Name: Perfil de expressão gênica de célula única usando FACS e qPCR com controles internos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Aprenda a quantificar mRNA em células individuais usando qPCR microfluídico com padrões internos. Este método permite medir até 96 genes simultaneamente em células únicas de mamíferos, oferecendo uma alternativa custo-efetiva ao RNA-Seq.

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Nós gostaríamos de agradecer a V. Kapoor na CCR ETIB Citometria de Fluxo do núcleo para sua ajuda na realização da separação de células durante o desenvolvimento deste protocolo. Agradecemos também a M. Raffeld ea Unidade de CCR LP Diagnóstico Molecular e J. Zhu eo NHLBI DNA Sequencing and Genomics núcleo por sua ajuda na realização do qPCR durante o desenvolvimento deste protocolo. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa Intramural do NIH.

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Nós apresentamos um método para o isolamento de células de mamíferos individuais a partir de uma população de células aderentes cultivadas em cultura e para ensaiar a expressão de genes de aproximadamente 96 em cada célula. Bom preparação prévia é crítico para este método funcione bem. Em particular, concepção e teste de iniciadores específicos para os pares de transcritos de interesse (passos 1,2-1,3) são demorados passos importantes, mas, como os iniciadores de determinar a qualidade das medições de uma única célula. ...

As células individuais em uma população pode mostrar respostas muito diferentes a um estímulo uniforme fisiológico 1, 2, 3, 4. A variação genética de células numa população é um mecanismo para essa variedade de respostas, mas também existem vários factores não genéticos que podem aumentar a variabilidade das respostas, mesmo numa população clonal de células. Por exemplo, os níveis de proteínas individuais e outras moléculas de sinalização importantes pode variar numa base de célula-por-célula, dando origem a variações nos perfis de expressão de gene a jusante. Além disso, a activação do gene pode ocorrer em rajadas de curta duração de transcritos de 5, 6, que pode ser limitada a um número relativamente pequeno de transcritos por explosão 7, 8, 9. Talestocasticidade em activação do gene pode contribuir grandemente para a variabilidade na resposta biológica e pode proporcionar uma vantagem selectiva em microorganismos e 10 em células de mamífero 1, 2 respondendo a um estímulo fisiológico. Devido às duas fontes genéticos e não genéticos de variação, o perfil de qualquer célula em resposta a um estímulo a expressão do gene pode ser muito diferente da média do perfil de expressão do gene obtido a partir da medição da resposta grandes quantidades. Determinação da extensão à qual as células individuais mostram a variabilidade em resposta a um estímulo requer técnicas para o isolamento de células individuais, a medição dos níveis de expressão de transcritos de interesse, e a análise computacional de dados de expressão resultantes. Existem várias abordagens para ensaiar a expressão do gene em células individuais, que cobrem uma vasta gama de custos, número de transcritos sondado, eprecisão da quantificação. Por exemplo, uma única célula de RNA-Seq oferece uma grande profundidade de cobertura de transcrição e a capacidade de quantificar milhares de transcritos distintos para os genes mais altamente expresso em células individuais; No entanto, o custo associado com tal profundidade de sequenciação pode ser proibitivo, embora os custos de continuar a diminuir. Por outro lado, uma única molécula de RNA hibridização fluorescente in situ (FISH smRNA) oferece uma quantificação precisa de transcrições, mesmo para baixo expressar genes a um custo razoável por gene de interesse; No entanto, apenas um pequeno número de genes alvo podem ser ensaiados numa dada célula por esta abordagem. Quantitativas ensaios baseados em PCR, descritos neste protocolo, fornecer um meio termo entre essas técnicas. Estes ensaios empregam um real-time PCR máquina microfluídico para quantificar até 96 transcrições de interesse em um momento em até 96 células. Enquanto cada um dos métodos acima mencionados tem custos de hardware requeridas, o custo de qualquer ensaio qPCR indivíduo é relativamentebaixo. Este protocolo é adaptado de um sugerido pelo fabricante de um real-time PCR máquina microfluídico (Protocolo ADP 41, Fluidigm). Para habilitar a estimativa do número absoluto de cada transcrito em uma abordagem baseada em PCR, nós expandimos o protocolo para fazer uso dos controles internos de amplicons do gene alvo preparados que podem ser usados ​​em vários experimentos. Como um exemplo desta técnica, a quantificação da expressão de genes regulados por o supressor de tumor p53 em células MCF-7 de carcinoma da mama humano está descrito 11. As células são desafiadas com um agente químico que induz quebras de ADN de cadeia dupla. Estudos anteriores demonstraram que a resposta da p53 a ADN quebras de cadeia dupla apresenta uma grande quantidade de heterogeneidade em células individuais, quer em termos de níveis de p53 e 12 na activação de genes alvo distintas 11. Além disso, a p53 regula a expressão de mais de 100bem caracterizado genes alvo envolvidas em numerosas vias a jusante, incluindo a paragem do ciclo celular, a apoptose, senescência e 13, 14. Uma vez que a resposta mediada por p53 em cada célula é complexa e variável, a análise dos benefícios do sistema a partir de uma abordagem em que cerca de 100 genes alvo podem ser sondados simultaneamente em células individuais, tais como os descritos abaixo. Com ligeiras modificações (tais como métodos alternativos para o isolamento de uma única célula e de lise), o protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar uma ampla gama de tipos de células de mamíferos, transcrições e respostas celulares. Com preparação prévia adequada, uma rodada de separação de células e medição expressão do gene pode ser realizada de acordo com este protocolo durante um período de três dias. O seguinte calendário é sugerido: com antecedência, selecione as transcrições de interesse, identificar e validar os pares de primers que amplificam o cDNA daqueles transcrIPTS, e preparar as normas e misturas de iniciadores que utilizam esses iniciadores. No dia 1, após o tratamento de células, e colheita classificar as células, realizar a transcrição reversa e a amplificação do alvo específico, e tratar as amostras com uma exonuclease para remover os iniciadores não incorporados. No dia 2, realizar o controle de qualidade sobre células classificadas usando qPCR. Finalmente, no dia 3, medir a expressão genética nas células classificadas usando microfluídico qPCR. A Figura 1 resume as etapas envolvidas.

