Name: Visualização de interação proteína-proteína em Citoplasmáticas frações nucleares e por co-imunoprecipitação e In Situ Proximidade Ligadura Assay (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprenda a comparar co-imunoprecipitação e ensaio de ligação por proximidade para visualizar interações proteína-proteína em compartimentos nucleares e citoplasmáticos usando células HEK293.

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Este estudo foi apoiado pela Swiss National Science Foundation (SNSF, 31003A_163305).

1. Co-imunoprecipitação <ol><li> Semente HEK293 células a 2 x 10 5 células por cavidade em uma placa de 6 cavidades em 2 ml de modificação Médio suplemento (DMEM) de Eagle da Dulbecco com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 100 U / ml de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep) . </li><li> Crescer as células durante 48 h a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Lavar as células com soro fisiológico tamponado com fosfato frio (PBS) três vezes. Células colheita por centrifugação a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> A preparação das fracções nuclear e citoplasmática usando reagentes de extracção nuclear e citoplasmática comerciais. Siga as instruções do fabricante, com algumas modificações. <ol><li> Use 3 X 10 6 células para uma experiência de co-imunoprecipitação (aproximadamente com 90% de confluência de 3 poços de uma placa de 6 poços). Adicionar 300 ul solução fria citoplasmática de extração (CER I) e vortex por 15 segundos na velocidade mais alta. </li><li> Incubar durante 30 min em gelo. Durante a incubação, vorteX 5 s por cada 10 min. </li><li> Adicionar 16,5 ul extracção a frio citoplasmática solução II (CER II), vortex durante 5 segundos e incubar por 5 min em gelo. </li><li> Vortex durante 5 segundos e centrifugar a 16000 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Transferir o sobrenadante (extracto citoplásmico) para um novo tubo de pré-gelada, e manter em gelo até ser utilizada. </li><li> Lavar peletes insolúveis (núcleos) que contêm três vezes com PBS frio 1 ml de cada vez por pipetagem para cima e para baixo cinco vezes. Remover PBS após lavagem. </li><li> Adicionar 150 mL solução de extracção a frio nuclear (NER), vortex durante 15 seg e incubar 1 hora em gelo. Durante a incubação, vortex durante 15 seg e pipeta de 10 vezes com uma ponta de 200 ul a cada 10 min. </li><li> Vortex durante 15 segundos e centrifugar a 16000 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Transferir o sobrenadante (extracto nuclear) para um novo tubo de pré-gelada, manter em gelo até à sua utilização. </li></ol></li><li> Retire 10% do volume de extractos nucleares e citoplasmáticos como entradas cada. </li><li> UMAdd PBS frio para os restantes extractos para um volume final de 1 ml. Manter em gelo até à sua utilização. NOTA: Pré-compensação não é essencial quando se utiliza a proteína G conjugada esferas magnéticas. No entanto, se o fundo é alta, realizar pré-limpeza por incubação de 40 ul de esferas de proteína G-conjugados magnéticos (pasta a 50%) e 1 ml de lisado diluído a partir deste passo, a 4 ° C durante 30 min num agitador rotativo. sobrenadante separado (lisado pré-limpo) de grânulos com cremalheira magnética. Descarte as contas. </li><li> Para o anticorpo primário par com esferas magnéticas Proteína G-conjugados, incubar 40 ul de proteína esferas magnéticas L-conjugados (pasta a 50%) com o anticorpo 4 ug policlonal de coelho anti-RBM3 ou IgG de coelho (controlo negativo) em 200 ul de PBS mais Tween 20 (PBST, 0,02% de Tween 20) à temperatura ambiente (TA) durante 40 min num agitador rotativo. </li><li> grânulos e sobrenadante separado anticorpo acoplado com uma cremalheira magnética, e desprezar o sobrenadante. Lavam-se as esferas uma vez com 200 uL de PBST (0,02%). </li><li> Adicione 1ml diluída lisados ​​(ou, se necessário, os lisados ​​pré-limpo) para os grânulos, e incubar num agitador rotativo a 4 ° C durante a noite. </li><li> No dia seguinte, separar as esferas e o sobrenadante por uma cremalheira magnética, e desprezar o sobrenadante. Lavar 3 x 10 min, com 0,5 ml de PBST (0,02%) para cada tubo a 4 ° C num agitador rotativo com uma velocidade fixa de 20 rpm. </li><li> Eluir proteínas a partir dos grânulos através da adição de tampão de amostra de 40 ul (tampão de amostra comercial 1x e 1,4 mM de ditiotreitol-50 (DTT)). Aquece-se a 70 ° C durante 10 min. Spin down e líquidos de transferência para um novo tubo de 1,5 ml. </li><li> Dilui-se lisados ​​de entrada em tampão de amostra (concentração final: tampão de amostra comercial 1x e DTT 50 mM) e aquece-se a 70 ° C durante 10 min. entradas de carga e as proteínas imunoprecipitadas a partir do último passo de um gel pré-moldado de 4-12% Bis-Tris. O volume de carga de cada cavidade não deve exceder 20 ul. Efectuar a electroforese em tampão de corrida 1x comercial em gelo durante 35 min. NOTA: Carga nuclear e