Name: Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) espermatozoides: recolha, criopreservação e heterólogo fertilização In Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprenda a coletar, criopreservar e realizar fertilização heteróloga in vitro de espermatozoides de golfinho Tursiops truncatus usando oócitos bovinos. Este método avalia a funcionalidade do esperma criopreservado.

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seu trabalho foi financiado pelo Ministério da economia e competitividade (AGL2015-70140-R a D. Rizos), AGL2015-66145R A. Gutierrez-Adan e J. F. Pérez-Gutiérrez e Seneca Fundação de Murcia (Grant 20040/GERM/16 para F. García-Vázquez) espanhol

declaração de ética: todos os procedimentos experimentais foram revistos e aprovados pelo Comitê de uso do Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA) e institucionais Cuidado Animal. Todos os experimentos foram realizados de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório, tal como adoptadas pela sociedade para o estudo da reprodução e para o Animal Welfare Act para cuidar dos mamíferos marinhos.
 1. coleção de esperma de golfinho e criopreservação <ol><li>preparação <ol><li>fazer FERT médio (heparina e hypotaurine-livre). Preparar suplementado FERT-TALP com bicarbonato de 25mm, lactato de sódio 22mm, piruvato de sódio 1 mM, 6 mg/mL ácido graxo livre BSA e heparina 10 mg/mL (pH 7,4). 
		Nota: Preparar este meio no dia do uso e mantê-lo a 38,5 ° C, sob uma atmosfera de 5% de CO 2 e no ar com umidade máxima pelo menos 2 h antes do uso.</li>
		<li>Preparar ovo gema com base em tampão TRIS. Dissolver 30,28 g/L Tris, 16,75 g/L ácido cítrico, frutose 12,5 g/L e estreptomicina 0,5 g/L em água ultrapura (pH 7.3, osmolalidade = 310 mOsm/kg). Adicione a gema de ovo de 20% (v/v).</li>
	</ol></li> <li>Treinar um golfinho masculino reprodução comprovada para deitar em decúbito dorsal, perto da borda da piscina para coleta de sêmen voluntário. 
	Nota: O golfinho masculino deve ser treinado mais de 6 meses pelo reforço positivo, conforme descrito anteriormente 4.</li>
	<li>Executar várias estimulações táteis pressionando suavemente na área craniana do sulco genital do golfinho para eliciar voluntária da extrusão do pênis do sulco genital.</li>
	<li>Depois de alcançar uma ereção completa, direcionar a ponta do pênis em um recipiente estéril para obter a ejaculação.</li>
	<li>Manter a amostra de esperma a 37 ° C, até a análise. Repita as etapas de 1.3 e 1.4 para coleções de ejacular sucessivas, usando um vidro de propileno de novo cada vez que.</li>
	<li>Imediatamente após a colheita, determinar o volume usando um cilindro de vidro graduado, previamente aquecido a 37 ° C. avaliar a cor, pH e osmolaridade (usando um microaparelhos) do ejaculate.</li>
	<li>Para avaliar a concentração de espermatozoides na ejaculação, adicionar 10 µ l de suspensão de esperma para um tubo eppendorf contendo 90 µ l de água destilada. Determinar a concentração de espermatozoides, usando um esperma contagem câmara. 
	Nota: Durante a avaliação, manter o resto da ejaculação em 37 ° C.</li>
	<li>Avaliar os parâmetros de motilidade.
	<ol><li>Tomar 10 µ l da amostra de esperma e colocá-lo em uma câmara de esperma pré-aquecido.</li>
		<li>Avaliar a motilidade usando um sistema de análise de esperma assistida por computador, previamente validado para o golfinho, para avaliar objetivamente a motilidade de espermatozoides 2. 
		Nota: Se necessário, dilua a amostra de esperma com meio FERT (heparina e hypotaurine-livre) para a visualização adequada da motilidade do esperma. Durante a avaliação, manter a amostra a 37 ° C em um palco de microscópio aquecida.</li>
	</ol></li> <li>Dar 20 µ l de amostra de esperma e avaliar a viabilidade e esperma morfologia como descrito anteriormente 5.</li>
	<li>Transferir a amostra de esperma para um tubo de centrifugação. Centrifugar a amostra de esperma a 250 x g por 5 min. Após determinar a concentração de espermatozoides, utilizando uma câmara de contagem, ajustar a concentração de esperma para 400 x 10 6 espermatozoides/mL. 
	Nota: Se necessário, dilua a pelota de ejacula a concentrado com plasma seminal isolado de um volume em excesso da ejaculação mesmo por centrifugação (250 x g, 10 min).
