogramas de correlação automática e cruzada. Isso pode ajudar nas decisões. Aqui, vemos um exemplo de uma decisão de fusão.

Seguido por uma decisão de fusão e divisão. Se a opção de mesclar e dividir não conseguir encontrar clusters claramente separáveis, use o controle deslizante na caixa de diálogo solicitada para variar manualmente um parâmetro de clustering e encontrar uma divisão que pareça satisfatória. Se isso não puder ser feito, use o botão reverter para voltar ao estado original dos dois clusters.

Quando terminar, pressione dividir conforme mostrado. Agora vá para revisão, pós-processamento. Use o botão de limpeza de alinhamento para remover eventos dos clusters que correspondem incorretamente ao modelo de cluster.

Em seguida, use o botão reagrupar para reatribuir eventos não clusterizados a modelos específicos com base no valor da correspondência. Os eventos recuperados são marcados como um subcluster de cada cluster pai e podem ser inspecionados, usando a caixa de diálogo exibir, limpar e dividir clusters. Esses eventos permanecerão no cluster e serão exportados como tal, a menos que sejam excluídos.

Em seguida, retorne à caixa de diálogo de pós-processamento. Use o botão excluir e o controle de rotação próximo a ele para excluir os clusters com uma relação sinal-ruído menor que o limite selecionado. Em seguida, use o botão de classificação para renumerar os clusters de acordo com um critério escolhido.

Esta figura mostra a exibição, obtida ao visualizar, formas de onda classificadas para a gravação que acabou de ser classificada. A experiência comum é que as formas de onda para um par de clusters no mesmo canal parecem idênticas, mas a caixa de diálogo de comparação de pares, no entanto, mostra clusters distintos na projeção do PC. As decisões de mesclagem após os estágios anteriores de classificação às vezes são sugeridas por gráficos de tempo de amplitude e correlogramas cruzados.

Isso ilustra uma decisão de fusão baseada na presença de uma forte correlação cruzada assimétrica em intervalos de tempo curtos, juntamente com uma relação clara entre os primeiros valores de componentes principais das duas unidades, mostrados aqui no eixo vertical. Esta figura mostra um caso em que faltam evidências semelhantes para a fusão. O correlograma cruzado não é fortemente assimétrico e os autocorrelogramas são diferentes.

Embora as formas de onda sejam semelhantes, as duas unidades não devem ser mescladas, devido à diferença nas distribuições dos componentes principais. Esta figura mostra um caso em que as formas de onda são semelhantes e os primeiros valores de componentes principais de duas unidades se misturam quando uma delas para de disparar e a outra começa. Nesse caso, a decisão de fusão parece direta.

Esperamos que esta breve introdução ao SpikeSorter tenha sido útil. Planejamos continuar a desenvolver o programa e adicionar novos recursos onde eles possam ser úteis. Para esse fim, agradecemos relatórios de bugs, feedback construtivo e sugestões de melhoria.