Name: 3D Agregação Stem Magnetic celular e biorreator Maturação para regeneração da cartilagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Aprenda agregação magnética de células-tronco mesenquimais e maturação dinâmica em biorreator para regeneração da cartilagem. Este método melhora a condrogênese in vitro e a produção de matriz extracelular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer QuinXell Technologies e CellD, particularmente Lothar Grannemann e Dominique Ghozlan por sua ajuda com o biorreator. Agradecemos Catherine Le Visage, que forneceu-nos com pululano / andaimes polissacarídeos dextrano. Este trabalho foi apoiado pela União Europeia (projecto ERC-2014-CG Matisse 648.779) e pela AgenceNationalede la Recherche (ANR), França (projeto MagStem ANR-11 SVSE5).

1. Construção dos dispositivos magnéticos NOTA: Os dispositivos usados para a sementeira de células variam dependendo da aplicação (Figura 1). Para formar agregados, o número de células é limitado a 2,5 x 10 5 / agregado, de modo que as pontas magnéticos devem ser muito fina (750 um de diâmetro). Para semear as andaimes 1,8 centímetros 2/7 mm de espessura, os ímans devem ser maiores (3 mm de diâmetro) e vai garantir a migração de células através dos poros do andaime. <ol><li> Construção de um dispositivo com micro-imans para a formao de agregados (Figura 1A) <ol><li> Fazer micro-furos com uma broca de 0,8 mm através de placas de alumínio (3 cm de diâmetro e 6 mm de espessura). </li><li> Inserir uma ponta magnética (750 um de diâmetro) em cada orifício da placa. </li><li> Coloque este disco durante um ímã de neodímio permanente, o que garante a magnetização de saturação. </li></ol></li><li> Construção de um dispositivo para a semeadura andaime ( <strong&gt; Figura 1B) <ol><li> Cortar poliestireno disco em 2,4 cm 2 quadrados. </li><li> Inserir pequenos ímans 9 (3 mm de diâmetro, 6 mm long) a uma distância igual ao longo de uma área de superfície de 1,6 cm2. </li><li> Coloque este dispositivo sobre um ímã de neodímio permanente. </li></ol></li></ol> 2. Stem Rotulagem celular NOTA: As células estaminais foram marcadas com 0,1 mM de nanopartículas magnéticas durante 30 min (de ferro 2,6 ± 0,2 pg / célula) para formar agregados, enquanto que foram marcadas com 0,2 mM nanopartículas magnéticas durante 30 min (5 ± 0,4 pg de ferro / célula) para semear andaimes. Estas concentrações de nanopartículas e tempos de incubação foram usadas anteriormente e publicado por MSC e outras células 18, 19, e determinou-se que as nanopartículas impactado nem a viabilidade celular, nem capacidade de diferenciação MSC. A massa de ferro incorporado pelas células estaminais foi medida através de um único cell magnetoforese 19, 20. <ol><li> Culturas de células humanas estaminais mesenquimais (MSC) em meio de crescimento de células estaminais mesenquimais completo (MSCGM) a 37 ° C e 5% de CO 2 até próximo da confluência (~ 90%). </li><li> Preparar a solução de marcação magnética, misturando mM maghemite óxido de ferro revestido de citrato de 0,1 ou 0,2 (γFe 2 O 3; núcleo: 8 nm de diâmetro) em meio 5A de McCoy isento de soro modificado no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) sem glutamina e contendo cinco citrato de sódio mM. </li><li> Descartar o meio, lavar as células com meio RPMI isento de soro, sem glutamina, e adicionar 10 ml de solução de nanopartículas de óxido de ferro por frasco de cultura de 150 cm 2, o volume mínimo necessário para cobrir todas as células. </li><li> Incubar durante 30 min a 37 ° C e CO2 a 5% e, em seguida, descartar a solução de nanopartículas. Lavar durante 5 minutos com meio RPMI isento de soro, sem glutamina para internalizar o nanoparticles ainda ligada à membrana plasmática. </li><li> Descartar o meio RPMI e adicionar 25 mL de meio completo MSCGM por frasco. Incubar durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol> 3. semeadura de células Magnetic <ol><li> Recentemente preparar a forma condrogénica através de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) alto teor de glucose com L-glutamina por adição de 50 uM de ácido L-ascórbico 2-fosfato, 0,1? M de dexametasona, piruvato de sódio 1 mM, 0,35 mM de L-prolina, 1% de cultura universal suplemento contendo insulina, transferrina humana e ácido selenoso (ITS-Pré-mistura), e 10 ng / mL de factor de crescimento transformante-beta 3 (TGF-β3). </li><li> Separe as células magnéticas utilizando 8 mL de 0,05% de tripsina-EDTA por frasco de cultura de 150 cm 2 e centrifuga-se as células dissociadas a 260 × g durante 5 min. Aspirar o meio e contar as células ressuspensas. </li><li> Coloque uma cultura de células com fundo de vidro de Petri (35 mm) na parte superior de ambos os dispositivos magnéticos. </li><li> para magnetically formar agregados, adicionar 3 ml de meio de condrogénica para a placa de Petri e suavemente depositar o menor volume possível (não mais do que 8 mL) contendo 2,5 x 10 5 culas marcadas por agregado (até 16 agregados pode ser depositado). Deixar a placa de Petri durante 20-30 minutos sem movê-lo, permitindo-lhe formar esferóides, e, em seguida, colocar o dispositivo completo, incluindo a placa de Petri contendo os 16 agregados, na incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> agregados de controlo de forma a seguir o mesmo protocolo e substituir o meio completo com meio condrogénica sem TGF-β3. <ol><li> Para gerar a construção de agregado 3D, colocar em contacto os agregados 2 no dia 8 de modo a formar 8 dupletos e iniciar a fusão. No dia 11, mesclar 2 dobletes para formar 4 quadrigêmeos. Finalmente, fundir as 4 quádruplos no dia 15 para se obter a estrutura final. </li><li> Ao mesmo tempo, formar agregados por centrifugação de 2,5 x 10 5 marcado com células estaminais a 26015; g durante 5 min em 15 ml de tubos com 1,5 mL de meio de condrogénica com ou sem TGF-β3 (por amostra e de controlo, respectivamente). </li></ol></li><li> Para magneticamente andaimes de sementes, colocar cada andaime seco em uma placa de Petri. Use de polissacáridos matrizes porosas feitas de pululano / dextrano 