extrato citoplasmáticos numa proporção de 1: 2 (V / V), o que reflecte a mesma quantidade inicial de células. </li><li> Transferência de proteínas para uma membrana de PVDF em tampão de transferência comercial 1x a 30 V durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Bloco de membrana com 5% de leite desnatado em PBST (0,1% de Tween 20) à temperatura ambiente durante 40 minutos num agitador. </li><li> Incubar membrana com anticorpos primários (ambos diluídos em 1: 1000) em PBST (0,1%) a 4 ° C durante a noite. </li><li> Lavar 3 x 10 min com PBST (0,1%) à temperatura ambiente num agitador. </li><li> Incubar membrana com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpos secundários anti-murganho ou anti-coelho (ambos diluídos em 1: 5000) em PBST (0,1%) à temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Lavar 3 x 10 min com PBST (0,1%) à temperatura ambiente num agitador. </li><li> Use 0,2 ml quimioluminescência aumentada (ECL) de uma mistura de substrato por membrana cm 2, incubar à TA durante 5 min. Evite toda a luz a partir desta etapa em diante, exceto luzes vermelhas. </li><li> Descartar líquido e expor a um filme de raios-X em uma cassete de película. Desenvolver filme usando uma pr filme automáticamáquina ocessing. </li></ol> 2. Imunocitoquï¿½ica e proximidade Ligadura Assay <ol><li> Semente células HEK293 em 1.5 x 10 4 culas por câmara em uma câmara de 8-poli-D-lisina lâmina revestida em 0,4 ml de DMEM suplementado com FBS a 10% e 100 U / ml de Pen-Strep. </li><li> Crescer as células durante 48 h a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Aspirar o meio, e fixar as células com paraformaldeído a 4% (PFA) durante 10 min à TA. </li><li> Aspirar PFA, e lavagem de 3 x 10 min com 0,5 ml de PBS por câmara. </li><li> Permeabilizar as células e de bloco com 0,5% de Triton X-100 e 5% de soro de cabra normal (NGS) em PBS à temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Incubar com anticorpos primários em 0,1% de Triton X-100 e 5% em PBS, NGS num agitador a 4 ° C durante a noite. Diluir monoclonal de ratinho anti-NF90 e anticorpo policlonal de coelho anti-anticorpo RBM3 1: 100 em PBS durante dupla coloração. Para controlo negativo, omitir independentemente, qualquer um dos dois anticorpos primários, e omitir ambos os anticorpos em um terceiro controlo. NOTA: Não utilize o bloqueio comercial e reagentes de diluição. </li><li> Lavar 3 x 10 min, com 0,5 ml de PBS por câmara. </li><li> Sujeito a imunocitoquímica ou de proximidade protocolos de ensaio ligadura <ol><li> imunocitoquímica <ol><li> Incubar com 1: 500 diluído fluorescente acoplado-corante verde anti-ratinho e de anticorpos acoplados à corantes fluorescentes vermelhas anti-coelho secundário à TA durante 1 h. Evite luz a partir desta etapa em diante. </li><li> contracoloração núcleos com 4 &#39;, 6-diamidin-2-fenilindol (DAPI) diluído 1: 5000 em PBS à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Lavar 3 x 10 min, com 0,5 ml de PBS por câmara. </li><li> Retirar as câmaras da lâmina de vidro e seco. Monte com 250 μ, médio por lâmina de montagem. </li></ol></li><li> ensaio de ligação de proximidade <ol><li> Prepare proximidade sondas de ensaio de ligação. Misture e diluir sondas de ensaio ligadura dois proximidade (anticorpos secundários anti-ratinho e anti-coelho ligados com diferentes oligonucleotídeos que pode ligar tháspera a adição de dois outros oligonucleótidos em solução de ligação) ambos 1: 5 em 0,1% de Triton X-100 e 5% de NGS em PBS, com um volume total de 320 ul de uma lâmina de 8 câmaras (aproximadamente 40 ul por cm 2) . Incubar à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Retirar as câmaras da lâmina de vidro e adicionar as sondas diluído. Incubar numa incubadora de humidade a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Preparar a solução de ligação. Misture 8 ul ligase, 64 ul da ligadura 5 x e 248 mL de H 2 O. </li><li> Toque o líquido a partir do slide, e lava-se 2 x 5 minutos em 1x tampão de lavagem A (fornecido com o kit). </li><li> Adicionar a solução de ligação, e incubar numa incubadora de humidade a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Preparar a solução de amplificação. Misture 4 ul polimerase, da ampliação de 5x 64 ul e 252 ul H 2 O. Evite luz a partir desta etapa em diante. </li><li> Toque off líquido a partir do slide, e lave 2 x 2 min em 1x tampão de lavagem A. </li><li> Adicione o amplification solução e incubar numa incubadora de humidade escuro a 37 ° C durante 100 min. </li><li> Toque o líquido a partir do slide, e lava-se 2 x 10 minutos em 1x tampão de lavagem B (fornecido com o kit). Lavar durante 1 min em 0.01x Wash Buffer B. </li><li> Seque o slide e montagem com 250 mL de um meio de montagem comercial (com DAPI) por slide. </li></ol></li></ol></li><li> Examine sinais fluorescentes sob um microscópio utilizando uma lente ocular 10X e 20X lente objetiva. Aquisição de imagens por uma câmera CCD. </li></ol>