	<ol><li>Ao longo de 5 min, lentamente diluído o esperma da amostra 1:1 (v/v) com um ovo gema com base em tampão TRIS contendo 1,5% de glicerol. Colocar o tubo contendo a suspensão de esperma a 5 ° C, durante 1 h 30 min.</li>
		<li>Realizar uma segunda diluição da suspensão de esperma com um TRIS egg buffer de gema contendo glicerol para obter uma concentração final de glicerol de 3% e uma concentração final de 200 x 10 6 espermatozoides/mL. Manter a suspensão de esperma a 5 ° C por 10 min.</li>
	</ol></li> <li>Carregar a suspensão de esperma em palhetas de 0,25 mL. Soldadura térmica o palitinho. Lugar, as palhas em um rack de 4,5 cm acima do nitrogênio líquido durante 10 min. mergulham o nitrogênio líquido o palitinho e armazenam até avaliação.</li>
</ol> 2. Heteróloga In Vitro fertilização usando Zona intacta oócitos bovinos <ol><li>preparação <ol><li>preparar a coloração de uma solução e o meio de montagem.
		<ol><li>Hoechst preparar solução dissolvendo-se 1 mg de Hoechst em 1 mL de água destilada. Faça 30 alíquotas µ l e mantê-los no escuro a-20 º C até o uso. Prepare a solução de coloração adicionando 25 µ l de solução-mãe de Hoechst a 5 mL de tampão fosfato salino (PBS) suplementado com 1 g/L de PVA. Misture bem e deixe no escuro a 4 ° C até o uso.</li>
			Meio de montagem de <li>preparar misturando 6,25 mL de PBS com 6,25 mL de glicerol e 6,25 µ l de solução-mãe de Hoechst. Misture bem e deixe no escuro a 4 ° C até o uso.</li>
		</ol></li> <li>Prepare o suporte para a fertilização de coleção e in vitro de oócitos.
		<ol><li>Preparar solução salina 0,9% NaCl destilada água adicionando 0,5 mL de gentamicina.</li>
			<li>Preparar o meio de maturação das ações adicionando 10 ng/mL fator de crescimento epidérmico (EGF) e 10% de soro fetal bezerro (FCS) para 10 mL de TCM-199. Manter ambos os meios a 38,5 ° C, sob uma atmosfera de 5% de CO 2 e no ar com umidade máxima pelo menos 2 h antes do uso.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Coletar os ovários no matadouro em solução salina a 33-35 ° C e transportá-los para o laboratório dentro de 4 h de coleção.</li>
	<li>Uma vez no laboratório, lave os ovários três vezes para remover os escombros e sangue utilizando solução salina, previamente aquecida a 37 ° C. manter os ovários em solução salina a 37 ° C durante o processo.</li>
	<li>Aspirado de folículos de 2 a 8 mm com 18G de um agulha e uma seringa de 10 mL. Recolher o líquido folicular aspirado em tubos de 50 mL.</li>
	<li>Permitem que o fluido folicular que contêm os oócitos repousar durante cerca de 15 min a 37 ° C, até que o sedimento de células. Remover o sobrenadante do tubo com uma pipeta Pasteur e ressuspender o sedimento em PBS.</li>
	<li>Recuperar os complexos cumulus-oócito (COCs) em pratos 90mm sob um estereomicroscópio.</li>
	<li>Lavar o COCs três vezes em PBS e uma vez no meio de maturação.</li>
	<li>Transferência COCs morfologicamente normal para poço de 4 pratos, cada um bem contendo 500 mL do meio de maturação, em grupos de 50 COCs por alvéolo. 
	Nota: Aqui, três poços &#8211; um poço para fertilização in vitro heteróloga, um controle bem para fertilização in vitro homólogo e aquele bem que contém apenas amadureceu COCs como um controle partenogenéticas &#8211; foram usados.</li>
	<li>Incubar o COCs por 24 h a 38,5 ° C, sob uma atmosfera de 5% de CO 2 e no ar com umidade máxima.</li>
	<li>Preparar o meio e o gradiente de densidade.
