Name: Extrusão hidráulico da medula espinhal e Isolamento de gânglios das raízes dorsais em roedores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprenda a extrusão hidráulica da medula espinhal e isolamento de gânglios das raízes dorsais em roedores. Este método rápido minimiza danos teciduais e facilita estudos neurobiológicos em camundongos e ratos.

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Gostaríamos de agradecer a David Kiel, da Universidade de Aarhus, pelas filmagens e edição. O software VirtualDub foi utilizado para o processamento das sequências de vídeo do microscópio. Agradecemos ao Instituto Dinamarquês de Pesquisa de Neurociência Translacional - DANDRITE, à Parceria Nórdica EMBL, pelo acesso ao equipamento e à Fundação de Pesquisa da Universidade de Aarhus, ao projeto EU 7FP PAINCAGE, ao Det Frie Forskningsrad (DFF) e à Fundação Lundbeck pelo financiamento.

Todos os animais foram manipulados em plena conformidade com os regulamentos dinamarqueses e europeus. permissão número: 2012-15-2934. 1. Preparação da Seringa por hidráulico Extrusão da Medula Espinhal <ol><li> Para um rato adulto, use uma seringa de 10 ml. Para um rato adulto, use uma seringa de 5 mL. Para filhotes, use uma seringa mL 2.5. </li><li> Ajuste uma ponteira sem filtro universalmente adequado para 2-200 pipetas ul por aparar a extremidade da ponta da pipeta até que ele se encaixa com firmeza na seringa. Colocar a ponta da pipeta ajustado na seringa. Para filhotes, use um 23 G ou agulha similar ao invés de uma ponteira ajustado. </li><li> Aspirar gelada PBS estéril e deixar a seringa no gelo até à sua utilização. </li></ol> 2. eutanásia <ol><li> Não execute deslocamento cervical, como isso vai perturbar a coluna vertebral tornando extrusão impossível. </li><li> Para o adulto rat / mouse, eutanásia usando gás como o CO 2 ou isofluRane. Estas substâncias são prejudiciais. Executar a eutanásia em um exaustor e lidar com as substâncias de acordo com as diretrizes da instituição. (ATENÇÃO: CO 2: H280, P410, P403; isoflurano: H361d, P260, P281, P280) <ol><li> Para garantir que o roedor está morto, garantir a ausência de reflexo por beliscar uma pata com uma pinça. Decapitar o roedor usando tesoura grande. Para filhotes, eutanásia por decapitação. </li></ol></li></ol> 3. Isolamento da coluna vertebral <ol><li> Borrifar água sobre a pele para controlar o cabelo. </li><li> Utilizando um par de tesouras, o corte aberto da pele ao longo da coluna vertebral num sentido distal e isolar a coluna vertebral através do corte em ambos os lados ao longo da coluna vertebral além do osso pélvico. Cortar a medula espinhal distal ao osso pélvico com um par de tesouras. NOTA: O eixo rostral-caudal é denotado como o eixo proximal-distal ao longo do protocolo. <ol><li> Aparar a coluna vertebral utilizando um par de tesouras para evitar o proximal-mais e distais-maioria das áreas que estes podem tornar a coluna vertebral também em forma de S para o sucesso de extrusão medula espinhal. Certifique-se de que a medula espinhal é visível em ambas as extremidades. Se a medula espinhal não é visível, a guarnição da coluna vertebral com uma tesoura até a medula espinhal se torna visível. </li></ol></li></ol> 4. hidráulico Extrusão da Medula Espinhal <ol><li> Coloque uma placa de Petri (100 mm de diâmetro) cheio com PBS estéril em gelo. </li><li> Endireitar a coluna vertebral através da aplicação de um dedo indicador na parte dobrada (proximal a maior parte final) da coluna vertebral, endireitando assim a coluna espinal, tanto quanto possível. <ol><li> Para filhotes, evitar a flexão da coluna vertebral, as vértebras como será interrompido render extrusão medula espinal impossível. </li></ol></li><li> Insira a ponta da pipeta (23 G agulha para filhotes, alternativamente, 18 G agulha para ratos adultos) na distal-most final de coluna vertebral. Se inserido correctamente, a ponta é estabilizada na cavidade medular. </li><li> Certifique-se de que a coluna vertebral é endireitada, tanto quanto possível. Aplicar pressão constante, e expulsar a medula espinhal na placa de Petri sobre gelo. Certifique-se que a medula espinhal é mantido úmido no gelo, mantendo-o em PBS até novo tratamento. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig1.jpg" /> Figura 1: medulas espinhais representativos. Hidraulicamente extrudados medulas espinhais. Esquerda para a direita: rato adulto, rato adulto, filhote de cachorro mouse. alargamentos lombares marcada pela box. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 5. Identificação de gânglios das raízes dorsais (DRG) <ol><li> Dividir a coluna vertebral em duas partes longitudinais iguais, utilizando tesouras e colocar a coluna vertebral dividida sob o microscópio. </li><li> Identificar o segmento T13 vértebra por<html> localizar o local de ligação do distal-mais costae na coluna vertebral prestando atenção para não confundir o costae com os nervos intercostais nas proximidades. Os distal maioria costae estão ligados à parte proximal do segmento vértebra T13 eo T13 DRG está localizado distalmente ao T13 vértebra e proximal ao da vértebra L1. </li><li> Identificar DRGs concomitantes no sentido distal. Para um rato adulto, DRGs concomitantes aparecem em branco com o dorsal claramente visível e raízes ventrais. Para um rato adulto, DRGs concomitantes aparecem em branco com o dorsal claramente visível e raízes ventrais. Para filhotes, DRGs concomitantes aparecem como esferas claras. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig2.jpg" /> Figura 2: Identificação de DRG na coluna vertebral após a extrusão da medula espinhal. A coluna vertebral foi dividido permitindo a visualização de DRGs como indicado pelas setas. Exemplificado pelo rato adulto e filhote de cachorro mouse.<html> ref = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 6. Isolamento de DRGs <ol><li> Número pratos de Petri (30 mm de diâmetro) de acordo com as DRGs específicos a ser isolado, por exemplo, L3, L4, L5. Encha as placas de Petri com PBS gelado estéril e colocá-los em gelo. </li><li> Usando micro tesouras, dorsal cortar e raízes ventrais tão perto dos DRGs quanto possível para libertá-los, evitando danificar os DRGs. </li><li> Com a ponta da pinça fechadas, gentilmente retire DRGs e transferi-los para os correspondentes placas de Petri numeradas. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig3.jpg" /> Figura 3: Representante isolado DRGs. Esquerda para a direita: rato adulto, rato adulto, filhote de cachorro mouse.&quot;_blank&quot;&gt; Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 7. processamento de tecidos para análise posterior <ol><li> western blotting <ol><li> Isolar a área de tecido de interesse, por exemplo o alargamento de medula lombar da coluna vertebral. Se necessário, separe a medula espinhal em lados ipsi e contralateral e mais para dorsal e ventral chifres. </li><li> Colocar o tecido em tampão de lise, tais como lise tampão TNE (10 mM de base Tris, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1% de NP40 em dupla H2O destilada) contendo inibidores de enzimas apropriados em gelo. </li><li> Homogeneizar o tecido durante aproximadamente 30 s sobre gelo utilizando um pilão de trituração mecânica. </li><li> Centrifugar durante 15 minutos a 16000 xg, a 4 ° C e utilizar o sobrenadante para processamento adicional de acordo com protocolos padrão 5, 6 ou manter o sobrenadante a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol></li><li> ARN-análise <ol><li> Isolar o tecido de interesse. </li><li> Colocar imediatamente o tecido em solução de estabilização para estabilizar o ARN ARN para armazenamento. </li><li> Isolar o ARN de acordo com protocolos convencionais 7. </li><li> Converter o ARN em ADNc e executar qPCR de acordo com protocolos convencionais 7. </li></ol></li><li> A imuno-histoquímica <ol><li> Para o tecido fresco congelado (aplicável a medula espinhal): <ol><li> Prepare pó de gelo seco por pulverização cubos de gelo seco a um valor correspondente a duas colheres de sopa de pó. Cobrir cubos de gelo seco em um pano e pulverizar os cubos usando um martelo. Coloque a folha de prata (cerca de 5 cm x 5 cm) sobre uma camada de cubos de gelo seco e cobrir a folha de prata com pó de gelo seco. </li><li> Coloque a área da medula espinhal seleccionado para posteriores análises sobre o pó de gelo seco, usando uma pinça, deixe-o snap-congelamento, e transferir a medula espinhal a um tubo de crio. Mantenha-o em gelo seco em todos os momentos ou armazená-lo a -80 ° C até mais USe. </li><li> Transferir a medula espinal de um criostato (-20 ° C). Se necessário, cortar a medula espinhal dentro do criostato. Coloque a medula espinhal em material de incorporação dentro do criostato, a fim de anexá-lo ao disco de amostra. </li><li> Cortar o cordão espinal na espessura desejada, por exemplo, 5 um, e recolher em placas de vidro. Aqueça as placas de vidro com um dedo imediatamente anteriores à colheita de tecidos para melhor fixação. Manter qualquer tecido restante em tubos de crio a -80 ° C até à sua utilização. </li><li> Deixar as seções sobre placas de vidro dentro do criostato até estar pronto para pós-fixação. </li><li> Pós-fixar as secções por imersão em PFA a 4% durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Realização da coloração de acordo com protocolos padrão 8. </li></ol></li><li> tecido fixado para o seccionamento crio (aplicável a medula espinhal e DRGs) <ol><li> Fix medula espinal e DRGs em PFA a 4% (2 h para a medula espinal, 1,5 h para DRG de rato e 4 h para DRG de rato) em4 ° C (local de medula espinal em posição horizontal para evitar que se fixa numa posição dobrada). </li><li> Transferir o tecido a 25% w / v de sacarose durante a noite a 4 ° C. O tecido pode ser armazenada em 25% w / v de sacarose suplementado com algumas gotas de 10% de azida de sódio para prevenir a contaminação microbiana a 4 ° C até uso posterior. Se necessário, a guarnição da medula espinal para compensar o alargamento lombar, apenas em uma placa de silicone ou semelhante. </li><li> Com a ponta de uma toalha de papel, aspirar a solução de sacarose em excesso a partir do tecido. </li><li> Encher um meio caminho molde crio com material de incorporação. Empurre todas as bolhas para os lados do molde crio com ferramentas tais como pinças fechadas. </li><li> Coloque o tecido sobre o material de incorporação, usando uma pinça e assegurar a orientação tecido desejado. </li><li> Encher o molde com material de crio completamente a incorporação e empurrar quaisquer bolhas tão longe do tecido quanto possível (por exemplo, utilizando pinças fechadas). </li><li> Encha uma placa de Petri (100 mmem diâmetro) com 2-metilbutano. Esta substância é prejudicial. Execute esta etapa em um exaustor e lidar com a substância, de acordo com as diretrizes da instituição (CUIDADO: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310). </li><li> Colocar a placa de Petri sobre uma camada de gelo seco e adicionar dois cubos de gelo seco para a placa de Petri. Coloque o molde de crio na placa de Petri e permitir que o material de embutir para congelar completamente. </li><li> Manter o tecido embebido em gelo seco em todos os momentos, ou a -80 ° C envolvido em Parafilm até ulterior processamento. </li><li> Cortar o tecido num crióstato (-20 ° C) na espessura desejada, por exemplo, 5 | im. </li><li> Realização da coloração de acordo com protocolos padrão 8. </li></ol></li><li> tecido fixo para parafina-incorporação (aplicável a medula espinhal e DRGs) <ol><li> Fix medula espinal e DRGs em PFA a 4% (2 h para a medula espinal, 1,5 h para DRG de rato e 4 h para DRG de rato) a 4 ° C (medula espinhal lugarem posição horizontal para evitar que se fixa numa posição dobrada). </li><li> Transferir o tecido a 25% w / v de sacarose durante a noite a 4 ° C. O tecido pode ser armazenada em 25% w / v de sacarose suplementado com algumas gotas de 10% de azida de sódio para prevenir a contaminação microbiana a 4 ° C até uso posterior. </li><li> Isolar a área de tecido de interesse, por exemplo o alargamento de medula lombar da coluna vertebral. </li><li> Preencher um meio caminho molde a incorporação com parafina. </li><li> Arrefecer o molde brevemente a incorporação, colocando-o sobre a área de refrigeração da máquina incorporação para endurecer a parafina ligeiramente. Isto permite um melhor posicionamento do tecido. </li><li> Colocar o tecido na orientação desejada no molde incorporação. Encha o molde de incorporação com parafina e se refrescar imediatamente. </li><li> Coloque o molde contendo a incorporação de parafina, a 4 ° C durante a noite para deixar endurecer completamente e remover o bloco de parafina contendo o tecido a partir do molde de incorporação. </li><li> seções de corte Snd micrótomo na espessura desejada, por exemplo, 5 | im. </li><li> Realização da coloração de acordo com protocolos padrão 8. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
