Visualização de interação proteína-proteína em Citoplasmáticas frações nucleares e por co-imunoprecipitação e In Situ Proximidade Ligadura Assay

O objetivo geral deste experimento é comparar as vantagens e desvantagens da co-imunoprecipitação, ou co-ip, e do ensaio de ligação de proximidade, ou pla, na visualização de interações proteína-proteína em diferentes compartimentos celulares. A comparação aqui apresentada de dois métodos diferentes pode ajudar os cientistas a decidir qual é o mais adequado para seu propósito específico ao investigar os padrões de distribuição das interações proteína-proteína no núcleo e no citoplasma de uma célula. A principal vantagem do co-ip é detectar interações autênticas entre proteínas e proteínas.

Por outro lado, o benefício do pla é analisar as interações proteína-proteína do instituto de maneira rápida no nível de uma única célula. Depois de cultivar e colher células hex293 de acordo com o protocolo de texto, para 3 vezes 10 às 6ª células, adicione 300 microlitros de solução de extração citoplasmática fria e vórtice as células na velocidade mais alta por 15 segundos. Incube o extrato no gelo por 30 minutos e, a cada 10 minutos durante a incubação, vortex a amostra por cinco segundos.

Em seguida, adicione 16,5 microlitros de solução de extração citoplasmática fria, vórtice por cinco segundos e incube a amostra no gelo por cinco minutos. Vortex o extracto durante cinco segundos e centrifugar a amostra a 16 000 x g e a 4 graus Celsius durante cinco minutos. Transfira o sobrenadante para um novo tubo pré-resfriado e mantenha-o no gelo até o uso, em seguida, use um mililitro de PBS frio para lavar os pellets insolúveis três vezes, pipetando para cima e para baixo e removendo o PBS após cada lavagem.

Em seguida, adicione 150 microlitros de solução de extração nuclear fria, vórtice por 15 segundos e incube no gelo por uma hora. A cada 10 minutos durante a incubação, vortex a amostra por 15 segundos e use uma ponta de 200 microlitros para pipetar a solução 10 vezes. Vortex o tubo durante 15 segundos e centrifugue a amostra a 16 000 x g a 4 graus Celsius durante 10 minutos, depois transfira o sobrenadante que contém o extracto nuclear para um novo tubo pré-arrefecido e mantenha-o congelado até à utilização.

Remova 10% de cada volume de extratos nucleares e citoplasmáticos como entradas e, em seguida, adicione PBS frio aos extratos restantes para um volume final de um mililitro. Mantenha no gelo até o uso. Depois de pré-limpar os grânulos magnéticos conjugados com proteína g, se necessário, combine 40 microlitros de grânulos magnéticos conjugados com proteína g com quatro microgramas de anticorpo anti-RBM3 policlonal rápido ou IGG rápido como controle negativo em 200 microlitros de PBST.

Incube até a temperatura ambiente em um rotador por 40 minutos. Coloque os tubos em um rack magnético e, em seguida, remova e descarte o sobrenadante. Em seguida, com 200 microlitros de PBST, lave as contas uma vez.

Adicione um mililitro de lisatos diluídos às contas e incube em um rotador a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, coloque os tubos no suporte magnético e aspire o sobrenadante. Adicione 0,5 mililitros de PBST às contas e lave-as três vezes em um rotador a quatro graus Celsius, com uma velocidade fixa de 20 rpm por 10 minutos.

Eluir a proteína dos grânulos adicionando 40 microlitros de tampão de amostra e, em seguida, aquecer a amostra a 70 graus Celsius por 10 minutos. Depois de girar as contas, transfira o líquido para um novo tubo de 1,5 mililitro. Para realizar a química imunocítica, semeie células HEK293 a 1,5 vezes 10 para as quatro células por câmara em uma lâmina revestida de polidelisina de oito câmaras.

