Name: Perfil de expressão gênica de célula única usando FACS e qPCR com controles internos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Aprenda a quantificar mRNA em células individuais usando qPCR microfluídico com padrões internos. Este método permite medir até 96 genes simultaneamente em células únicas de mamíferos, oferecendo uma alternativa custo-efetiva ao RNA-Seq.

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Nós gostaríamos de agradecer a V. Kapoor na CCR ETIB Citometria de Fluxo do núcleo para sua ajuda na realização da separação de células durante o desenvolvimento deste protocolo. Agradecemos também a M. Raffeld ea Unidade de CCR LP Diagnóstico Molecular e J. Zhu eo NHLBI DNA Sequencing and Genomics núcleo por sua ajuda na realização do qPCR durante o desenvolvimento deste protocolo. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa Intramural do NIH.

<ol><li>Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+and+Robustness+in+T+Cell+Activation+from+Regulated+Heterogeneity+in+Protein+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels.</a> Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).</li>
<li>Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+origins+of+cell-to-cell+variability+in+TRAIL-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis.</a> Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).</li>
<li>Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillations+and+variability+in+the+p53+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Oscillations and variability in the p53 system.</a> Mol. Syst. Biol. 2 (1), (2006).</li>
<li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li>
<li>Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Transcriptional+Bursting+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria.</a> Cell. 158 (2), 314-326 (2014).</li>
<li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+mRNA+Synthesis+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309+(2006).</li>
<li>Senecal, A., Munsky, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+Factors+Modulate+c-Fos+Transcriptional+Bursts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li>
<li>Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+control+of+expression+mean+and+variance+by+epigenetic+features+at+different+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci.</a> Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+(2015).</li>
<li>Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+burst+frequency+and+burst+size+are+equally+modulated+across+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).</li>
<li>Thattai, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+fluctuating+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in fluctuating environments.</a> Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).</li>
<li>Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Pulses+Diversify+Target+Gene+Expression+Dynamics+in+an+mRNA+Half-Life-Dependent+Manner+and+Delineate+Co-regulated+Target+Gene+Subnetworks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks.</a> Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).</li>
<li>Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+p53-Mdm2+feedback+loop+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells.</a> Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).</li>
<li>Levine, A. J., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+30+years+of+p53%3A+growing+ever+more+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The first 30 years of p53: growing ever more complex.</a> Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).</li>
<li>Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+human+p53-regulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of human p53-regulated genes.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).</li>
<li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinf. 13 (1), 134(2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/General_Information/1/pcr-technologies-guide.pdf">PCR Technologies: A Technical Guide</a>. , Sigma-Aldrich. St. Louis, MO. (2014).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).</li>
<li>Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+initiation%3A+a+mechanism+for+triggering+p53+pulses+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage.</a> Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Flow+Cytometry%3A+Principles+and+Applications%22">Flow Cytometry: Principles and Applications</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Real-time+PCR%22">Real-time PCR</a>. , Taylor & Francis. (2006).</li>
<li>Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+co-expression+measures%3A+mutual+information%2C+correlation%2C+and+model+based+indices%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices.</a> BMC Bioinf. 13 (1), 328(2012).</li>
<li>Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARACNE%3A+An+Algorithm+for+the+Reconstruction+of+Gene+Regulatory+Networks+in+a+Mammalian+Cellular+Context%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context.</a> BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).</li>
<li>Haff, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+quantitative+PCR+using+nested+primers%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">Improved quantitative PCR using nested primers.</a> PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).</li>
<li>Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq2%3A+sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biol. 17, 77(2016).</li>
<li>Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Single-cell+Gene+Transcription+by+RNA+Fluorescent++In+Situ+Hybridization+%28FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH).</a> J. Vis. Exp. (68), e4073(2012).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
<li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).</li>
<li>Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+transcriptomics+in+thousands+of+single+human+cells+at+single-molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution.</a> Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Nós apresentamos um método para o isolamento de células de mamíferos individuais a partir de uma população de células aderentes cultivadas em cultura e para ensaiar a expressão de genes de aproximadamente 96 em cada célula. Bom preparação prévia é crítico para este método funcione bem. Em particular, concepção e teste de iniciadores específicos para os pares de transcritos de interesse (passos 1,2-1,3) são demorados passos importantes, mas, como os iniciadores de determinar a qualidade das medições de uma única célula. ...

