Quantificação do comportamento de higienização da Drosophila

O objetivo geral deste método é medir o comportamento de limpeza de Drosophila quantificando e comparando o resíduo de corante amarelo brilhante colorido no corpo dos animais em condições de limpeza e ausência de limpeza. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neurobiologia e genética comportamental, como a coordenação de habilidades locomotoras finas e os reguladores moleculares e circuitos associados. A principal vantagem desta técnica é que ela é rápida, robusta e fácil de ser realizada por diversos pesquisadores e estudantes com diferentes níveis de habilidade.

Demonstrará este procedimento Frankie Barradale, um aluno do meu laboratório. Para iniciar o experimento, prepare um aspirador para transferir Drosophila vivos de um frasco de cultura para a câmara de higiene. Com uma tesoura, corte 1,5 pés de tubo de Tygon.

Corte pelo menos um centímetro da ponta de uma ponteira descartável de micropipeta de um mililitro e segure o pedaço quadrado de malha de um centímetro de lado sobre a abertura de 196 polegadas da ponteira cortada. Encaixe firmemente uma ponteira nova de micropipeta de um mililitro sobre a malha e a ponteira cortada para criar uma câmara de contenção para as moscas. Corte a ponta extrema da nova ponteira de micropipeta para alargar a abertura o suficiente para permitir a passagem de uma única mosca.

O orifício terá aproximadamente o tamanho da abertura da câmara de preparo. Encaixe firmemente as ponteiras encaixadas na extremidade do tubo de Tygon. Empurre as ponteiras para dentro do tubo para garantir um encaixe apertado, permitindo a pressão de vácuo.

Na outra extremidade do tubo, corte a ponta de uma ponteira de micropipeta de 200 mililitros e encaixe a extremidade cortada estreita no tubo para formar o lado bucal do aspirador. Para preparar os tubos com alíquotas de pó, pese cinco miligramas de corante amarelo brilhante em papel de pesagem. Despeje o pó em um tubo de microcentrífuga de 8 mililitros e feche firmemente a tampa.

Em seguida, para preparar os tubos de etanol, pipete um mililitro de etanol a 100% em tubos microcentrífugos de 15 mililitros. Rotule os tubos, tampe-os e guarde-os para a conclusão do ensaio de toilete. Inclua também pelo menos uma amostra em branco contendo apenas um mililitro de etanol sem mosca, para controles negativos.

Monte cada câmara de asseio parafusando a placa superior deslizante com os orifícios menores, mantendo a placa inferior com os orifícios maiores removida para a adição da poeira. Posicione cada câmara de asseio necessária sobre uma mesa com a face superior voltada para baixo. Carregue cinco miligramas de alíquota de corante amarelo brilhante em cada câmara, batendo o tubo contra a superfície da câmara acima do poço desejado.

Toque a câmara contra a mesa para garantir que toda a poeira caia através da malha até o topo da placa. Em seguida, parafuse a placa inferior em cada câmara, de modo que as extremidades mais largas das aberturas cônicas fiquem voltadas para fora e os orifícios não fiquem sobre os poços. Fixe firmemente a placa inferior, para que ela não deslize e libere o corante.

Virar a câmara e bater com ela contra a mesa algumas vezes para que a poeira passe pela malha e se deposite na placa inferior. Deslizar a placa superior da câmara para as posições abertas, de modo que os pequenos orifícios fiquem alinhados com os 15 poços, permitindo a introdução das moscas nos poços individuais. Carregar uma mosca no aspirador bucal sugando suavemente por uma das extremidades do aspirador, como se estivesse usando um canudo.

Deposite as moscas soprando levemente e direcionando a abertura em direção ao alvo. Após carregar um poço, deslize a placa superior de modo que a mosca fique presa na câmara e coloque fita sobre a abertura do poço durante o carregamento da câmara completa, para evitar a fuga da mosca enquanto os outros poços são carregados. Se múltiplas moscas forem aspiradas para um único poço, mantenha essa abertura descoberta até que apenas uma mosca permaneça.

Após todos os poços necessários serem preenchidos com moscas, vire a câmara de modo que a placa inferior fique voltada para cima e a poeira possa revestir as moscas ao cair através da malha. Fixe firmemente as placas superior e inferior apertando os parafusos e vortexe a câmara por quatro segundos para espalhar a poeira sobre as moscas. Bata com a câmara, com a placa superior voltada para baixo, contra a mesa duas vezes, para que o corante caia pelo outro lado.

Em seguida, vire a câmara, com a placa superior voltada para cima, e bata na câmara duas vezes para garantir que o corante se deposite no fundo da câmara inferior, longe da mosca, mantida na câmara superior. Para as moscas controle, que não têm permissão para se lamber, prossiga imediatamente para o preparo da amostra. Coloque a câmara plana sobre a mesa ou bancada, com a placa superior voltada para cima, por 30 minutos, para permitir que as moscas se limem.

Coloque a câmara em um local livre de ruídos e vibrações, para manter o ambiente constante em todos os experimentos de alisamento. Mantendo a câmara nivelada com a placa superior voltada para cima, desparafuse suavemente a placa inferior e remova-a da câmara, tomando cuidado para não perder nenhum corante. Coloque a câmara sobre uma placa de CO₂ com fluxo de ar baixo até que as moscas fiquem anestesiadas.

Desrosqueie a placa superior da câmara, use cuidadosamente uma pinça para segurar uma perna e remover uma mosca pulverizada de cada câmara, colocando-a em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro contendo etanol. Após cada tubo microcentrífugo conter uma mosca, feche a tampa e inverta os tubos três vezes para agitar e misturar a solução de corante e etanol. Incube os tubos contendo etanol e moscas por cinco horas à temperatura ambiente para garantir a remoção completa do corante da mosca para a solução.

Após cinco horas, vorte cada tubo brevemente por dois segundos para garantir a remoção dos corantes das moscas. Aliquotar 50 microlitros do tubo experimental de 1,5 mililitro em um poço de uma placa de 96 poços, anotando a localização de cada amostra na placa. Adicionar 200 microlitros de etanol para diluir a amostra cinco vezes, evitando efeitos de selamento causados por moscas excessivamente empoeiradas ou grandes defeitos de alisamento.

Utilize um leitor de placas para analisar cada amostra em 397 nanômetros. Registre a amostra por meio do leitor de placas e salve a planilha com as amostras registradas na placa. Utilizamos este método para estudar o DopR comparando o desempenho de alisamento de um hipomorfo forte e de mutantes nulos do DopR com uma linhagem selvagem.

Os mutantes DopR retiveram significativamente mais corante do que os respectivos tipos selvagens ou complementados, indicando que os mutantes DopR foram menos eficientes no comportamento de alisamento. Em um experimento paralelo com moscas Rutabaga, os mutantes exibiram níveis mais altos de acúmulo de corante do que os mutantes DopR, sugerindo um papel significativo do DopR no comportamento de alisamento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como manipular moscas para ensaios comportamentais e também de como medir o comportamento de alisamento.