<ol><li>Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF90+isoforms%2C+a+new+family+of+cellular+proteins+involved+in+viral+replication%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication?</a> Biochimie. 108, 20-24 (2015).</li>
<li>Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+export+of+NF90+is+required+for+interleukin-2+mRNA+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization.</a> Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).</li>
<li>Sakamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NF90-NF45+complex+functions+as+a+negative+regulator+in+the+microRNA+processing+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway.</a> Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).</li>
<li>Dresios, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+stress-induced+protein+Rbm3+binds+60S+ribosomal+subunits%2C+alters+microRNA+levels%2C+and+enhances+global+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).</li>
<li>Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+expression+of+mouse+Rbm3%2C+a+cold-shock+protein%2C+in+Sertoli+cells+of+cryptorchid+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis.</a> Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).</li>
<li>Wellmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-regulated+expression+of+the+RNA-binding+proteins+RBM3+and+CIRP+by+a+HIF-1-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).</li>
<li>Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-inducible+RBM3+inhibits+PERK+phosphorylation+through+cooperation+with+NF90+to+protect+cells+from+endoplasmic+reticulum+stress%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress.</a> FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).</li>
<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-immunoprecipitation+of+the+Mouse+Mx1+Protein+with+the+Influenza+A+Virus+Nucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).</li>
<li>Jarvius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+phosphorylated+platelet-derived+growth+factor+receptor+beta+using+a+generalized+proximity+ligation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method.</a> Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein-protein+interactions+in+cross-talk+pathways+reveals+CRKL+protein+as+a+novel+prognostic+marker+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Há vários benefícios, bem como deficiências para ambos os métodos. Como uma técnica relativamente nova, uma vantagem óbvia de ensaio de proximidade de ligação é a viabilidade para elucidar as interacções proteína-proteína ao nível de uma única célula em vez de um lote de células heterogéneas. Imagens com alta magnitude e resolução (por exemplo, através de microscópio confocal) prever a possibilidade de quantificação contando manchas fluorescentes individuais. Em contraste, a combinação convencional de técnica d...