As células individuais em uma população pode mostrar respostas muito diferentes a um estímulo uniforme fisiológico 1, 2, 3, 4. A variação genética de células numa população é um mecanismo para essa variedade de respostas, mas também existem vários factores não genéticos que podem aumentar a variabilidade das respostas, mesmo numa população clonal de células. Por exemplo, os níveis de proteínas individuais e outras moléculas de sinalização importantes pode variar numa base de célula-por-célula, dando origem a variações nos perfis de expressão de gene a jusante. Além disso, a activação do gene pode ocorrer em rajadas de curta duração de transcritos de 5, 6, que pode ser limitada a um número relativamente pequeno de transcritos por explosão 7, 8, 9. Talestocasticidade em activação do gene pode contribuir grandemente para a variabilidade na resposta biológica e pode proporcionar uma vantagem selectiva em microorganismos e 10 em células de mamífero 1, 2 respondendo a um estímulo fisiológico. Devido às duas fontes genéticos e não genéticos de variação, o perfil de qualquer célula em resposta a um estímulo a expressão do gene pode ser muito diferente da média do perfil de expressão do gene obtido a partir da medição da resposta grandes quantidades. Determinação da extensão à qual as células individuais mostram a variabilidade em resposta a um estímulo requer técnicas para o isolamento de células individuais, a medição dos níveis de expressão de transcritos de interesse, e a análise computacional de dados de expressão resultantes. Existem várias abordagens para ensaiar a expressão do gene em células individuais, que cobrem uma vasta gama de custos, número de transcritos sondado, eprecisão da quantificação. Por exemplo, uma única célula de RNA-Seq oferece uma grande profundidade de cobertura de transcrição e a capacidade de quantificar milhares de transcritos distintos para os genes mais altamente expresso em células individuais; No entanto, o custo associado com tal profundidade de sequenciação pode ser proibitivo, embora os custos de continuar a diminuir. Por outro lado, uma única molécula de RNA hibridização fluorescente in situ (FISH smRNA) oferece uma quantificação precisa de transcrições, mesmo para baixo expressar genes a um custo razoável por gene de interesse; No entanto, apenas um pequeno número de genes alvo podem ser ensaiados numa dada célula por esta abordagem. Quantitativas ensaios baseados em PCR, descritos neste protocolo, fornecer um meio termo entre essas técnicas. Estes ensaios empregam um real-time PCR máquina microfluídico para quantificar até 96 transcrições de interesse em um momento em até 96 células. Enquanto cada um dos métodos acima mencionados tem custos de hardware requeridas, o custo de qualquer ensaio qPCR indivíduo é relativamentebaixo. Este protocolo é adaptado de um sugerido pelo fabricante de um real-time PCR máquina microfluídico (Protocolo ADP 41, Fluidigm). Para habilitar a estimativa do número absoluto de cada transcrito em uma abordagem baseada em PCR, nós expandimos o protocolo para fazer uso dos controles internos de amplicons do gene alvo preparados que podem ser usados ​​em vários experimentos. Como um exemplo desta técnica, a quantificação da expressão de genes regulados por o supressor de tumor p53 em células MCF-7 de carcinoma da mama humano está descrito 11. As células são desafiadas com um agente químico que induz quebras de ADN de cadeia dupla. Estudos anteriores demonstraram que a resposta da p53 a ADN quebras de cadeia dupla apresenta uma grande quantidade de heterogeneidade em células individuais, quer em termos de níveis de p53 e 12 na activação de genes alvo distintas 11. Além disso, a p53 regula a expressão de mais de 100bem caracterizado genes alvo envolvidas em numerosas vias a jusante, incluindo a paragem do ciclo celular, a apoptose, senescência e 13, 14. Uma vez que a resposta mediada por p53 em cada célula é complexa e variável, a análise dos benefícios do sistema a partir de uma abordagem em que cerca de 100 genes alvo podem ser sondados simultaneamente em células individuais, tais como os descritos abaixo. Com ligeiras modificações (tais como métodos alternativos para o isolamento de uma única célula e de lise), o protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar uma ampla gama de tipos de células de mamíferos, transcrições e respostas celulares. Com preparação prévia adequada, uma rodada de separação de células e medição expressão do gene pode ser realizada de acordo com este protocolo durante um período de três dias. O seguinte calendário é sugerido: com antecedência, selecione as transcrições de interesse, identificar e validar os pares de primers que amplificam o cDNA daqueles transcrIPTS, e preparar as normas e misturas de iniciadores que utilizam esses iniciadores. No dia 1, após o tratamento de células, e colheita classificar as células, realizar a transcrição reversa e a amplificação do alvo específico, e tratar as amostras com uma exonuclease para remover os iniciadores não incorporados. No dia 2, realizar o controle de qualidade sobre células classificadas usando qPCR. Finalmente, no dia 3, medir a expressão genética nas células classificadas usando microfluídico qPCR. A Figura 1 resume as etapas envolvidas.

