3D Agregação Stem Magnetic celular e biorreator Maturação para regeneração da cartilagem

O objetivo geral deste método de agregação celular magnética e maturação dinâmica é melhorar a condrogênese in vitro de células estromais mesenquimais ou MSCs. A agregação magnética de células-tronco em vez de condrogênese como condensação celular é uma etapa fundamental do processo de regeneração da cartilagem. Depois que as células-tronco são confinadas em andaimes, os andaimes podem ser movidos para o biorreator celular para avaliar a maturação dinâmica das células.

Um método dinâmico importante pode ser aplicado a outros biossistemas, como reparo muscular, cardíaco ou vascular. Mas, como você verá, é muito adequado para a regeneração da cartilagem. A demonstração visual da semeadura magnética da célula e da maturação dinâmica da célula usando o biorreator real é crítica porque essas duas técnicas são difíceis de aprender apenas com instruções de texto.

Para construir o dispositivo micromagnético para formação de agregados, primeiro insira uma ponta magnética de 750 micrômetros de diâmetro em cada orifício de três centímetros em uma placa de alumínio de seis milímetros de espessura e coloque a placa sobre um ímã de neodímio permanente. Para construir um dispositivo para semeadura de andaimes, primeiro corte o poliestireno duro em quadrados de 2,4 centímetros quadrados e insira ímãs de três milímetros de diâmetro e seis milímetros de comprimento a uma distância igual sobre uma superfície de 1,6 centímetro quadrado. Em seguida, coloque o dispositivo sobre um ímã de neodímio permanente.

Para rotular as MSCs humanas, primeiro cultive as células-tronco em meio de crescimento MSC completo a 37 graus Celsius a 5% de dióxido de carbono até que estejam 90% confluentes. Aspire e depois enxágue as células com soro três meio RPMI sem glutamina e adicione 10 mililitros de solução de nanopartículas de óxido de ferro por frasco de cultura de 150 centímetros quadrados para uma incubação de 30 minutos na incubadora de cultura de células. No final da incubação, enxágue as células por cinco minutos com soro três meio RPMI sem glutamina para internalizar as nanopartículas ainda presas à membrana plasmática.

Em seguida, substitua o RPMI em cada frasco por 25 mililitros de meio de crescimento MSC completo e retorne as células à incubadora de cultura de células durante a noite. Na manhã seguinte, separar as células magnéticas com oito mililitros de 05% de tripsina-EDTA por frasco. E colete as células dissociadas por centrifugação.

Suspendemos os grânulos para contagem e colocamos uma placa de Petri de cultura de células de 35 milímetros com fundo de vidro em cima de cada dispositivo magnético. Para formar magneticamente os agregados, adicione três mililitros de meio condrogênico a cada placa de Petri e deposite suavemente não mais do que oito microlitros de 2,5 vezes 10 na 5ª célula marcada por agregado. É fundamental que as células não sejam depositadas nem muito lentamente nem muito rápido.

E nem muito perto nem muito longe do magnetismo. Quando todos os agregados tiverem sido colocados, permita que os esferóides se formem por 20 a 30 minutos sem perturbação. Em seguida, transfira os agregados para a incubadora de cultura de células.

No mesmo dia, formar agregados centrifugando 2,5 vezes 10 elevado à 5ª células-tronco marcadas em tubos cônicos de 15 mililitros com 1,5 mililitros de meio condrogênico. Para semear magneticamente os scaffolds, coloque um scaffold poroso polissacarídeo pululano/dextrano seco por placa de Petri e dilua 2 vezes 10 para a 6ª célula marcada em 350 microlitros de meio condrogênico sem TGFbeta3. Pipete cuidadosamente as células nos andaimes e incube as estruturas a 37 graus Celsius para permitir a penetração total das células.

Após cinco minutos, adicione suavemente três mililitros de meio condrogênico à placa de Petri e devolva os andaimes à incubadora de cultura de células por quatro dias para permitir que as células migrem pelos poros do andaime. No mesmo dia, semeie também outro conjunto de andaimes com 2 vezes 10 elevado à 6ª células-tronco marcadas conforme demonstrado e incube as células sem o ímã para obter andaimes uniformemente semeados como controles positivos. Para condrogênese em andaimes no quinto dia, remova o dispositivo magnético de todos os andaimes e retorne os andaimes estáticos para a incubadora de cultura de células até o dia 25, trocando o meio duas vezes por semana.

Para cultura de células dinâmicas, também no quinto dia, corte o tubo de silicone no comprimento apropriado de acordo com as instruções do fabricante e acompanhe o tubo, a câmara de cultura de 500 mililitros, os rotadores bidirecionais e as gaiolas em uma estação de segurança microbiológica estéril. Seguindo as instruções do fabricante, conecte a tubulação aos rotadores bidirecionais na câmara de cultura. Em seguida, use uma espátula estéril para transferir cuidadosamente dois andaimes celularizados para cada gaiola.

Quando todos os andaimes tiverem sido transferidos, insira as gaiolas através das agulhas na tampa para evitar que se movam durante a rotação. E encha a câmara de cultura com meio condrogênico. Use técnica anti-séptica estéril ao preparar as câmaras para evitar a contaminação de qualquer uma das ferramentas ou andaimes.

Em seguida, insira as gaiolas na câmara e, em seguida, feche a câmara e ligue a bomba peristáltica para encher a tubulação com meio condrogênico e eliminar as bolhas de ar. Coloque e prenda a câmara cheia dentro do motor do biorreator e ligue o computador que controla as rotações do braço e da câmara. Em seguida, aplique uma velocidade de rotação de cinco rotações por minuto no braço e na câmara e ajuste a bomba peristáltica para uma vazão de 10 rotações por minuto para alimentação contínua dos andaimes celularizados.

Para gerar uma construção de agregado 3D livre de andaimes no oitavo dia, inicie a fusão colocando dois agregados em contato em meio condrogênico para oito dublets. Então, no dia 11, mescle dois dublets para formar quatro quádruplos e forme a estrutura final no dia 15, fundindo os quatro quádruplos. Os tecidos formados por fusão magnética demonstram um aumento significativo na expressão de colágeno II em comparação com os pellets obtidos por centrifugação.

Com uma tendência aumentada de expressão agregante. Para scaffolds estáticos celularizados e aumento nas expressões de agregante e colágeno II são observadas quando a semeadura magnética é usada, em comparação com a scaffold semeada sem forças magnéticas. Curiosamente, a expressão de colágeno II é muito maior quando a semeadura magnética é combinada com a diferenciação dinâmica.

A análise histológica usando azul de toluidina revela que a fusão magnética sequencial de 16 agregados exibe uma deposição abundante de glicanos de glucosamina. Além disso, em andaimes semeados magneticamente, o teor de glucosamina glicano é maior quando os andaimes são diferenciados em um biorreator do que quando são cultivados estaticamente. Uma vez dominada, a agregação de células magnéticas pode ser concluída em duas horas, se realizada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ressuspender as células marcadas no menor volume possível para facilitar a formação do agregado. Após a semeadura magnética dos scaffolds, a maturação dinâmica usando o biorreator real pode ser realizada para melhorar a expressão de novos condrócitos sintetizados. Desde o seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da medicina regenerativa explorarem a regeneração da cartilagem articular em humanos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir dispositivos magnéticos, rotular células-tronco, formar agregados de células-tronco, semear magneticamente andaimes e usar um biorreator real. Não se esqueça de que trabalhar com células e tecidos humanos pode ser extremamente perigoso e que precauções devem sempre ser tomadas, como usar luvas, jalecos e óculos de proteção.