21. Para cada andaime, dilui-se 2 x 10 6 culas estaminais marcadas em 350 uL de meio de condrogénica sem TGF-β3 e cuidadosamente pipetar as células sobre o andaime. <ol><li> Incubar durante 5 min a 37 ° C para permitir a penetração de células total dentro do andaime e, em seguida, cuidadosamente adicionar 3 mL de meio condrogénica com ou sem TGF-β3 (por amostra ou de controlo, respectivamente) para a placa de Petri. </li><li> Incubar o andaime celularizado no seu dispositivo magnético a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 4 dias para permitir a migração de células através dos poros de andaime e confinamento. </li></ol></li><li> Ao mesmo tempo, semear andaimes com 2 x 10 6 </saté&gt; células estaminais marcados seguindo o mesmo método e incubar sem o íman para obter andaimes semeados uniformemente como controlos positivos. </li></ol> 4. Diferenciação em condrócitos NOTA: Após 4 dias de incubação, remove os ímans e continuar a maturação condrogénica, quer numa placa de Petri (condições estáticas) ou num biorreactor (condições dinâmicas). amostras de controlo negativo são envelhecidos em condições estáticas com meio condrogénica sem TGF-β3. <ol><li> Em condições estáticas, manter os andaimes celularizados ou agregados na mesma placa de Petri. Mudar o meio condrogênica duas vezes por semana durante 21 dias. </li><li> Em condições dinâmicas, preparar o biorreator. <ol><li> Cortar tubagem de silicone com o comprimento adequado de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Autoclave todos os materiais: da câmara de 500 mL de cultura, de tubos, de rotadores de 2 vias, e gaiolas. </li><li> Colocar as peças de biorreactor em um MicroBio estérilestação de segurança lógica. Ligar a tubagem para as duas vias rotadores e para a câmara de cultura de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> transferir cuidadosamente os andaimes celularizados em gaiolas esterilizados utilizando uma espátula esterilizada. Coloque 2 andaimes por gaiola. Quando as gaiolas estão prontos, inseri-los nas agulhas da tampa para mantê-los de se mover durante a rotação adicional. Encher a câmara de cultura com meio condrogénica e fechá-lo com a tampa contendo as gaiolas. </li></ol></li><li> Ligar a bomba peristáltica para encher o tubo com o meio condrogénica e para eliminar as bolhas de ar. </li><li> Coloque e prenda a câmara cheia no motor do biorreator e ligar o computador, que controla as rotações tanto do braço e da câmara. </li><li> Aplicar uma velocidade de rotação de 5 rotações por minuto (rpm) em ambos o braço e a câmara. Ajustar a bomba peristáltica a um caudal de 10 rpm para uma alimentação contínua dos andaimes celularizados. </li></ol> NOTA: Antes da extracção de RNA, digerir os andaimes com uma solução enzimática. <ol><li> Prepare 1 ml de solução enzimática pela adição de 100 uL de pululanase (40 U / mL) e 50 uL de dextranase (60 mg / mL) a 850 mL de meio DMEM isento de soro. </li><li> Lavar os andaimes duas vezes com meio DMEM isento de soro, descartar o meio e adicionar 800 uL da solução enzimática por andaime. Incubar durante 15-30 min a 37 ° C sob agitação suave. </li><li> Quando o andaime esteja completamente dissolvido, transferir a solução contendo as células para um tubo de 1,5 mL, centrifugar a 300 x g durante 10 min, aspirar cuidadosamente o meio, lavar duas vezes com estéril 1 × solução salina tamponada com fosfato (PBS), centrifugar a 300 × g durante 10 min, e re-suspender as células na solução de isolamento de ARN. </li><li> Para extrair o ARN a partir de agregados, colocar os esferóides na solução de isolamento de ARN ecompletamente esmagar-los utilizando um homogeneizador antes de realizar a extraco de ARN. </li><li> Isola-se o ARN utilizando um kit de extracção de ARN total de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Sintetizar ADN complementar a partir de 400 ng de ARN total utilizando a transcriptase inversa de acordo com as instruções do fabricante, utilizando 250 ng de iniciadores aleatórios, 1 uL de mistura de dNTP (10 mM cada), e 40 U / ml de RNase inibidor; o volume final da reacção é de 20 pL. No final da reacção, adicionar 80 mL de água destilada para obter um volume final de 100 uL. </li><li> Para quantitativa da reacção em cadeia da polimerase (PCR), utilizar uma mistura de PCR contendo um reagente fluorescente para quantificar a expressão relativa de genes de interesse, tais como agrecano (AGC) e colagénio II (Col II), com 10 × de cDNA diluído. Normalizar os níveis de expressão do gene com a proteína ribossómica do gene de referência, Grande, P0 (RPLP0). Executar os cálculos com o 2 - fórmula ΔΔCT, Onde ΔΔCT =? Ct de condição diferenciada - significa? Ct de condição de controlo, e cada um de? Ct representa a CT do gene de interesse - a CT do gene de referência (RPLP0). </li><li> Determinar medidas estatísticas como os valores médios ± o erro padrão da média (SEM). Realizar a análise com n ≥ 2 experimentos independentes. Utilização do teste t de Student para analisar as diferenças estatísticas entre os peletes centrifugadas e fuss magnéticos (* p &lt;0,05). Determinar o significado com um teste de Kruskal-Wallis (ANOVA de uma via não paramétrico) para analisar as diferenças estatísticas entre os suportes diferenciados e com o andaime de controlo (* p &lt;0,05). </li></ol> 6. Análise histológica <ol><li> Lavar os andaimes celularizados ou agregados com estéril 1 x PBS, corrigi-los em solução de formalina a 10% durante 1 h à temperatura ambiente, e lavar com 1 x PBS. </li><li> Remover o PBS, incorporar as amostras em cuttin óptimag composto de temperatura (OCT), e congelá-los num banho de isopentano imerso em azoto líquido. Armazenar a amostra a -20 ° C. Corte as amostras com um criostato para obter criocortes 8-M para os agregados ou de 12 mm para os andaimes celularizados. </li><li> Manchar os criocortes com solução de azul de toluidina a 0,5% durante 2 minutos, enxaguar com água da torneira, desidratar com 100% de etanol, clarificar usando tolueno, e montar as lâminas com um meio de montagem para a microscopia de luz. </li></ol>