<table><tbody><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade com inibidor de RNase</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerase de alta fidelidade</td><td>Kit de extração de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Kit de ensaio de dsDNA de alta sensibilidade</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33120&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de baixa adesão de 2,0 ml</td><td>EUA Scientific</td><td>1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>DNA Suspension Buffer</td><td>Teknova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 0,2 ml Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes Corning</td><td></td><td>PCR-02-LC</td><td></td></tr><tr><td>GE 96,96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Kit de Reagentes de Carregamento de Ensaio</td><td>Fluidigm</td><td>100-3415</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 Soro</td> Bovino <td>Fetal GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>, Certificado (EUA)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Solução Antibiótico-Antimicótica</td><td>Corning</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>Neocarzinostatin</td><td>Sigma</td><td>N9162</td><td></td></tr><tr><td>ELIMINase</td><td>Decon Labs</td><td>1101</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>11753500</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DNA</td><td>Affymetrix</td><td>14380 10 MG</td><td></td></tr><tr><td>ThermalSeal Filme de Vedação, Estéril</td><td>Excel Scientific</td><td>STR-THER-PLT</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria IIu</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone Tripsina 0.05%</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &micro; Filtro de células m</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Exonuclease I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix com baixo ROX</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5210</td><td></td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC para expressão gênica (chip qPCR microfluídico)</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr><tr><td>IFC Controller HX (máquina de carregamento)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioMark ou BioMark HD (máquina de qPCR microfluídica)</td><td>Software</td> de análise de PCR em tempo real Fluidigm<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Software Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

unicelular perfil de expressão de genes utilizando facs e qpcr com as normas internas

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

As medições de expressão gênica de populações em massa de células podem obscurecer a considerável variação transcriptômica de células individuais dentro dessas populações. As medições de expressão gênica de célula única podem ajudar a avaliar o papel do ruído na expressão gênica, identificar correlações na expressão de pares de genes e revelar subpopulações de células que respondem de maneira diferente a um estímulo. Aqui, descrevemos um procedimento para medir a expressão de até 96 genes em células únicas de mamíferos isoladas de uma população crescente em cultura de tecidos. As células são classificadas em tampão de lise por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), e as espécies de mRNA de interesse são transcritas e amplificadas reversamente. A expressão gênica é então medida usando uma máquina de PCR microfluídica em tempo real, que realiza até 96 ensaios de qPCR em até 96 amostras por vez. Também descrevemos a geração e o uso de padrões de amplificação de PCR para permitir a estimativa do número absoluto de cada transcrito. Em comparação com outros métodos de medição da expressão gênica em células individuais, essa abordagem permite a quantificação de transcritos mais distintos do que o RNA FISH a um custo menor do que o RNA-Seq.

Uma visão geral do protocolo é demonstrado na Figura 1, incluindo os passos para o tratamento de células, o isolamento de células isoladas por FACS, a geração e a pré-amplificação de bibliotecas de ADNc a partir de lisados de célula única, a confirmação de bibliotecas de cDNA de uma única célula em poços classificadas, e a medição da expressão gênica por qPCR. Na preparação para o isolamento de uma única célul...

Descrevemos um método para classificar células individuais de mamíferos e quantificar a expressão de até 96 genes-alvo de interesse em cada célula. Este método inclui o uso de padrões internos de qPCR para permitir a estimativa de contagens absolutas de transcritos.

Unicelular perfil de expressão de genes utilizando FACS e qPCR com as Normas Internas

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar os níveis de mRNA em células individuais utilizando qPCR em microfluídica com padrões internos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia de célula única, como, por exemplo, se populações celulares respondem a um estímulo de maneiras caracteristicamente diferentes. A principal vantagem desta técnica é que ela pode medir a expressão de um número maior de genes do que a FISH de RNA, a um custo menor do que o RNA-Seq em células individuais.Tivemos pela primeira vez a ideia para este método ao explorar protocolos para medir a expressão gênica em células individuais por meio de qPCR em microfluídica. Queríamos modificar os métodos existentes para estimar com maior precisão o número absoluto de diferentes transcritos em células isoladas. William Telford, o gerente da instalação de citometria de fluxo utilizada pelo meu laboratório, demonstrará o procedimento de separação celular.Após gerar e purificar amplicons de genes de interesse de acordo com o protocolo descrito no texto, combine 18 microlitros de cada amplicon purificado em um tubo microcentrífugo de baixa ligação de 2,0 mililitros e, em seguida,

single-cell-gene-expression-profiling-using-facs-qpcr-with-internal

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