<li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Res Notes. 9, 82(2016).</li>
<li>Kennedy, H. S., Jones, C. 3rd, Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li>
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<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2583035/">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
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<li>Rigaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+and+strain+differences+in+rodent+sciatic+nerve+anatomy%3A+implications+for+studies+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain.</a> Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).</li>
<li>Green, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+non-genetic+factors+which+influence+the+type+of+the+skeleton+in+an+inbred+strain+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic and non-genetic factors which influence the type of the skeleton in an inbred strain of mice.</a> Genetics. 26 (2), 192-222 (1941).</li>
<li>Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20084054">Spinal cord electrophysiology.</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li>
<li>Ciglieri, E., Ferrini, F., Boggio, E., Salio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+in+vitro+morphofunctional+analysis+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">An improved method for in vitro morphofunctional analysis of mouse dorsal root ganglia.</a> Ann Anat. , 62-67 (2016).</li>
<li>Peeraer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+evaluation+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+as+an+in+vitro+model+for+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pain+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacological evaluation of rat dorsal root ganglion neurons as an in vitro model for diabetic neuropathy.</a> J Pain Res. 4, 55-65 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Se a coluna vertebral é perturbado, por exemplo, por deslocamento cervical, da medula espinhal vai dividir durante a extrusão. Se a medula espinal não pode ser extrudido, a coluna vertebral pode ser ligeiramente cortadas em ambas as extremidades e a tentativa de extrusão pode ser repetida. No caso de ser necessária toda a medula espinal para análise posterior, isto é, que consiste no alargamento do colo do útero, bem como o alargamento lombar, a coluna vertebral só deve ser ligeiramente cortadas. Se apenas o alargamento lombar é necessário para uma análise mais aprofundada, a medula espinhal deve ser aparado de acordo com o presente protocolo. A coluna vertebral deve ser esticado usando a ponta dos dedos para facilitar a extrusão. O protocolo é aplicável para roedores de todas as idades e é aqui exemplificada por um rato adulto (8 semanas), um cachorro rato (5 dias) e um rato adulto (10 semanas). Dependendo do tipo de animal e tensão, o número de seções torácica e lombar pode variar 9, </sup&gt; 10, 11. Dependendo das proteínas a ser analisada, roedores adultos pode ser perfundido com soluções inibidoras da enzima antes da eutanásia. Se realizar um experimento envolvendo a lesão do nervo unilateral, a medula espinhal podem ser divididos em lados ipsi e contralaterais, usando uma pinça ultra-finas imediatamente após a extrusão. Além disso, cada um dos lados pode ser dividida em lados dorsal e ventral. O tecido pode então ser processada para análises posteriores, por exemplo, transferência de Western. Transcardial perfusão-fixação com PFA antes da extrusão da medula espinal deve ser evitada, já que isto torna a medula espinal não-flexível e impede medula espinal extrusão hidráulico. Hidráulica extrusão medula espinhal vai arrancar as raízes dorsais. Para experiências em que são necessários raízes dorsais em anexo, laminectomia é recomendado. Além disso, as meninges espinais são perdidas por extrusão hidráulico, o que pode ser evitado por laminectomia padrão extrusão hidráulico da medula espinal e do isolamento de DRG também poderia ser realizada utilizando oxigenado fluido cerebrospinal artificial (ACSF) em vez de PBS gelado. O uso de ACSF permite a preservação do tecido isolado em um melhor ambiente fisiológico, o que é particularmente importante no caso de gravações electrofisiológicos subsequentes 12, 13. Uma alternativa para ACSF poderia ser PBS contendo 1 g / l de glicose para a produção de culturas de DRG primário 14. extrusão hidráulico da medula espinal é um método significativamente mais rápido do que a forma tradicional de isolamento da medula espinal por laminectomia, reduzindo o tempo de tratamento de tecido e, portanto, diminuindo o risco de danos proteína. A perfusão com um fixador, antes de se isolar a medula espinal por laminectomia pode reduzir o risco de danos no tecido durante a dissecção e durante a remoção final dada medula espinal a partir da coluna vertebral. No entanto, a fixação do tecido impede a sua aplicabilidade a análises, tais como transferência de Western. Rendimentos de extrusão hidráulicos estruturalmente tecido danificado 3 adequado para uma ampla gama de análises. identificação consistente de DRGs pode ser difícil. No entanto, isso é essencial para a análise de tecido, por exemplo, após lesão do nervo ciático. Numerando os DRGs de acordo com a sua localização em relação ao costae, DRGs pode ser identificado de forma consistente. Coloração de tecidos da medula espinal, bem como de DRGs podem ser optimizadas efectuando as variações de tratamento de tecido ilustradas descritas no protocolo de passo 7.