<ol><li>Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+imaging+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Clinical imaging in regenerative medicine.</a> Nat Biotechnol. 32 (8), 804-818 (2014).</li>
<li>Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+based+stem+cell+tracking+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine.</a> Theranostics. 3 (8), 573-582 (2013).</li>
<li>Di Corato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+cellular+MRI%3A+gadolinium+and+iron+oxide+nanoparticles+for+in-depth+dual-cell+imaging+of+engineered+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">High-resolution cellular MRI: gadolinium and iron oxide nanoparticles for in-depth dual-cell imaging of engineered tissue constructs.</a> ACS Nano. 7 (9), 7500-7512 (2013).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+magnetic+assembly+of+microscale+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional magnetic assembly of microscale hydrogels.</a> Adv Mater. 23 (37), 4254-4260 (2011).</li>
<li>Kito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cell+sheets+created+by+a+novel+magnetite+tissue+engineering+method+for+reparative+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">iPS cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for reparative angiogenesis.</a> Sci Rep. 3, 1418(2013).</li>
<li>Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+in+vascular+tissue+engineering%3A+from+nanoscaffolding+towards+rapid+vessel+biofabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology in vascular tissue engineering: from nanoscaffolding towards rapid vessel biofabrication.</a> Trends Biotechnol. 26 (6), 338-344 (2008).</li>
<li>Mattix, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Janus+magnetic+cellular+spheroids+for+vascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Janus magnetic cellular spheroids for vascular tissue engineering.</a> Biomaterials. 35 (3), 949-960 (2014).</li>
<li>Henstock, J., El Haj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+mechanotransduction+in+therapeutic+MSCs%3A+can+remotely+controlled+magnetic+nanoparticles+regenerate+bones%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Controlled mechanotransduction in therapeutic MSCs: can remotely controlled magnetic nanoparticles regenerate bones?</a> Regen Med. 10 (4), 377-380 (2015).</li>
<li>Fayol, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+magnetic+forces+to+promote+stem+cell+aggregation+during+differentiation%2C+and+cartilage+tissue+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling.</a> Adv Mater. 25 (18), 2611-2616 (2013).</li>
<li>Bartlett, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+chondrocyte+implantation+versus+matrix-induced+autologous+chondrocyte+implantation+for+osteochondral+defects+of+the+knee%3A+a+prospective%2C+randomised+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Br%22%5BJournal%5D)">Autologous chondrocyte implantation versus matrix-induced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee: a prospective, randomised study.</a> J Bone Joint Surg Br. 87 (5), 640-645 (2005).</li>
<li>Batty, L., Dance, S., Bajaj, S., Cole, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+chondrocyte+implantation%3A+an+overview+of+technique+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22ANZ+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Autologous chondrocyte implantation: an overview of technique and outcomes.</a> ANZ J Surg. 81, 18-25 (2011).</li>
<li>Song, L., Baksh, D., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-based+cartilage+tissue+engineering%3A+cells%2C+scaffold+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-based cartilage tissue engineering: cells, scaffold and biology.</a> Cytotherapy. 6 (6), 596-601 (2004).</li>
<li>Boeuf, S., Richter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenesis+of+mesenchymal+stem+cells%3A+role+of+tissue+source+and+inducing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors.</a> Stem Cell Res Ther. 1 (4), 31(2010).</li>
<li>Kock, L., van Donkelaar, C. C., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+functional+articular+cartilage%3A+the+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of functional articular cartilage: the current status.</a> Cell Tissue Res. 347 (3), 613-627 (2012).</li>
<li>Schon, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+high-throughput+microtissue+fabrication+process+for+3D+assembly+of+tissue+engineered+cartilage+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Validation of a high-throughput microtissue fabrication process for 3D assembly of tissue engineered cartilage constructs.</a> Cell Tissue Res. , (2012).</li>
<li>Robert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+micro-manipulations+to+probe+the+local+physical+properties+of+porous+scaffolds+and+to+confine+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Magnetic micro-manipulations to probe the local physical properties of porous scaffolds and to confine stem cells.</a> Biomaterials. 31 (7), 1586-1595 (2010).</li>
<li>Luciani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+chondrogenesis+within+scaffolds%2C+using+magnetic+stem+cell+confinement+and+bioreactor+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Successful chondrogenesis within scaffolds, using magnetic stem cell confinement and bioreactor maturation.</a> Acta Biomaterialia. 37, 101-110 (2016).</li>