<table><tbody><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade com inibidor de RNase</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerase de alta fidelidade</td><td>Kit de extração de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Kit de ensaio de dsDNA de alta sensibilidade</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33120&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de baixa adesão de 2,0 ml</td><td>EUA Scientific</td><td>1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>DNA Suspension Buffer</td><td>Teknova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 0,2 ml Maxymum Recovery Thin Wall PCR Tubes Corning</td><td></td><td>PCR-02-LC</td><td></td></tr><tr><td>GE 96,96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Kit de Reagentes de Carregamento de Ensaio</td><td>Fluidigm</td><td>100-3415</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 Soro</td> Bovino <td>Fetal GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>, Certificado (EUA)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Solução Antibiótico-Antimicótica</td><td>Corning</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>Neocarzinostatin</td><td>Sigma</td><td>N9162</td><td></td></tr><tr><td>ELIMINase</td><td>Decon Labs</td><td>1101</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>11753500</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DNA</td><td>Affymetrix</td><td>14380 10 MG</td><td></td></tr><tr><td>ThermalSeal Filme de Vedação, Estéril</td><td>Excel Scientific</td><td>STR-THER-PLT</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria IIu</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone Tripsina 0.05%</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &micro; Filtro de células m</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Exonuclease I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix com baixo ROX</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5210</td><td></td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC para expressão gênica (chip qPCR microfluídico)</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr><tr><td>IFC Controller HX (máquina de carregamento)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioMark ou BioMark HD (máquina de qPCR microfluídica)</td><td>Software</td> de análise de PCR em tempo real Fluidigm<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Software Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

unicelular perfil de expressão de genes utilizando facs e qpcr com as normas internas

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

As medições de expressão gênica de populações em massa de células podem obscurecer a considerável variação transcriptômica de células individuais dentro dessas populações. As medições de expressão gênica de célula única podem ajudar a avaliar o papel do ruído na expressão gênica, identificar correlações na expressão de pares de genes e revelar subpopulações de células que respondem de maneira diferente a um estímulo. Aqui, descrevemos um procedimento para medir a expressão de até 96 genes em células únicas de mamíferos isoladas de uma população crescente em cultura de tecidos. As células são classificadas em tampão de lise por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), e as espécies de mRNA de interesse são transcritas e amplificadas reversamente. A expressão gênica é então medida usando uma máquina de PCR microfluídica em tempo real, que realiza até 96 ensaios de qPCR em até 96 amostras por vez. Também descrevemos a geração e o uso de padrões de amplificação de PCR para permitir a estimativa do número absoluto de cada transcrito. Em comparação com outros métodos de medição da expressão gênica em células individuais, essa abordagem permite a quantificação de transcritos mais distintos do que o RNA FISH a um custo menor do que o RNA-Seq.

Uma visão geral do protocolo é demonstrado na Figura 1, incluindo os passos para o tratamento de células, o isolamento de células isoladas por FACS, a geração e a pré-amplificação de bibliotecas de ADNc a partir de lisados de célula única, a confirmação de bibliotecas de cDNA de uma única célula em poços classificadas, e a medição da expressão gênica por qPCR. Na preparação para o isolamento de uma única célul...

Descrevemos um método para classificar células individuais de mamíferos e quantificar a expressão de até 96 genes-alvo de interesse em cada célula. Este método inclui o uso de padrões internos de qPCR para permitir a estimativa de contagens absolutas de transcritos.