Fator nuclear 90 (NF90) é uma proteína multi-isoforma com inúmeras funções, incluindo a resposta à infecção viral, a regulação de interleucina-2 pós-transcrição e regulação do miRNA biogênese 1-3. RBM3 é uma proteína de ligação a ARN, envolvidos na tradução e miARN biogénese e pode ser induzida por vários factores de stress incluindo a hipoxia e hipotermia 4-6. Recentemente, encontramos NF90 e RBM3 em um complexo de proteínas 7. A interacção de NF90 e RBM3 é essencial para modular a actividade de proteína quinase-ARN como retículo endoplasmático quinase (PERK) em resposta proteína desdobrada 7. Ambos NF90 e RBM3 estão localizados predominantemente no núcleo, mas uma pequena proporção de NF90 e de transporte RBM3 para o citoplasma e se ligam uns aos outros para lá para funções específicas, por exemplo, para regular a actividade de vantagem. Portanto, é importante para visualizar a distribuição de interacções NF90-RBM3 no compartimento subcelular, que pode indicarseus vários papéis no respectivo compartimento. Décadas atrás, dois híbridos de levedura (Y2H) foi desenvolvido para detectar a interacção entre duas proteínas 8. No entanto, devido à construção artificial de proteínas fundidas, falsos resultados positivos têm restringido a aplicação deste método. Durante muito tempo, a co-imunoprecipitação foi a principal técnica para analisar interacções proteína-proteína, especialmente em condições endógenas 9. Para analisar o complexo de proteína de co-imunoprecipitada, Western blot é a técnica mais conveniente, enquanto a espectrometria de massa é usada quando super-sensibilidade e precisão são desejados. Nos últimos anos, ensaio de proximidade de ligação foi desenvolvida como um método novo para a detecção de interacções proteína-proteína em ambas as células e tecidos in situ 10,11. Aqui, nós comparamos o método de co-imunoprecipitação mais popular e método de ensaio de proximidade de ligação relativamente nova na captura NF9interacção 0-RBM3 em fracções subcelulares. Também discutimos as vantagens e limitações de ambas as técnicas.

<table><tbody><tr><td>Águia modificada de Dulbecco' s Medium (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>Glicose alta 4.500 mg/L</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (PenStrep)</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>NE-PER Reagentes de Extração Nuclear e Citoplasmática</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78833</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Ditiotreitol (DTT)</td><td>Carl Roth</td><td>6908.3</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>DRBP76 (NF90 / NF110) anticorpo</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>612154</td><td>uso 1: 1.000 para WB e 1: 100 para anticorpo ICC / PLA</td></tr><tr><td>RBM3</td><td>ProteinTech</td><td>14363-1-AP</td><td>uso 1: 1.000 para WB e 1: 100 para ICC / PLA</td></tr><tr><td>Lamin A / C anticorpo</td><td>Tecnologia</td> <td>de sinalização celular#2032</td><td>use 1:1.000 para WB&nbsp;</td></tr><tr><td>anticorpo anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab8245</td><td>use 1:1.000 para WB&nbsp;</td></tr><tr><td>IgG de coelho normal</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2027</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-coelho, anticorpo secundário ligado a HRP</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td> <td>#7074</td><td>use 1:5,000 para WB&nbsp;</td></tr><tr><td>anticorpo secundário HRP anti-camundongo</td><td>Carl Roth</td><td>4759.1</td><td>use 1:5,000 para WB&nbsp;</td></tr><tr><td>Substrato de Blotting Western ECL</td><td>Clarity Bio-Rad</td><td>#1705060</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20x)</td><td>Novex, Thermo Fisher Scientific</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hypond P 0.2 membrana PVDF</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lisina 8 Lâmina de Cultura de Poços</td><td>Corning BioCoat</td><td>354632</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal (NGS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-rato de cabra (anticorpo H+L), conjugado Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-coelho de cabra (anticorpo H+L), conjugado Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;, 6-Diamidin-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Sonda Duolink PLA Anti-rato PLUS</td><td>Sigma</td><td>DUO92001</td><td></td></tr><tr><td>Duolink PLA&nbsp; sonda Anti-coelho MENOS</td><td>Sigma</td><td>DUO92005</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes de Detecção Duolink Red</td><td>Sigma</td><td>DUO92008</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Wash Buffers Fluorescência</td><td>Sigma</td><td>DUO82049</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Meio de Montagem com DAPI</td><td>Sigma</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td>AX-70</td><td></td></tr><tr><td>Câmera CCD</td><td>SPOT</td><td>Insight 2MP Firewire</td><td></td></tr><tr><td>Filme de raio-X</td><td>Fujifilm</td><td>Super RX</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de processamento de filme</td><td>Fujifilm</td><td>FPM-100A</td><td></td></tr></tbody></table>