<li>Wilhelm, C., Gazeau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+cell+labelling+with+anionic+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles.</a> Biomaterials. 29 (22), 3161-3174 (2008).</li>
<li>Fayol, D., Luciani, N., Lartigue, L., Gazeau, F., Wilhelm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+magnetic+nanoparticle+aggregation+and+cellular+uptake%3A+a+precondition+for+efficient+stem-cell+differentiation+and+MRI+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Managing magnetic nanoparticle aggregation and cellular uptake: a precondition for efficient stem-cell differentiation and MRI tracking.</a> Adv Healthc Mater. 2 (2), 313-325 (2013).</li>
<li>Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetophoresis+and+ferromagnetic+resonance+of+magnetically+labeled+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells.</a> Eur Biophys J. 31 (2), 118-125 (2002).</li>
<li>Autissier, A., Le Visage, C., Pouzet, C., Chaubet, F., Letourneur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+porous+polysaccharide-based+scaffolds+using+a+combined+freeze-drying%2Fcross-linking+process%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process.</a> Acta Biomater. 6 (9), 3640-3648 (2010).</li>
<li>Singh, N., Jenkins, G. J. S., Asadi, R., Doak, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+toxicity+of+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+%28SPION%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Reviews%22%5BJournal%5D)">Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION).</a> Nano Reviews. 1, (2010).</li>
<li>Lee, J. H., Hur, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+formation+of+a+millimeter-scale+multicellular+spheroid+with+an+internal+cavity+from+magnetically+levitated+3T3+cells+that+ingested+iron+oxide-containing+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free formation of a millimeter-scale multicellular spheroid with an internal cavity from magnetically levitated 3T3 cells that ingested iron oxide-containing microspheres.</a> Biotechnol Bioeng. 111 (5), 1038-1047 (2014).</li>
<li>Mattix, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+magnetic+cellular+spheroids+as+building+blocks+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Biological magnetic cellular spheroids as building blocks for tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 10 (2), 623-629 (2014).</li>
<li>Mazuel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+Intracellular+Biodegradation+of+Iron+Oxide+Nanoparticles+Evidenced+Magnetically+at+Single-Endosome+and+Tissue+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels.</a> ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).</li>
<li>Kim, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+generation+of+spheroids+using+magnetic+nanoparticles+for+three-dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture.</a> Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).</li>
<li>Shimizu, K., Ito, A., Honda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+cell-seeding+into+3D+porous+scaffolds+by+use+of+magnetite+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+B+Appl+Biomater%22%5BJournal%5D)">Enhanced cell-seeding into 3D porous scaffolds by use of magnetite nanoparticles.</a> J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 77 (2), 265-272 (2006).</li>
<li>Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+nanoparticle-based+approaches+to+locally+target+therapy+and+enhance+tissue+regeneration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo.</a> Nanomedicine (Lond). 7 (9), 1425-1442 (2012).</li>
<li>Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-axial+mechanical+stimulation+of+tissue+engineered+cartilage%3A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review.</a> Eur Cell Mater. 13, 66-74 (2007).</li>
<li>Takahashi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compressive+force+promotes+sox9%2C+type+II+collagen+and+aggrecan+and+inhibits+IL-1beta+expression+resulting+in+chondrogenesis+in+mouse+embryonic+limb+bud+mesenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Compressive force promotes sox9, type II collagen and aggrecan and inhibits IL-1beta expression resulting in chondrogenesis in mouse embryonic limb bud mesenchymal cells.</a> J Cell Sci. 111 (14), 2067-2076 (1998).</li>
<li>Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compressive+strain+influences+chondrogenic+gene+expression+in+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells.</a> Biorheology. 43, 455-470 (2006).</li>
<li>Vunjak-Novakovic, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+cultivation+conditions+modulate+the+composition+and+mechanical+properties+of+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage.</a> J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Primeiro, porque as técnicas aqui apresentadas dependem da internalização de nanopartículas magnéticas, uma questão importante é o resultado das nanopartículas, uma vez que localizar dentro das células. É verdade que as nanopartículas de ferro pode provocar potencial toxicidade ou a capacidade de diferenciação prejudicada dependendo do seu tamanho, de revestimento, e tempo de exposição de 19, 22. No entanto, vários estudos têm demonstrado nenhum impacto sobre a ...