Unicelular perfil de expressão de genes utilizando FACS e qPCR com as Normas Internas

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar os níveis de mRNA em células individuais utilizando qPCR em microfluídica com padrões internos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia de célula única, como, por exemplo, se populações celulares respondem a um estímulo de maneiras caracteristicamente diferentes. A principal vantagem desta técnica é que ela pode medir a expressão de um número maior de genes do que a FISH de RNA, a um custo menor do que o RNA-Seq em células individuais.Tivemos pela primeira vez a ideia para este método ao explorar protocolos para medir a expressão gênica em células individuais por meio de qPCR em microfluídica. Queríamos modificar os métodos existentes para estimar com maior precisão o número absoluto de diferentes transcritos em células isoladas. William Telford, o gerente da instalação de citometria de fluxo utilizada pelo meu laboratório, demonstrará o procedimento de separação celular.Após gerar e purificar amplicons de genes de interesse de acordo com o protocolo descrito no texto, combine 18 microlitros de cada amplicon purificado em um tubo microcentrífugo de baixa ligação de 2,0 mililitros e, em seguida, adicione tampão de suspensão de DNA até completar 1.800 microlitros, de modo que a concentração de cada amplicon seja cinco vezes 10 à sexta moléculas por microlitro. Vortexe bem o padrão 5e6 e divida-o em alíquotas de 20 microlitros em tubos PCR de baixa ligação. Após semear as células MCF7 p53-Venus de acordo com o protocolo descrito no texto, adicione 400 nanogramas por mililitro de neocarzinostatina às células e trate-as por três, 8,5, 14 ou 24 horas.Para preparar o tampão de lise, combine os reagentes listados nesta tabela. Transfira 92,4 microlitros do tampão para um tubo separado para servir como tampão de lise para os padrões de amplicon. O tampão de lise restante será utilizado para as células.Prepare e adicione o DNA de E.coli ao tampão de lise para as células, conforme o protocolo descrito no texto. Para preparar os padrões, rotule seis tubos de centrífuga de baixa ligação. Adicione 90 microlitros de tampão de suspensão de DNA ao tubo 5e5.Adicione 90 microlitros de tampão contendo 6,2 picogramas por microlitro de DNA de E.coli a cada um dos outros cinco tubos e mantenha todos os tubos no gelo. Após retirar uma alíquota de 5e6 padrão do congelador, vorte o tubo brevemente, em seguida centrifugue-o para garantir que o líquido esteja no fundo do tubo; depois, utilizando uma ponteira de baixa adesão, adicione 10 microlitros do padrão 5e6 ao tubo 5e5. Vorte, centrifugue e devolva o tubo ao gelo.Em seguida, pipete 10 microlitros do tubo 5e5 para o tubo 5e4, vortexe brevemente o tubo, centrifugue-o e coloque-o novamente no gelo. Repita as diluições em série em cada tubo, adicionando 10 microlitros do tubo anterior, até que todos os tubos contenham uma diluição padrão. Após preparar os tubos de PCR com tampão de lise, utilizando uma pipeta de 12 canais, distribua nove microlitros de tampão de lise celular, a partir da fileira de tubos de PCR, para cada poço das sete primeiras fileiras de uma placa de PCR.Distribua sete microlitros de tampão de lise padrão para cada poço da última linha da placa e, usando ponteiras de baixa adesão, adicione dois microlitros de padrão a cada poço da linha inferior de acordo com o mapa da placa. Adicione dois microlitros de 3,1 picogramas por microlitro de DNA de E.coli nos poços de 10 células e 100 células, depois adicione dois microlitros de 6,2 picogramas por microlitro de DNA de E.coli nos poços sem células. Após programar o classificador de células ativado por fluorescência para separar em uma placa de 96 poços de acordo com o mapa da placa, para alinhar o equipamento, selle uma placa PCR vazia e use o fluxo de teste para separar gotículas e PBS sobre o selo da placa vazia.Se as gotas não caírem na posição correta, remova-as da superfície do selo, recalcule o classificador de células de acordo com as instruções do fabricante do equipamento e repita até que as gotas no fluxo de separação sejam depositadas corretamente. Colete as células por tripsinização e re-suspenda-as em 0,5 mililitros de PBS com 2% de FBS, depois transfira para um tubo de citometria de fluxo. Para separar as células, insira o tubo com a suspensão celular no classificador de células, abra o selo na placa de tampão de lise e separe cuidadosamente as células de interesse na placa de acordo com o mapa da placa.Para garantir que as células individuais sejam classificadas com pureza máxima, execute a máquina no modo de célula única e utilize o protocolo padrão de seleção em citometria de fluxo com base no