O objectivo geral do presente método é isolar a medula espinal, bem como para identificar e isolar DRGs 1, 2. Extrusão hidráulico da medula espinal é um método significativamente mais rápido do que a forma tradicional de isolamento da medula espinal por laminectomia, ou seja, quebrar as vértebras da coluna vertebral, um de cada vez, e este método reduz o risco de dano tecidual causado pelo processo de dissecção 3, 4 . DRGs podem ser difíceis de identificar. A correta identificação é muito importante para a análise do tecido, por exemplo, após a lesão do nervo ciático. Numerando os DRGs de acordo com a sua localização em relação ao costae, DRGs pode ser identificado de forma consistente. Tecido isolado pelas técnicas demonstradas aqui pode ser aplicado a uma ampla gama de análises incluindo Western blotting 5,6, 7 e qPCR coloração imuno-histoquímica 8. Ao identificar DRGs, é importante ter em conta que o número de segmentos da medula espinhal é conhecida a variar com o tipo e estirpe de animais 9, 10, 11. As vantagens de executar este método em ratinhos são o elevado número de variantes geneticamente modificados disponíveis e as despesas relativamente baixas de habitação. As vantagens em utilizar os ratos são o rendimento do tecido relativamente alta e se envolvendo lesões nervosas, o procedimento será facilitado com o tamanho.