nanopartículas magnéticas já são utilizados na clínica como agentes de contraste para ressonância magnética (MRI), e suas aplicações terapêuticas continuar expandindo. Por exemplo, recentemente, tem sido mostrado que as células marcadas podem ser manipuladas in vivo, utilizando um campo magnético externo e podem ser dirigidas e / ou mantido a um sítio definido de implante 1, 2, 3. Na medicina regenerativa, eles podem ser utilizados para manipular tecidos organizados in vitro 4, incluindo tecido vascular 5, 6, 7, 8, osso, cartilagem e 9. A cartilagem articular é imersa num ambiente avascular, fazer reparações dos componentes da matriz extracelular muito limitada quando ocorrerem danos. Por esta razão, research está atualmente focada na engenharia de substituições de cartilagem hialina que podem ser implantados no local do defeito. A fim de produzir um substituto autólogo, alguns grupos de pesquisa estão explorando o uso de condrócitos autólogos como fonte de células 10, 11, enquanto outros enfatizam a capacidade das células-tronco mesenquimais (MSC) para se diferenciar em condrócitos 12, 13. Em estudos anteriores retomados aqui, foram selecionados MSC, como sua amostragem de medula óssea é bastante simples e não requer o sacrifício de condrócitos saudáveis, que correm o risco de perder o seu fenótipo 14. Um passo inicial essencial para iniciar a diferenciao condrogica de células estaminais é a sua condensação. Agregados celulares são normalmente formados usando centrifugação ou cultura de micromassa 15; no entanto, estes métodos de condensação neither apresentam o potencial de criar agrupamentos de células dentro de andaimes espessas nem o potencial para controlar a fusão de agregados. Neste artigo, descrevemos uma abordagem inovadora para condensar as células-tronco usando rotulagem magnético MSC e atração magnética. Esta técnica tem sido provada para formar construções de 3D livre de andaime através da fusão de agregados um com o outro para se obter um tecido cartilaginoso-escala milimétrica 9. semeadura magnético de andaimes de espessura e grandes também permitiu a possibilidade de aumentar o tamanho da engenharia de tecidos, desenhando uma forma mais facilmente útil para a implantação, e diversificar o potencial para aplicações clínicas de reparação da cartilagem. Aqui, nós detalhe do protocolo para a semeadura magnético de MSC em matrizes porosas compostas de polissacáridos naturais, pululano e dextrano, andaimes anteriormente utilizado para confinar células estaminais 16, 17. diferenciao condrogica foi finally realizada num biorreactor para garantir contínua de nutrientes e de difusão de gás para o núcleo da matriz dos andaimes semeados com uma alta densidade de células. Além de fornecer nutrientes, factores de crescimento condrogénicas, e gás às células, o biorreactor oferecido estimulação mecânica. Em geral, a tecnologia magnético utilizado para confinar células estaminais, combinada com a maturação dinâmico num biorreactor, podem melhorar acentuadamente a diferenciação condrogénica.