visualização de interação proteína-proteína em citoplasmáticas frações nucleares e por co-imunoprecipitação e<em&gt; in situ</em&gt; proximidade ligadura assay

Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay

As interações proteína-proteína estão envolvidas em milhares de processos celulares e ocorrem em contextos espaciais distintos. Tradicionalmente, a co-imunoprecipitação é uma técnica popular para detectar interações proteína-proteína. A análise subsequente de Western blot é o método mais comum para visualizar proteínas co-imunoprecipitadas. Recentemente, o ensaio de ligação de proximidade tornou-se uma ferramenta poderosa para visualizar as interações proteína-proteína in situ e oferece a possibilidade de quantificar as interações proteína-proteína por esse método. Semelhante à imunocitoquímica convencional, a técnica de ensaio de ligação de proximidade também se baseia na acessibilidade de anticorpos primários aos antígenos, mas, em contraste, o ensaio de ligação de proximidade detecta interações proteína-proteína com uma técnica única envolvendo PCR de círculo rolante, enquanto a imunocitoquímica convencional mostra apenas co-localização de proteínas.
O fator nuclear 90 (NF90) e a proteína 3 do motivo de ligação ao RNA (RBM3) foram previamente demonstrados como parceiros de interação. Eles estão predominantemente localizados no núcleo, mas também migram para o citoplasma e regulam as vias de sinalização no compartimento citoplasmático. Aqui, comparamos a interação NF90-RBM3 tanto no núcleo quanto no citoplasma por co-imunoprecipitação e ensaio de ligação de proximidade. Além disso, discutimos as vantagens e limitações dessas duas técnicas na visualização das interações proteína-proteína em relação à distribuição espacial e às propriedades das interações proteína-proteína.

A Figura 1 demonstra que NF90 e RBM3 são ambos proteínas nucleares e apenas uma pequena fracção está presente no citoplasma. Notavelmente, existem três diferentes bandas coradas positivas para RBM3. O menor logo abaixo de 20 kDa reflecte o tamanho correcto de RBM3 (o peso molecular previsto de 17 kDa é RBM3). A origem das duas outras bandas continua a ser investigado. experiências de co-imunoprecipitação com RBM3 como a proteína isca revelou que as interações NF90-RBM3 s...

As interações proteína-proteína podem ocorrer tanto no núcleo quanto no citoplasma de uma célula. Para investigar essas interações, a co-imunoprecipitação tradicional e o ensaio moderno de ligação de proximidade são aplicados. Neste estudo, comparamos esses dois métodos para visualizar a distribuição das interações NF90-RBM3 no núcleo e no citoplasma.

Visualização de interação proteína-proteína em Citoplasmáticas frações nucleares e por co-imunoprecipitação e<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidade Ligadura Assay

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation ...