<table><tbody><tr><td>Tesoura Bonn, extra fina, reta, 8,5 cm</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 14084-08</td><td>Para cortar a medula espinhal antes do isolamento de DRGs (camundongo adulto, rato adulto); Outro fabricante pode ser usado</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td># 5427 R</td><td>Para centrifugação de tecido homogeneizado</td></tr><tr><td>Micrótomo criostato</td><td>Leica Biosystems</td><td># CM 3050 S</td><td>Para cortar o tecido embutido antes da coloração; Outro modelo e fabricante pode ser usado</td></tr><tr><td>Fórceps, Dumont, # 3</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td> <td># 11231-30</td><td>Para manuseio da medula espinhal após a extrusão; Outro fabricante/tipo pode ser usado</td></tr><tr><td>Fórceps, Dumont, # 5</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 11252-20</td><td>Para isolamento de DRGs (camundongo adulto, rato adulto, filhote); Outro fabricante pode ser usado</td></tr><tr><td>Isoflurano (furano) IsoFlo Vet 100%</td> <td>Abbott</td> <td># 002185</td><td>Para eutanásia; Pode ser utilizado outro fabricante; CUIDADO: produtos químicos tóxicos</td></tr><tr><td>Iso-pentano GPR rectapur</td><td>VWR</td># <td>24872.298</td><td>Para congelamento instantâneo de tecidos; Pode ser utilizado outro fabricante; CUIDADO:</td></tr><tr><td>micrótomo</td> tóxico <td>Leica Biosystems</td><td># RM 2155</td><td>Para seccionamento de tecido embebido em parafina; Outro modelo e fabricante pode ser usado</td></tr><tr><td>Pelotas de cera de parafina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 76243</td><td>Para incorporação de parafina; Outro fabricante pode ser usado</td></tr><tr><td>Estação de incorporação de tecido de parafina</td><td>Leica Biosystems</td><td># EG1160</td><td>Para incorporação de tecido em parafina para posterior seccionamento; Outro modelo e fabricante pode ser usado</td></tr><tr><td>Pellet pestel, motor sem fio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># Z359971-1EA</td><td>Para homogeneização mecânica de tecido isolado antes do Western blotting; Outro fabricante pode ser usado</td></tr><tr><td>placa de Petri, 35 mm</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td># 121V</td><td>Para armazenamento de DRGs isolados; Outro fabricante e tamanho podem ser usados</td></tr><tr><td>em placa de Petri, 100 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># P7741</td><td>Para extrusão da medula espinhal; Outro fabricante e tamanho podem ser usados</td></tr><tr><td>Inibidor de fosfatase, Phosstop</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td># 04906845001</td><td>Coquetel de inibidor de fosfatase para adição ao tampão de lise TNE, se necessário; Outro fabricante pode ser usado</td></tr><tr><td>Ponta de pipeta, 1-200 &mu; L, sem filtro</td><td>Sarstedt</td><td># 70.1189.105</td><td>Para extrusão hidráulica; Outro fabricante pode ser usado</td></tr><tr><td>Inibidor de protease,</td> Complete <td>Sigma-Aldrich</td> <td># 05892791001</td><td>Coquetel de inibidor de protease para adição ao tampão de lise TNE, se necessário; Outro fabricante pode ser usado</td></tr><tr><td>solução de RNAlater</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td># R0901</td><td>Para estabilização de RNA para armazenamento; Outro fabricante pode ser usado</td></tr><tr><td>Rneasy Protect Mini KiT</td><td>Qiagen</td> <td># 74124</td><td>Para isolamento de RNA; Outro fabricante pode ser usado</td></tr><tr><td>bisturi; Lâmina cirúrgica Swann-Morton nº 11</td><td>Swann-Morton</td><td># REF0203</td><td>Para isolamento da região lombar da medula espinhal; Pode ser utilizado outro fabricante/tipo</td></tr><tr><td>Tesoura, recta, tipo 3, aresta de corte de 25 mm</td><td>Bochem</td><td># 4070</td><td>Para isolamento da coluna vertebral; Outro fabricante/tipo pode ser usado</td></tr><tr><td>Tesoura, 130 mm de ponta</td><td>Hounisen</td><td># 1902.0130</td><td>Para isolamento da medula espinhal (rato adulto)</td></tr><tr><td>Tesoura de mola, reta, 8 mm de ponta</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 15009-08</td><td>Para cortar a coluna vertebral antes do isolamento de DRGs (filhote) e para isolamento de DRGs (camundongo adulto, rato adulto, filhote); Outro fabricante pode ser usado</td></tr><tr><td>Seringas padrão, 2,5 mL, 5 mL, 10 mL</td><td>Terumo</td><td># SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1</td><td>Para extrusão hidráulica; Outro fabricante pode ser usado</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio MZ12.5 com objetiva 1X e ocular 10X</td><td>Leica</td><td># 10446370</td><td>Outro fabricante/tipo pode ser usado</td></tr><tr><td>Estéril PBS</td><td>GIBCO</td><td># 10010-015</td><td>Para extrusão hidráulica; Também pode ser feito de acordo com protocolos padrão</td></tr><tr><td>Agulha de seringa 23 G x 1", 0,6 x 25 mm</td><td>Terumo Neolus</td><td># NN-2325R</td><td>Para extrusão hidráulica em filhotes; Outro fabricante/tipo pode ser usado</td></tr><tr><td>Agulha de seringa 18 G x 1 1/2, 1,2 x 40 mm</td><td>Terumo Neolus</td><td># NN-1838S</td><td>Alternativa à ponta de pipeta para extrusão hidráulica em camundongos adultos; Outro fabricante pode ser usado</td></tr><tr><td>Tissue-Tek</td><td>Sakura</td> <td># 4583</td><td>Tssue material de incorporação para posterior crioseccionamento</td></tr><tr><td>TNE-lise tampão</td><td>produtos químicos VWR</td> <td># 10128-582</td><td>Para lise tecidual antes do Western blotting; Pode ser utilizado outro fabricante; Também pode ser feito de acordo com protocolos padrão</td></tr></tbody></table>