<table><tbody><tr><td>Nanopartículas de óxido de ferro (maghemita) (&gamma;-Fe2O3)</td><td>PHENIX - University Paris 6</td><td>Fabricado e doado por C. M&eacute; nager</td><td>Diâmetro médio de 8,1 nm e carga superficial negativa</td></tr><tr><td>Polissacarídeo Andaimes pululano/dextrano</td><td>LIOAD - Universidade Nantes</td><td>Feito e dado por C. Le Visage</td><td>Preparado a partir de uma mistura 75:25 de pululano/dextrano em condições alcalinas (10&nbsp; M NaOH). Porosidade: 185-205&nbsp; &micro; m; Espessura: 7&nbsp; milímetro; Área de superfície: 1,8&nbsp; cm2.</td></tr><tr><td>Sistema de Regeneração TisXell</td> Biorreator biaxial <td>QX900-002</td> da <td>QuinXell Technologies</td><td>com câmara de cultura de 500 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Gaiola para andaimes: Histosette II M492&nbsp;</td><td>VWR</td><td>720-0909</td><td></td></tr><tr><td>Célula estaminais mesenquimais (MSC)</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>Foram utilizados três lotes independentes</td></tr><tr><td>MSCGM BulletKit médio</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>Para o meio completo, adicione o BulletKit fornecido (contendo soro, glutamina e antibióticos) ao meio MSCGM</td></tr><tr><td>DMEM com Glutamax I</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>Sem piruvato de sódio, sem HEPES</td></tr><tr><td>Meio RPMI 1640, sem Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>31870-025</td><td>Sem piruvato de sódio, sem HEPES</td></tr><tr><td>PBS sem CaCl2 sem MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Tripsina-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina (10,000&nbsp; U/mL) / Estreptomicina (10.000&nbsp; &micro; g/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)</td><td>Corning</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>Solução de piruvato de sódio 100 mM</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico 2-fosfato</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>Prepare a solução concentrada (25 mM) em água destilada extemporaneamente</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma</td><td>P5607</td><td>Prepare a solução estoque de 175 mM diluída em água destilada e armazene a 4 horas; &deg; C</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Prepare a solução estoque de 1 mM diluída em etanol 100% e armazene a -20&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>TGF-beta 3 proteína 10&nbsp; &micro; g</td><td>Interchim</td><td>30R-AT028</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de trissódio</td><td>VWR</td><td>33615.268</td><td>Prepare o 1&nbsp; M solução estoque diluída em água destilada e armazene a 4&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Pululanase de Bacillus acidopullulyticus</td><td>Sigma</td><td>P2986</td><td></td></tr><tr><td>Dextranase de Chaetomium erraticum</td><td>Sigma</td><td>D0443</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração de RNA NucleoSpin</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.5</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Transcriptase reversa</td><td>Life Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Random Primer - Hexamer&nbsp;</td><td>Promega</td><td>C1181</td><td>500 &micro; g/mL: Use diluído 1/2 e coloque 1 &micro; L por amostra</td></tr><tr><td>RNAs recombinantes no inibidor da ribonuclease</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>40 U/&micro; L: coloque 1 &micro; L por amostra</td></tr><tr><td>PCR nucleotídeo dNTP mix (10&nbsp; mM cada)</td><td>Roche</td><td>10842321</td><td></td></tr><tr><td>SyBr Green PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4368708</td><td></td></tr><tr><td>Step One Plus Sistema de PCR em Tempo Real</td><td>Life Technologies</td><td>4381792</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formalina 10% com tamponamento neutro</td><td>Sigma</td><td>HT5012</td><td></td></tr><tr><td>Solução de OCT</td><td>VWR</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Isopentano</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Azul de toluidina O</td><td>VWR</td><td>1.15930.0025</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>VWR</td><td>20821.310</td><td></td></tr><tr><td>Tolueno</td><td>VWR</td><td>1.08323.1000</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem Pertex</td><td>Histolab</td><td>840</td><td></td></tr><tr><td>RPLP0 Primer para qPCR</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3'Aggrecan</td></tr> <tr><td>Primer para qPCR</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'Collagen</td></tr> <tr><td>II Primer para qPCR</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'</td></tr></tbody></table>

