Perfil de expressão gênica de célula única usando FACS e qPCR com controles internos

O objetivo geral deste procedimento é quantificar os níveis de mRNA em células individuais usando qPCR microfluídico com padrões internos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular única, como se as populações celulares de células respondem a um estímulo de maneiras caracteristicamente diferentes. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode medir a expressão de mais genes do que o RNA FISH a um custo menor do que o RNA-Seq em células individuais.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando estávamos explorando protocolos para medir a expressão gênica em células únicas por qPCR microfluídica. Queríamos modificar os métodos existentes para estimar com mais precisão o número absoluto de transcritos diferentes em células únicas. Demonstrando o procedimento de classificação de células estará William Telford, o gerente da instalação de citometria de fluxo usada pelo meu laboratório.

Depois de gerar e purificar amplicons de genes de interesse de acordo com o protocolo de texto, combine 18 microlitros de cada amplicon purificado em um tubo de microcentrífuga de baixa ligação de 2,0 mililitros e, em seguida, adicione tampão de suspensão de DNA de até 1.800 microlitros para que a concentração de cada amplicon seja cinco vezes 10 elevado às sextas moléculas por microlitro. Vortex completamente o padrão 5e6 e divida-o em alíquotas de 20 microlitros em tubos de PCR de baixa ligação. Depois de plaquear as células MCF7 p53-Venus de acordo com o protocolo de texto, adicione 400 nanogramas por mililitro de neocarzinostatina às células e trate-as por três, 8,5, 14 ou 24 horas.

Para fazer o tampão de lise, combine os reagentes listados nesta tabela. Transfira 92,4 microlitros do tampão para um tubo separado para servir como tampão de lise para os padrões de amplicon. O tampão de lise restante será para as células.

Prepare e adicione DNA de E.coli ao tampão de lise para as células, conforme o protocolo de texto. Para preparar padrões, rotule seis tubos de centrífuga de baixa ligação. Adicione 90 microlitros de tampão de suspensão de DNA ao tubo 5e5.

Adicione 90 microlitros de tampão contendo 6,2 picogramas por microlitro de DNA de E.coli a cada um dos outros cinco tubos e mantenha todos os tubos no gelo. Depois de remover uma alíquota do padrão 5e6 do armazenamento, agite brevemente o tubo e, em seguida, gire-o para garantir que o líquido esteja no fundo do tubo e, em seguida, usando uma ponta de pipeta de baixa ligação, adicione 10 microlitros do padrão 5e6 ao tubo 5e5. Vórtice, gire e coloque o tubo de volta no gelo.

Em seguida, pipete 10 microlitros do tubo 5e5 para o tubo 5e4, depois faça um vórtice breve do tubo, gire-o e coloque-o de volta no gelo. Repita as diluições seriadas com cada tubo, recebendo 10 microlitros do tubo anterior até que todos os tubos tenham uma diluição do padrão. Depois de preparar os tubos de PCR com tampão de lise, usando uma pipeta de 12 canais, distribua nove microlitros de tampão de lise celular da fileira de tubos de PCR em cada poço das primeiras sete fileiras de uma placa de PCR.

Distribua sete microlitros de tampão de lise padrão para cada poço da última linha da placa e, em seguida, usando pontas de pipeta de baixa ligação, adicione dois microlitros de padrão a cada poço da linha inferior de acordo com o mapa da placa. Adicione dois microlitros de 3,1 picogramas por microlitro de DNA de E.coli nos poços de 10 e 100 células e, em seguida, adicione dois microlitros de 6,2 picogramas por microlitro de DNA de E.coli nos poços sem células. Depois de programar o classificador de células ativadas por fluorescência para classificar em uma placa de 96 poços de acordo com o mapa da placa, para apontar a máquina, selar uma placa PCR vazia e usar o fluxo de teste para classificar gotículas e PBS no selo da placa vazia.

Se as gotículas não caírem na posição correta, limpe-as da superfície da vedação, recalibre o classificador de células de acordo com as instruções do fabricante da máquina e repita até que as gotículas no fluxo de classificação sejam depositadas corretamente. Colha as células por tripsinização e ressuspenda-as em 0,5 mililitros de PBS com 2% de FBS e, em seguida, transfira para um tubo de citometria de fluxo. Para classificar as células, insira o tubo com a suspensão da célula no classificador de células, abra a vedação na placa do tampão de lise e classifique cuidadosamente as células de interesse na placa de acordo com o mapa da placa.