extrusão hidráulico da medula espinhal e isolamento de gânglios das raízes dorsais em roedores

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Tradicionalmente, a medula espinhal é isolada por laminectomia, ou seja, abrindo as vértebras da coluna vertebral uma de cada vez. Isso é demorado e pode resultar em danos à medula espinhal causados pelo processo de dissecação. Aqui, mostramos como a medula espinhal pode ser extrudada usando pressão hidráulica. O tempo de manuseio é significativamente reduzido para apenas alguns minutos, provavelmente diminuindo os danos às proteínas. O baixo risco de danos ao tecido da medula espinhal melhora a análise imuno-histoquímica subsequente. Ao realizar a extrusão hidráulica da medula espinhal em vez da laminectomia tradicional, os roedores podem ser usados para isolamento de DRG, diminuindo assim o número de animais e permitindo a análise entre os tecidos do mesmo roedor. Demonstramos um método consistente para identificar e isolar os DRGs de acordo com sua localização em relação aos costae. É, no entanto, importante ajustar este método ao animal específico utilizado, pois o número de segmentos da medula espinhal, tanto torácica quanto lombar, pode variar de acordo com o tipo de animal e a linhagem. Além disso, ilustramos outros exemplos de processamento dos tecidos isolados.

Medulas espinhais hidraulicamente extrudido apresentar uma superfície lisa sem danos mostrado na Figura 1. O alargamento lombar pode ser facilmente identificadas como a área mais espessa da medula espinal, encaixotado na Figura 1. Os lados dorsais e ventrais da espinal medula pode ser identificada a olho nu de acordo com a morfologia. Na Figura 1, o lado ventral está voltada para o observador, identificável por uma linha média clara ao longo de toda a medula espinhal. Duas linhas mais amplas ao longo da medula espinal permitir a identificação do lado dorsal. No distal mais-end, a cauda eqüina pode, por vezes permanecem ligados em ratos adultos e ratos adultos. DRGs individuais só podem ser identificados, enquanto localizado na coluna vertebral, a Figura 2. A seguir ao isolamento, A Figura 3, os DRGs individuais não podem ser identificados pela aparência. Se necessário, é, por conseguinte,importante mantê-los claramente separados no isolamento. Após o isolamento, a medula espinal e DRGs podem ser processados e corados tal como descrito no passo 7.3 e representada na Figura 4. Figura 4a mostra uma coloração imuno-histoquímica de uma seção DRG onde os neurônios e suas células gliais satélite envolvente são claramente visíveis. Pela identificação correta do DRG é possível analisar o efeito de lesões do nervo ciático na soma do neurônio ferido, bem como sobre as suas células gliais por satélite circundantes. A Figura 4b mostra uma coloração de Nissl de uma medula espinal hidraulicamente extrudido em que o tecido está intacta tal como reflectido pelas extremidades lisas da secção. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig4.jpg" /> Figura 4: cortes de tecido representativo. Uma. coloração imuno-histoquímica da secção DRG. B. Nissl manchado sectioN de medula espinal hidraulicamente extrudida. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, apresentamos um protocolo para extrusão hidráulica da medula espinhal, bem como identificação e isolamento de gânglios da raiz dorsal (DRGs) específicos no mesmo roedor. Comparado aos métodos padrão de isolamento da medula espinhal, esse método é significativamente mais rápido e reduz o risco de danos aos tecidos.

Extrusão hidráulico da medula espinhal e Isolamento de gânglios das raízes dorsais em roedores