3d agregação stem magnetic celular e biorreator maturação para regeneração da cartilagem

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Engenharia cartilagem permanece um desafio devido às dificuldades de criação de um implante funcional in vitro semelhante ao tecido nativo. Uma abordagem recentemente explorada para o desenvolvimento de substitutos autólogos envolve a diferenciação de células estaminais em condrócitos. Para iniciar este condrogénese, um grau de compactação das células estaminais é necessário; Assim, foi demonstrada a viabilidade de células magneticamente de condensação, tanto dentro de andaimes espessas e livres de andaime, utilizando as fontes de campo magnico em miniatura como atractores de células. Esta abordagem também magnética foi usada para guiar fusão agregado e para construir livre de andaime, organizada, tridimensional (3D) tecidos vários milímetros de tamanho. Além de ter um tamanho aumentado, o tecido formado pela fusão magnética-driven apresentou um aumento significativo na expressão de colagénio II, e observou-se uma tendência similar para a express de agrecano. Como a cartilagem nativa foi submetido a forças tchapéu influenciado sua estrutura 3D, a maturação dinâmica também foi realizada. Um bio-reactor que fornece estímulos mecânicos foi utilizado para a cultura dos andaimes magneticamente semeadas ao longo de um período de 21 dias. Biorreactor maturação largamente melhorada condrogénese nos andaimes celularizados; a matriz extracelular obtida sob estas condições era rico em colagénio II e agrecan. Este trabalho descreve o potencial inovador de condensação magnética de células estaminais marcados e maturação dinâmico num biorreactor para uma melhor diferenciação condrogénica, ambas isentas de andaime e dentro de suportes de polissacáridos.

Em primeiro lugar, os agregados podem ser formados individualmente usando micro-imans através do depósito de 2,5 x 10 5 culas estaminais marcados (Figura 2A). Estes agregados individuais (~ 0,8 mm de tamanho) pode, então, ser fundidos em estruturas maiores, graças à fusão sequencial, induzida magneticamente. Por exemplo, no dia oito de maturação condrogénica, os agregados foram colocados em contacto aos pares para formar dupletos; quádruplos foram montados no ...

Condrogênese a partir de células-tronco requer ajuste fino as condições de cultura. Aqui, apresentamos uma abordagem magnética para células de condensação, um passo essencial para iniciar chondrogenesis. Além disso, mostramos que a maturação dinâmico num biorreactor aplica estimulação mecânica para as construes celulares e aumenta a produção de matriz extracelular cartilaginosa.