Em 0,4 mililitros de DMEM suplementado com 10% FPS e 100 unidades por mililitro de penstrep. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 48 horas, depois aspire o meio e use 4% de PFA para fixar as células em temperatura ambiente por 10 minutos em uma capela de fluxo laminar. Em seguida, aspire o PFA e use 0,5 mililitros de PBS por câmara para lavar as células três vezes.

Adicione 0,5% tritonX100 com 5% NGS e PBS para permeablizar e bloquear as células e incubar em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, depois de diluir os anticorpos primários monoclonais anti-NF90 e anti-RBM3 policlonais de um a 100, adicione anticorpos primários aos poços e incube no agitador a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, use 0,5 mililitros de PBS para lavar as câmaras três vezes por 10 minutos cada.

Para realizar a química imunocítica, adicione uma diluição de um a 500 de anticorpos anti-camundongo acoplados a corante fluorescente verde e anti-coelho acoplados a corante fluorescente vermelho às células e incube em temperatura ambiente por uma hora. Adicionar uma diluição de um a 5 000 DAPHE NBPS para contracorar os núcleos e incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos, depois lavar as amostras com PBS como antes. Remova as câmaras da lâmina de vidro e seque-as, antes de usar 250 microlitros de meio de montagem por lâmina para montá-los.

Para preparar as sondas de ensaio de ligadura de proximidade do tubo, após incubar células e anticorpos primários e lavar conforme demonstrado, dilua as sondas pré-fabricadas de um a 5 em 0,1% tritonx100 e 5% NGS e PBS, em um volume total de 320 micorlitros para uma lâmina de oito câmaras. Incubar a solução à temperatura ambiente durante 20 minutos. Remova as câmaras do lado do vidro e adicione as sondas diluídas, depois incube as câmaras em uma incubadora de umidade a 37 graus Celsius por uma hora.

Prepare uma solução de ligadura misturando oito microlitros de ligase, 64 microlitros de estoque de ligadura 5x e 248 microlitros de água. Retire o líquido da lâmina e use o tampão de lavagem onex A para lavar as amostras duas vezes por cinco minutos cada. Adicione a solução de ligadura às amostras e incube-as em uma incubadora de umidade a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Prepare a solução de amplificação misturando quatro microlitros de polimerase, 64 microlitros de estoque de amplificação 5x e 252 microlitros de água e enrole o tubo em papel alumínio para protegê-lo da luz. Em seguida, retire o líquido da lâmina e use um tampão de lavagem A para lavar as amostras duas vezes por dois minutos cada. Adicione a solução de amplificação às amostras e incube a 37 graus Celsius em uma incubadora úmida escura por 100 minutos.

Em seguida, depois de retirar o líquido como antes, lave as amostras duas vezes por 10 minutos cada no tampão de lavagem B antes de lavá-las uma vez em 0,1 x tampão de lavagem B. Finalmente, seque a lâmina e monte as amostras com 250 microlitros de meio de montagem comercial com DAPHE, examine a fluorescência ao microscópio e adquira imagens com a câmera CCD. Experimentos de co-imunoprecipitação com RBM3 como proteína isca revelaram que as interações NF90-RBM3 estão predominantemente presentes no núcleo e uma minoria é encontrada no citoplasma. Neste experimento de imunofluorescência, NF90 e RBM3 são vistos no núcleo.

Ambas as proteínas também são encontradas no citoplasma em C2, e ambas as proteínas mostram colocalização perfeita em cada compartimento. Como visto nessas imagens, o ensaio de ligação de proximidade revelou o padrão de interações NF90-RBM3, que é muito semelhante à quimídia imunocítica convencional, que mais interações no núcleo na maioria das células. Apenas uma pequena proporção de células demonstrou distribuição predominantemente citoplasmática das interações NF90-RBM3.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que, embora mais conveniente, o PLA não reflete diretamente as interações proteína-proteína. Em vez disso, co-ip detecta interação direcionada. Além disso, a especificidade do anticorpo primário determina a qualidade do resultado.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como escolher um método apropriado para estudar as interações proteína-proteína em diferentes compartimentos celulares de acordo com seu próprio propósito experimental.