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

O objetivo geral deste método é isolar a medula espinhal por extrusão hidráulica, bem como identificar e isolar os gânglios das raízes dorsais em camundongos e ratos. Isso é realizado primeiramente por meio da eutanásia do roedor, seguida de decapitação. A pele é cortada ao longo da coluna vertebral e separada do tecido subjacente. Em seguida, a coluna vertebral é separada do tecido circundante mediante cortes ao longo de ambos os lados da coluna vertebral na direção distal, ultrapassando o osso pélvico. Então, a coluna vertebral é cortada distalmente ao osso pélvico. Uma seringa com ponteira de pipeta adaptada é inserida na extremidade mais distal da medula espinhal.Ao aplicar pressão constante, a medula espinhal é extrudida para dentro da placa de Petri sobre gelo utilizando PBS estéril gelado. Usando tesoura de mola, a coluna vertebral é dividida longitudinalmente. Em seguida, localizam-se os pontos de fixação da costela mais distal.Isso permite a identificação dos gânglios da raiz dorsal torácicos mais distais em cada lado, denominados T13. Os gânglios da raiz dorsal subsequentes podem agora ser identificados. Os gânglios da raiz dorsal correspondentes ao alargamento medular lombar estão localizados distalmente.Usando tesoura de mola, as raízes dorsal e ventral são cortadas e os gânglios da raiz dorsal (DRGs) são cuidadosamente retirados da cavidade e transferidos para placas de Petri identificadas contendo PBS estéril sobre gelo. A extrusão hidráulica da medula espinhal é um método significativamente mais rápido do que a laminectomia tradicional, na qual as vértebras espinhais são quebradas uma a uma. Este método reduz o risco de danos teciduais provocados pelo processo de dissecação e fornece tecido adequado para uma ampla gama de análises.Os gânglios da raiz dorsal podem geralmente ser difíceis de identificar. No entanto, a identificação correta é extremamente importante para análises posteriores do tecido, por exemplo, após lesão do nervo ciático. Assim, numerando os gânglios da raiz dorsal de acordo com a localização em relação à costela, os gânglios da raiz dorsal podem ser identificados de forma consistente.Prepare uma seringa para a extrusão da medula espinhal cortando a extremidade maior de uma ponteira de pipeta sem filtro. A ponteira se encaixará firmemente quando ajustada corretamente. Aspire PBS estéril e gelado e mantenha a seringa em gelo até o uso posterior.Para roedores adultos, realizar eutanásia com gás, como CO2 ou isoflurano, seguida de decapitação. Não realizar dislocação cervical, pois isso danificará as vértebras espinhais e tornará impossível a extrusão da medula espinhal. Filhotes podem ser eutanasiados por decapitação direta.Polvilhe água sobre o pêlo para controlar os pelos soltos. Em seguida, corte a pele ao longo da coluna vertebral no sentido distal. Isole a coluna vertebral fazendo cortes em ambos os lados ao longo da coluna, passando o osso pélvico, e corte a coluna vertebral proximalmente à pelve.Retire os extremos proximal e distal da coluna vertebral para evitar que fique com formato excessivamente em S, o que pode dificultar a extrusão bem-sucedida da medula espinhal. Certifique-se de que a medula espinhal seja visível em ambas as extremidades. Se a medula espinhal não for visível, corte a coluna vertebral até que a medula espinhal fique visível.Coloque uma placa de Petri contendo PBS sobre gelo. Alinhe a coluna vertebral colocando o dedo indicador na parte curvada da extremidade proximal da coluna vertebral. Insira a ponteira da pipeta na extremidade distal da medula espinhal.Aplicar pressão constante e extrudir a medula espinhal para dentro da placa de Petri. Cortar aberta a coluna vertebral. Cortar algumas vértebras no lado ventral da coluna e, em seguida, alternar para cortar algumas vértebras no lado dorsal.Continue alternando os lados ao longo de toda a coluna vertebral. Coloque a medula espinhal aberta sob um microscópio. Identifique o segmento da vértebra T13 localizando o ponto de fixação da costela mais distal na coluna vertebral.Atenção para não confundir a costela mais distal com os nervos intercostais próximos. A costela mais distal está ligada à parte proximal do segmento da vértebra T13, e os gânglios da raiz dorsal (GRD) T13 estão localizados distalmente à vértebra T13 e proximalmente à vértebra L1. Identifique os GRD concomitantes no sentido distal. Prepare placas de Petri numeradas contendo PBS estéril gelado sobre gelo.Para evitar danos ao gânglio da raiz dorsal durante a remoção, segure as raízes dorsal e ventral, e não o próprio gânglio da raiz dorsal, com um par de pinças nº 5. Usando tesoura microcirúrgica, corte primeiro o nervo periférico, seguido pelas raízes dorsal e ventral. Em filhotes, esses nervos não são tão claramente visíveis quanto em roedores adultos.Para cortar os nervos o mais próximo possível do gânglio da raiz dorsal (DRG), deslize suavemente a ponta da tesoura ao longo do DRG para posicionar a ponta antes de realizar o corte. Usando a ponta de pinças fechadas, retire delicadamente os DRGs e transfira-os para a placa de Petri correspondente. Em ratos adultos e camundongos adultos, os DRGs são brancos, com raízes dorsal e ventral claramente visíveis, enquanto em filhotes os DRGs aparecem como esferas transparentes.Para a análise por western blot, isole o tecido de interesse e coloque o tecido em tampão de lise. Em seguida, homogeneíze o tecido, centrifugue, colete o sobrenadante e realize o western blot conforme protocolos padrão. Para análise de RNA, isole o tecido de interesse e imediatamente coloque o tecido em solução de estabilização de RNA.Em seguida, realize a qPCR de acordo com protocolos padrão. Para imunohistoquímica em tecido congelado rapidamente, prepare pó de gelo seco sobre uma folha de papel alumínio. Coloque o tecido sobre o pó de gelo seco para congelá-lo rapidamente.Em seguida, transfira o tecido para um criostato e inclua o tecido para corte. Pós-fixe o tecido em PFA 4% durante 10 minutos à temperatura ambiente e realize a coloração imunohistoquímica de acordo com protocolos padrão. Para imunohistoquímica em crioseções, fixe o tecido em PFA 4% a quatro graus e transfira o tecido para sacarose 25% peso por volume durante a noite a quatro graus.Coloque o tecido em material de inclusão e congele o tecido usando 2-metilbutano resfriado. Corte o tecido em um criostato e realize a coloração imunohistoquímica de acordo com protocolos padrão. Para imunohistoquímica em cortes de parafina, fixe o tecido em PFA 4% a quatro graus e transfira o tecido para sacarose a 25% peso por volume durante a noite a quatro graus.Incorpore o tecido em parafina, corte o tecido em um micrótomo e realize a coloração imuno-histoquímica de acordo com protocolos padrão. Dependendo dos anticorpos utilizados para a coloração imuno-histoquímica, qualquer um dos métodos exemplificados de tratamento do tecido pode ser considerado aplicável. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar a medula espinhal por extrusão hidráulica e de como identificar e isolar os gânglios da raiz dorsal de maneira consistente.Os métodos apresentados aqui são aplicáveis a camundongos e ratos de todas as idades, e o tecido isolado pode ser utilizado para uma ampla gama de análises, incluindo métodos que exigem isolamento rápido de tecido não fixado.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Estudo genético da regeneração do axônio com cultivadas Adulto neurônios do gânglio da raiz dorsal

Neste vídeo, demonstramos a extração do gânglio da raiz dorsal ou DRG de uma espinha de rato colhida para aplicações a jusante.