O objetivo geral deste experimento é comparar as vantagens e desvantagens da co-imunoprecipitação, ou co-ip, e do ensaio de ligação por aproximação, ou pla, na visualização de interações entre proteínas em diferentes compartimentos celulares. A comparação aqui apresentada entre dois métodos diferentes pode ajudar os cientistas a decidir qual deles é mais adequado para seu propósito específico ao investigar os padrões de distribuição das interações entre proteínas no núcleo e no citoplasma de uma célula. A principal vantagem da co-ip é a detecção de interações autênticas entre proteínas.Por outro lado, a vantagem do PLA é analisar interações proteína-proteína em nível de célula única de forma rápida. Após cultivar e colher as células HEK293 de acordo com o protocolo descrito, adicione 300 microlitros de solução de extração citoplasmática fria a 3 vezes 10 à 6ª células e vortexe as células na velocidade máxima por 15 segundos. Incube o extrato em gelo por 30 minutos e, a cada 10 minutos durante a incubação, vortexe a amostra por cinco segundos.Em seguida, adicione 16,5 microlitros de solução extratora citoplasmática fria, vortexie por cinco segundos e incube a amostra em gelo por cinco minutos. Vortexie o extrato por cinco segundos e centrifugue a amostra a 16.000 × g e 4 graus Celsius por cinco minutos. Transfira o sobrenadante para um novo tubo pré-resfriado e mantenha-o em gelo até o uso; então, use um mililitro de PBS frio para lavar os pellets insolúveis três vezes, pipetando para cima e para baixo e removendo o PBS após cada lavagem.Em seguida, adicione 150 microlitros de solução de extração nuclear fria, vortexie por 15 segundos e incube no gelo durante uma hora. A cada 10 minutos durante a incubação, vortexie a amostra por 15 segundos e use uma ponteira de 200 microlitros para pipetar a solução 10 vezes. Vortexie o tubo por 15 segundos e centrifugue a amostra a 16.000 × g a 4 graus Celsius por 10 minutos, depois transfira o sobrenadante contendo o extrato nuclear para um novo tubo pré-resfriado e mantenha-o no gelo até o uso.Retire 10% de cada volume dos extratos nucleares e citoplasmáticos como amostras iniciais, então adicione PBS frio aos extratos restantes até um volume final de um mililitro. Mantenha em gelo até o uso. Após a pré-limpeza, se necessário, das microesferas magnéticas conjugadas com proteína G, combine 40 microlitros de microesferas magnéticas conjugadas com proteína G com quatro microgramas do anticorpo policlonal anti-RBM3 rápido ou com IGG rápida como controle negativo em 200 microlitros de PBST.Incube até a temperatura ambiente em um rotador durante 40 minutos. Coloque os tubos em um suporte magnético, remova e descarte o sobrenadante. Em seguida, lave as esferas uma vez com 200 microlitros de PBST.Adicione um mililitro de lisados diluídos às esferas e incube em agitador rotativo a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, coloque os tubos na grade magnética e aspire o sobrenadante. Adicione 0,5 mililitros de PBST às esferas e lave-as três vezes em agitador rotativo a quatro graus Celsius, com velocidade fixa de 20 rpm por 10 minutos.Elua a proteína das perolas adicionando 40 microlitros de tampão amostra, em seguida aqueça a amostra a 70 graus Celsius por 10 minutos. Após centrifugar as perolas, transfira o líquido para um novo tubo de 1,5 mililitro. Para realizar imunocitoquímica, semeie células HEK293 a 1,5 vezes 10 à quarta células por câmara em uma lâmina com oito câmaras revestida com polilisina.Em 0,4 mililitros de DMEM suplementado com 10% FPS e 100 unidades por mililitro de penstrep. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 48 horas, depois aspire o meio e use PFA a 4% para fixar as células à temperatura ambiente por 10 minutos em uma cabine de fluxo laminar. Em seguida, aspire o PFA e use 0,5 mililitros de PBS por câmara para lavar as células três vezes.Adicione 0,5% de Triton X-100 com 5% de NGS e PBS para permeabilizar e bloquear as células e incube em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, após diluir os anticorpos primários monoclonal anti-NF90 e policlonal anti-RBM3 na proporção de 1:100, adicione os anticorpos primários aos poços e incube na agitadora a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, use 0,5 mililitros de PBS para lavar as câmaras três vezes, durante 10 minutos cada.Para realizar a imunocitoquímica, adicione uma diluição de 1:500 do anticorpo antirato conjugado ao corante fluorescente verde e do anticorpo anticoelho conjugado ao corante fluorescente vermelho às células e incube à temperatura ambiente por uma hora. Adicione uma diluição de 1:5.000 de DAPHE NBPS para contra-coloração dos núcleos e incube à temperatura ambiente por 10 minutos, depois lave as amostras com PBS como antes. Remova as câmaras da lâmina de vidro e seque-as, antes de usar 250 microlitros de meio de montagem por lâmina para montá-las.Para preparar as sondas do ensaio de ligação por proximidade em tubo, após incubação das células e dos anticorpos primários e lavagem conforme demonstrado anteriormente, dilua as sondas prontas na proporção de um para cinco em Triton X-100 0,1% e NGS 5% em PBS, num volume total de 320 microlitros para uma lâmina de oito câmaras. Incube a solução à temperatura ambiente por 20 minutos. Remova as câmaras do lado de vidro e adicione as sondas diluídas, em seguida incube as câmaras em incubadora úmida a 37 graus Celsius por uma hora.Prepare uma solução de ligação misturando oito microlitros de ligase, 64 microlitros de tampão estoque de ligação 5x e 248 microlitros de água. Remova o líquido da lâmina e use o tampão de lavagem A onex para lavar as amostras duas vezes, por cinco minutos cada. Adicione a solução de ligação às amostras e incube-as em um incubador úmido a 37 graus Celsius por 30 minutos.Prepare a solução de amplificação misturando quatro microlitros de polimerase, 64 microlitros de estoque de amplificação 5x e 252 microlitros de água, e envolva o tubo com papel alumínio para protegê-lo da luz. Em seguida, remova o líquido da lâmina, e use tampão de lavagem A 1x para lavar as amostras duas vezes, durante dois minutos cada. Adicione a solução de amplificação às amostras e incube a 37 graus Celsius em um incubador escuro e úmido por 100 minutos.Em seguida, após remover o líquido como antes, lave as amostras duas vezes por 10 minutos cada em tampão de lavagem B, antes de lavá-las uma vez em tampão de lavagem B 0,1 x. Por fim, seque a lâmina e monte as amostras com 250 microlitros de meio de montagem comercial com DAPHE, examine a fluorescência em microscópio e adquira imagens com câmera CCD. Experimentos de co-imunoprecipitação com RBM3 como proteína isca revelaram que as interações NF90-RBM3 estão predominantemente presentes no núcleo, e uma minoria é encontrada no citoplasma. Neste experimento de imunofluorescência, NF90 e RBM3 são ambos observados no núcleo.As duas proteínas também são encontradas no citoplasma em C2, e ambas as proteínas mostram colocalização perfeita em cada compartimento. Como visto nessas imagens, o ensaio de ligação por proximidade revelou o padrão de interações entre NF90-RBM3, que é muito semelhante ao da imunocitoquímica convencional, com a maioria das interações no núcleo na maior parte das células. Apenas uma pequena proporção de células demonstrou distribuição predominantemente citoplasmática das interações NF90-RBM3.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que, embora mais conveniente, a PLA não reflete diretamente interações entre proteínas. Em vez disso, a co-ip detecta interação direcionada. Além disso, a especificidade do anticorpo primário determina a qualidade do resultado.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como escolher um método apropriado para estudar interações entre proteínas em diferentes compartimentos celulares, de acordo com seu próprio objetivo experimental.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este protocolo descreve como imagem de interações proteína-proteína através de um ensaio de proximidade FRET-based.