Para garantir que as células individuais sejam classificadas com pureza máxima, opere a máquina no modo de célula única e use a citometria de fluxo padrão com base na dispersão direta e lateral. Após a execução, use um novo selo térmico estéril para selar a placa e centrifugue-a a 400 vezes g por quatro graus Celsius por um minuto, depois coloque a placa no termociclador e execute o programa RT-STA previamente preparado. Depois de girar a placa RT-STA completa, use uma pipeta de 12 canais para distribuir 3,6 microlitros de exonuclease I diluída em cada poço da placa.

Sele e gire brevemente a placa, depois coloque a placa no termociclador e execute o programa exo. Para medir a expressão gênica de manutenção em cada amostra, prepare 900 microlitros de mistura mestre de qPCR de corante de ligação ao DNA para 96 reações usando primers de um dos genes de manutenção selecionados. Distribua nove microlitros de master mix para cada poço de uma placa de PCR de 96 poços e, em seguida, adicione um microlitro de amostra da placa de amostra ao poço correspondente da placa de PCR.

Execute a placa em uma máquina de PCR em tempo real usando um protocolo de ciclagem térmica sugerido pelo fabricante da mistura mestre ou seguindo um protocolo padrão, depois analise as amostras e faça um mapa de placas de misturas de amostras de acordo com o protocolo de texto. Rotule uma mistura de amostras de placas e, em seguida, usando uma pipeta de oito canais, distribua 3,3 microlitros de mistura de reagentes de carregamento de amostras master mix em cada poço de uma placa de PCR de 96 poços. Para cada placa de PCR de amostras, vortex a placa por 10 segundos e gire-a a 500 vezes g por 10 segundos.

Remova a tampa e transfira 2.7 microlitros de cada amostra positiva de uma célula para o poço correspondente na placa de misturas de amostra para os poços de uma célula indicados no mapa da placa. Retire o adesivo da parte inferior de um novo chip qPCR microfluídico e, em seguida, usando uma seringa de fluido de linha de controle com a tampa ainda colocada, empurre para baixo cada mola do acumulador para soltá-la e injete cada acumulador com 100 a 200 microlitros de fluido da linha de controle. Insira o chip na máquina de carregamento e execute o script principal e, em seguida, usando uma pipeta de oito canais, transfira 4,5 microlitros de cada mistura de ensaio para o lado esquerdo do chip qPCR microfluídico.

É fundamental evitar a criação de bolhas de ar no fundo dos poços. Isso criará problemas de carregamento. Para evitar isso, toque as pontas da pipeta na lateral do poço e, em seguida, pipete apenas até a primeira parada.

Transfira 4,5 microlitros de cada mistura de amostra para o lado direito do chip qPCR microfluídico, insira o chip na máquina de carregamento e execute o script de mistura de carga. Quando o script de mistura de carga estiver concluído, verifique se não há linhas no chip, o que indicaria um problema de carregamento, use fita adesiva para remover cuidadosamente quaisquer partículas de poeira do chip, insira o chip na máquina de PCR microfluídica em tempo real e execute o script de coleta de dados. Por fim, analise os dados de acordo com o protocolo de texto.

Esta figura mostra os níveis de expressão de um gene de manutenção medido por qPCR para determinar quais poços receberam uma única célula. As amostras que receberam uma célula têm baixos valores de CT. Amostras sem célula têm valores de CT muito mais altos.

Os poços para o padrão amplicon devem apresentar curvas de amplificação uniformemente espaçadas. Também deve haver uma separação clara nas curvas para os poços sem célula, 10 células e 100 células. Amostras de DNA de sementes representando células reais são escolhidas a dedo de várias placas de 96 poços e combinadas em uma única placa para se preparar para qPCR microfluídica.

Este mapa de calor resume os resultados microfluídicos de qPCR. A variação de cor em cada coluna mostra a variabilidade na expressão de cada gene entre diferentes células. As duas linhas que são muito mais escuras do que o resto provavelmente representam amostras ruins.

Ao tentar este procedimento, é importante manter sua área de trabalho livre de RNase e DNA livre, especialmente ao fazer os padrões e o tampão de lise. As partes pré-PCR deste protocolo são sensíveis à contaminação. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como quantificar a expressão de vários genes de interesse em células individuais.

Seguindo este procedimento, outros métodos, como RNA FISH de molécula única, podem ser realizados para validar medições de abundância de mRNA em células únicas.