3D Agregação Stem Magnetic celular e biorreator Maturação para regeneração da cartilagem

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

O objetivo geral deste método de agregação magnética celular e maturação dinâmica é melhorar a condrogênese in vitro de células estromais mesenquimais ou CEMs. A agregação magnética de células-tronco em vez da condrogênese como condensação celular é uma etapa inicial fundamental do processo de regeneração da cartilagem. Após as células-tronco serem confinadas em scaffolds, os scaffolds podem ser transferidos para um biorreator celular para avaliar a maturação dinâmica das células.O importante método dinâmico pode ser aplicado a outros biossistemas, como reparo muscular, cardíaco ou vascular. Mas, como você verá, ele é muito adequado para a regeneração da cartilagem. A demonstração visual do enxerto celular magnético e da maturação celular dinâmica utilizando o biorreator real é fundamental, pois essas duas técnicas são difíceis de aprender apenas com instruções textuais.Para construir o dispositivo com micromagnetos para formação de agregados, insira primeiro uma ponta magnética de 750 micrômetros de diâmetro em cada orifício de três centímetros de profundidade em uma placa de alumínio com seis milímetros de espessura e posicione a placa sobre um ímã permanente de neodímio. Para co

3d-magnetic-stem-cell-aggregation-bioreactor-maturation-for-cartilage

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Objetivo da apresentação é mostrar um método altamente reprodutível para gerar matriz associada implantes de células-tronco em defeitos da cartilagem, que pode ser visualizado com ressonância magnética. As células estaminais são rotulados com FDA-approved Ferumoxides, misturado com agarose, implantado em defeitos da cartilagem e fotografada com um scanner MR 7T.

Implantação de Ferumoxides identificadas células-tronco mesenquimais em defeitos da cartilagem

Nós projetamos um novo biorreator carga mecânica que pode aplicar uniaxial ou biaxial de tensão mecânica para um biocomposite cartilagem antes do transplante em um defeito da cartilagem articular.

Projeto de um biorreator Carregando Mecânica Biaxial para Engenharia de Tecidos

Neste trabalho, apresentamos uma técnica para a fabricação rápida de tecidos vasculares vivos por cultura direta de colágeno, células musculares lisas e células endoteliais. Além disso, um novo protocolo para a caracterização mecânica de tecidos vasculares projetados é descrito.

Engenharia 3D celularizados Colágeno Gel para Vascular Regeneração Tecidual

O reparo da cartilagem representa um desafio médico não atendido e as abordagens baseadas em células para projetar a cartilagem articular humana são uma solução promissora. Aqui, descrevemos os hidrogéis biomiméticos tridimensionais (3D) como uma ferramenta ideal para a expansão e maturação de condrócitos articulares humanos.

3D Hidrogel Andaimes para articular de condrócitos Cultura e Geração de cartilagem

Aqui, apresentamos um protocolo para obter sistemas 3D-cultura na auto montagem de andaimes de peptídeo para promover a diferenciação de condrócitos articulares humanas condrossarcoma em tecido de cartilagem, como.

Cultivo de células de mamíferos em andaimes tridimensionais do Peptide

Este artigo apresenta um protocolo simples e económico para o simples isolamento e purificação de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial do coelho branco Nova Zelândia.

Magnético-ativado da pilha classificação estratégias para isolar e purificar sinovial fluidos derivados mesenquimais células-tronco de um modelo de coelho

Um sistema bioreator de estimulação mecânica uniaxial tridimensional é um bioreator ideal para diferenciação tenogênica específica de células-tronco derivadas do tendão e formação de neo-tendões.

Aplicando um sistema bioreator de estimulação mecânica uniaxial tridimensional para induzir a diferenciação tenogênica de células-tronco derivadas do tendão

Este protocolo descreve um método de padronização de células sem tinta, sem rótulo, independente de substrato e de alto rendimento, baseado no efeito Arquimedes Magnético.

Padronização de células usando a estratégia Magnetic-Archimedes

Este estudo descreve um método para produzir esferoides condrocíticos agregando células em esferoides sob condições de baixa adesão usando gravidade, seguido de cultura dos esferoides resultantes em mini-biorreatores.

Geração de esferoides a partir de vários condrócitos usando condições de baixa aderência sob gravidade e mini-biorreatores caseiros

As células-tronco perivascular (PSC) é um romance classe de células-tronco para a regeneração do tecido ósseo semelhante a células-tronco mesenquimais (MSCs). PSCs pode ser isolado por FACS (classificação de células activadas por fluorescência) a partir de tecido adiposo adquiridos durante procedimentos padrão lipoaspiração, então combinada com um andaime osteoindutora para alcançar a formação de...

Uso de Células-tronco humanas perivasculares para Regeneração Óssea

Aprenda agregação magnética de células-tronco mesenquimais e maturação dinâmica em biorreator para regeneração da cartilagem. Este método melhora a condrogênese in vitro e a produção de matriz extracelular.

3D Agregação Stem Magnetic celular e biorreator Maturação para regeneração da cartilagem

Explorar mais vídeos