Imagem interações proteína-proteína In vivo</em

Este vídeo descreve o ensaio de ligação de proximidade para estudar as interações proteína-proteína in situ em células de nematóides. A proximidade das proteínas de interesse gera o molde circular de DNA com a ajuda de uma sonda PLA ligada a um anticorpo secundário. A sonda é ainda amplificada usando a solução de amplificação, que produz um DNA longo de fita simples seguido pela hibridização da sonda detectora, permitindo a localização de interações proteína-proteína nas células.

Ensaio de ligação de proximidade para estudar interações proteína-proteína in situ

Nós estabelecemos um método para a purificação de proteínas de interacção co-regulação que utilizam o sistema de LC-MS / MS.

Uma proteína Método de Preparação para a Identificação de alto rendimento de proteínas que interagem com um co-fator nuclear utilizando LC-MS / MS Análise

Aqui, é demonstrado como o Ensaio de Ligação à Proximidade in situ (PLA) pode ser usado para detectar e visualizar as interações proteínas-proteínas diretas entre ATM e p53 em culturas de células suspensas expostas ao estresse genotóxico.

Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

Aqui, nós apresentamos um protocolo para uma técnica da digestão da em-membrana para a preparação das amostras para a espectrometria maciça. Esta técnica facilita a análise conveniente das interações proteína-proteína.

Avaliação de interações proteína-proteína usando uma técnica de digestão na membrana

A imunoprecipitação quantitativa Multiplex (QMI) utiliza citometria de fluxo para detecção sensível de diferenças na abundância de interações proteína-proteína direcionadas entre duas amostras. O QMI pode ser realizado usando uma pequena quantidade de biomaterial, não requer Tags geneticamente projetadas e pode ser adaptado para qualquer rede de interação protéica previamente definida.

Quantificação da dinâmica da rede de interação de proteínas usando co-imunoprecipitação multiplexada

As proteínas do domínio J de cognato cooperam com a Chaperona HSP70 para auxiliar em uma infinidade de processos biológicos que vão desde a dobradura de proteínas até a degradação. Aqui, nós descrevemos um ensaio in situ da ligadura da proximidade, que permita a monitoração destas machineries transientemente formadas do acompanhante em bactérias, em fermento e em pilhas humanas.

Monitoração in situ de montagens moleculars formadas Transientemente do chaperone nas bactérias, no fermento, e nas pilhas humanas

Descrito é um fluxo de trabalho proteômico para identificar parceiros de interação proteica de uma fração subcelular nuclear usando enriquecimento de imunoafinidade de uma determinada proteína de interesse e espectrometria de massa sem rótulo. O fluxo de trabalho inclui fracionação subcelular, imunoprecipitação, preparação de amostras auxiliadas por filtro, limpeza off-line, espectrometria de massa e um pipeline de bioinformática a jusante.

Fluxo de trabalho de espectrometria de massa de imunoprecipitação sem rótulos para perfis de interactom nuclear em larga escala

Este protocolo demonstra o uso do ensaio de ligadura de proximidade para sondar interações proteína-proteína in situ na germinação C. elegans.

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline usando Ensaio de Ligação de Proximidade

A necessidade de novas abordagens para o estudo dos sítios de contato com membranas (SCM) tem crescido devido ao crescente interesse no estudo dessas estruturas celulares e seus componentes. Aqui, apresentamos um protocolo que integra tecnologias de microscopia previamente disponíveis para identificar e quantificar complexos proteicos intra-organelas e interorganelas que residem em SCGs.

Visualização e quantificação de interações endógenas intra-organelas em sítios de contato ER-mitocôndrias por ensaios de ligadura de proximidade

As interações proteína-proteína são importantes para elucidar a função das proteínas-alvo, e a co-imunoprecipitação (co-IP) pode facilmente confirmar os IBPs. Transfectamos transitoriamente um plasmídeo que codifica uma proteína marcada com epítopo em células HEK-293 e desenvolvemos um método de imunoprecipitação para confirmar facilmente a ligação de duas proteínas-alvo.

Imunoprecipitação com um gel de afinidade anti-epítopo para estudar interações proteína-proteína

Aprenda a comparar co-imunoprecipitação e ensaio de ligação por proximidade para visualizar interações proteína-proteína em compartimentos nucleares e citoplasmáticos usando células HEK293.

Visualização de interação proteína-proteína em Citoplasmáticas frações nucleares e por co-imunoprecipitação e In Situ Proximidade Ligadura Assay (Vídeo) | JoVE Journal

Visualização de interação proteína-proteína em Citoplasmáticas frações nucleares e por co-imunoprecipitação e

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