Colheita de DRG da Coluna de Rato: Um Procedimento para Extrair o Gânglio da Raiz Dorsal da Coluna de um Modelo de Rato

Neste vídeo, descrevemos um protocolo passo a passo para isolar a medula espinhal de um modelo de camundongo para estudos in vitro.

Extração da medula espinhal: um protocolo para isolar a medula espinhal murina para estudos in vitro

Este vídeo demonstra um procedimento para isolar neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) de embriões de ratos e co-cultivá-los com precursores de células de Schwann para gerar células de Schwann maduras. Os DRGs isolados são processados para isolar neurônios e células gliais. As células isoladas são cultivadas para purificar os neurônios, que são então co-cultivados com células semelhantes a células de Schwann (SCLCs) em um meio de co-cultura. A interação com os neurônios DRG leva à maturação...

Isolamento de neurônios DRG e cocultura com precursores de células de Schwann para gerar células de Schwann

Este vídeo apresenta um método para isolar células-tronco neurais/progenitoras do tecido periventricular da medula espinhal em ratos adultos. A técnica inclui incubar os fragmentos de tecido em uma solução contendo enzimas proteolíticas para romper a matriz extracelular e liberar as células. Posteriormente, as células liberadas são plaqueadas em um meio contendo fatores de crescimento específicos que aumentam a proliferação do tronco neural / progenitor e promovem a agregação em neuroesferas...

Isolamento de células-tronco progenitoras neurais da região periventricular da medula espinhal de um rato adulto

Este vídeo demonstra uma técnica para isolar e cultivar células dos gânglios da raiz dorsal (DRG) da coluna vertebral de ratos. Os DRGs excisados da coluna vertebral são tratados com enzimas e dissociados mecanicamente para obter uma suspensão unicelular. As células são cultivadas em um meio contendo inibidores e fatores de crescimento que limitam a proliferação de células gliais e promovem o crescimento neuronal, respectivamente.

Estabelecendo uma cultura de células de gânglios da raiz dorsal primária a partir de uma coluna vertebral de rato

A medula espinhal de mamíferos adultos contém células-tronco neurais/progenitoras (NSPCs) que podem ser isoladas e expandidas em cultura. Este protocolo descreve a coleta, isolamento, cultura e passagem de NSPCs geradas a partir da região periventricular da medula espinhal adulta do rato e de doadores de transplante de órgãos humanos.

Isolamento de Neural Stem / células progenitoras da Região Periventricular do rato adulto e Medula Espinhal Humano

Este protocolo descreve o isolamento de neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) isolados de ratos e a cultura de neurônios DRG em um sistema estático de cultura de células pré-esticadas para melhorar o alinhamento dos axônios, com subsequente co-cultura de células de Schwann (SCs) para promover a mielinização.

Uma abordagem para reforçar Alinhamento e mielinização do gânglio de raiz dorsal neurônios

Este protocolo apresenta o uso de uma injeção de gânglio da raiz dorsal (DRG) com um vetor viral e uma lesão concomitante por esmagamento da raiz dorsal em um rato adulto como modelo para estudar a regeneração sensorial do axônio. Este modelo é adequado para investigar o uso da terapia gênica para promover a regeneração sensorial do axônio.

Dorsal Root Injection gânglio da raiz dorsal e lesão por esmagamento como um modelo para Sensorial Axon Regeneração

Este protocolo fornece uma técnica para colher e cultivar gânglio da raiz dorsal (DRG) explantado de ratos Sprague Dawley adultos em um dispositivo multicompartimental (MC).

Coleta, incorporação e cultura de gânglios da raiz dorsal em dispositivos multicompartimentais para estudar características neuronais periféricas

Os gânglios da raiz dorsal (DRG) contêm corpos celulares primários de neurônios sensoriais e transmitem sinais sensoriais periféricos para a medula espinhal. Este protocolo descreve um método para dissecação por DRG de camundongos que suporta o isolamento padronizado de gânglios estruturalmente intactos, identificação segmentar anatômica, orientação intuitiva para usuários iniciantes e redução de lesão processual no tecido.

Dissecação e isolamento dos gânglios dorsais da raiz do camundongo

Aprenda a extrusão hidráulica da medula espinhal e isolamento de gânglios das raízes dorsais em roedores. Este método rápido minimiza danos teciduais e facilita estudos neurobiológicos em camundongos e ratos.

Extrusão hidráulico da medula espinhal e Isolamento de gânglios das raízes dorsais em roedores

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