espalhamento para frente e lateral. Após a execução, use um novo selo térmico estéril para vedar a placa e centrifugue-a a 400 vezes g, a quatro graus Celsius, por um minuto; em seguida, coloque a placa no ciclador térmico e execute o programa RT-STA previamente preparado. Após a centrifugação da placa RT-STA concluída, use uma pipeta de 12 canais para distribuir 3,6 microlitros de exonuclease I diluída em cada poço da placa.Selle e gire brevemente a placa, em seguida coloque a placa no ciclador térmico e execute o programa exo I. Para medir a expressão do gene de referência em cada amostra, prepare 900 microlitros da mistura mestra de corante de ligação ao DNA para qPCR para 96 reações, utilizando primers de um dos genes de referência selecionados. Distribua nove microlitros da mistura mestra para cada poço de uma placa PCR de 96 poços, depois adicione um microlitro da amostra da placa de amostras ao poço correspondente da placa PCR.Execute a placa em uma máquina de PCR em tempo real utilizando um protocolo de ciclagem térmica sugerido pelo fabricante da mistura mestra ou seguindo um protocolo padrão, depois analise as amostras e crie um mapa da placa de misturas de amostras de acordo com o protocolo descrito. Rotule uma placa como misturas de amostras e, utilizando uma pipeta de oito canais, distribua 3,3 microlitros da mistura de reagente de carregamento da mistura mestra em cada poço de uma placa PCR de 96 poços. Para cada placa PCR de amostras, agite a placa em vórtex por 10 segundos e centrifugue-a a 500 × g por 10 segundos.Remova a tampa e transfira 2,7 microlitros de cada amostra positiva de uma célula para o poço correspondente na placa de misturas de amostras, conforme indicado no mapa da placa para os poços de uma célula. Retire o adesivo da parte inferior de um novo chip microfluídico de qPCR e, usando uma seringa com fluido da linha de controle com a tampa ainda colocada, pressione cada mola do acumulador para soltá-la e injete de 100 a 200 microlitros de fluido da linha de controle em cada acumulador. Insira o chip na máquina de carregamento e execute o script de escorva; em seguida, utilizando uma pipeta de oito canais, transfira 4,5 microlitros de cada mistura de ensaio para o lado esquerdo do chip microfluídico de qPCR.É essencial evitar a formação de bolhas de ar na parte inferior das cavidades. Isso causará problemas de carregamento. Para prevenir isso, encoste as ponteiras da pipeta na lateral da cavidade e, em seguida, pipete somente até o primeiro batente.Transfira 4,5 microlitros de cada mistura de amostra para o lado direito do chip de qPCR microfluídico, insira o chip na máquina de carregamento e execute o script de carregamento da mistura. Quando o script de carregamento da mistura for concluído, verifique se não há linhas atravessando o chip, o que indicaria um problema de carregamento; em seguida, use fita para remover cuidadosamente quaisquer partículas de poeira do chip, insira o chip no equipamento de PCR em tempo real microfluídico e execute o script de coleta de dados. Por fim, analise os dados de acordo com o protocolo descrito no texto.Esta figura mostra os níveis de expressão de um gene de referência medidos por qPCR para determinar quais poços receberam uma única célula. As amostras que receberam uma célula apresentam valores baixos de CT. As amostras sem célula apresentam valores de CT muito mais altos.Os poços para o padrão de amplicon devem apresentar curvas de amplificação uniformemente espaçadas. Deve haver também uma clara separação entre as curvas dos poços sem células, com 10 células e com 100 células. As amostras de DNA provenientes de células reais são selecionadas individualmente a partir de múltiplas placas de 96 poços ordenadas e combinadas em uma única placa para o preparo da qPCR em microfluídica.Este mapa de calor resume os resultados da qPCR em microfluídica. A variação de cor em cada coluna mostra a variabilidade na expressão de cada gene entre diferentes células. As duas linhas que são muito mais escuras do que as demais provavelmente representam amostras ruins.Ao realizar este procedimento, é importante manter a área de trabalho livre de RNase e DNA, especialmente ao preparar os padrões e o tampão de lise. As etapas pré-PCR deste protocolo são sensíveis à contaminação. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como quantificar a expressão de múltiplos genes de interesse em células individuais.Após este procedimento, outros métodos, como a hibridização fluorescente de RNA em nível de molécula única, podem ser realizados para validar as medidas da abundância de mRNA em células individuais.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

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