	<ol><li>Para preparar meio de fertilização (FERT), suplemento médio FERT-TALP com bicarbonato de 25mm, lactato de sódio de 22 mM, piruvato de sódio 1 mM, 6 mg/mL ácido graxo livre BSA e heparina 10 mg/mL. Manter a 38,5 ° C, sob uma atmosfera de 5% de CO 2 e no ar com umidade máxima pelo menos 2 h antes do uso.</li>
		<li>Preparar o gradiente de densidade, adicionando 1 mL de meio de gradiente de densidade para um tubo de 15 mL e 3 mL de solução para um tubo de 15 mL de lavagem. Mantê-las a 38,5 ° C, durante pelo menos 1 h.</li>
	</ol></li> <li>Lavar o em vitro amadureceu oócitos duas vezes no meio de FERT.</li>
	<li>Transferir os oócitos para poço de 4 pratos, cada um contendo bem 50 COCs em 250 mL de FERT. Manter os pratos 4-bem a 38,5 ° C, sob uma atmosfera de 5% de CO 2 e no ar com umidade máxima enquanto se prepara o esperma para fertilização.</li>
	<li>Descongelar uma palha congelada contendo espermatozoides golfinho em banho-maria a 37 ° C por 50 s. 
	Nota: Sémen de bovino para a fertilização in vitro homólogo deve ser processado em paralelo, seguindo o protocolo padrão para FIV bovina homóloga.</li>
	<li>Tomar 10 µ l do esperma da amostra e coloque-o em um esperma previamente aquecido contando a câmara. Avalie a motilidade usando um sistema de análise de esperma assistida por computador, previamente validado para a espécie, para avaliar objetivamente a mobilidade do esperma. Durante este tempo, manter a amostra de esperma em 38,5 ° C.</li>
	<li>Adicionar a amostra de esperma ao tubo gradiente de densidade (etapa 2.10.2). Centrifugar durante 10 minutos a 250 g. x</li>
	<li>Remover cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta Pasteur. Adicione 3 mL de solução de lavagem para o tubo contendo a pelota. Ressuspender o sedimento, misturando delicadamente.</li>
	<li>Centrifugar durante 5 min à 250 g. x remover o sobrenadante com uma pipeta Pasteur para um volume de esperma de 300 µ l.</li>
	<li>Adicionar 5 µ l de suspensão de esperma para microcentrifuga contendo 95 µ l de água destilada. Manter a suspensão de esperma 38,5 ° C. Fill a contagem de células de câmara com 10 µ l da 01:20 diluição de esperma e medida a concentração. Calcular a quantidade de meio FERT que deve ser adicionado a 100 µ l do esperma para obter 2 x 10 6 espermatozoides/mL.</li>
	<li>Adicionar o volume calculado de FERT e esperma para um tubo de 15 mL e misture suavemente com uma pipeta Pasteur.</li>
	<li>Adicionar 250 µ l de suspensão de esperma-FERT a cada poço do poço 4 prato contendo o meio de FERT com oócitos amadurecidos para obter uma concentração final de 1 x 10 6 espermatozoides/mL.</li>
	<li>Co incubar os gâmetas por 18 h a 38,5 ° C, sob uma atmosfera de 5% de CO 2 e no ar com umidade máxima.</li>
	<li>Preparar o meio de cultura que baseia o fluido sintético ovidutária suplementado com 5% de FCS. Prepare 25 µ l de gotículas de cultura fluido ovidutária sintético nos pratos 35mm cobertas com 3 mL de óleo mineral. Manter a 38,5 ° C, sob uma atmosfera de 5% de CO 2 e no ar com umidade máxima pelo menos 2 h antes do uso.</li>
	<li>Em incubação co do post 2,5 h, retire o prato 20 oócitos; manter os oócitos restantes na incubadora nas mesmas condições.
	<ol><li>Remover os espermatozoides vagamente anexados pipetando vigorosamente metade dos oócitos através de uma pipeta de Pasteur estreito-calibre 10 vezes.</li>
		<li>Corrigir 20 oócitos em 50 µ l de 0,5% de glutaraldeído por 30 min. lavagem de oócitos em PBS durante 5 min. Transfira os oócitos de 50 µ l de solução de coloração Hoechst por 15 min e lave os oócitos em PBS durante 5 min.</li>
		<li>Transferência de oócitos individualmente para 2 gotas de µ l de meio de montagem a uma taxa de 10 ovócitos por slide. Delicadamente, cobrir com uma lamela e selar com esmaltes.</li>
		<li>Contar o número de espermatozoides anexado para os oócitos bovinos usando um microscópio de contraste de fase, equipado com ótica epifluorescente e um filtro de excitação 361 nm na ampliação de 40 x.</li>
	</ol></li> <li>Após 12 h de incubação co, retire os pratos 4-bem 10 presuntivas zigotos; manter zigotos presuntivas restantes na incubadora nas mesmas condições.
	<ol><li>Transferência a 10 zigotos presuntivas para uma centrífuga de 15 mL tubo contendo 2 mL de PBS e vórtice suavemente durante 2 min para remover as células do cumulus. Lave duas vezes em PBS, correção e mancha, conforme descrito anteriormente (passo 2.23.2.)</li>
	</ol></li> <li>Depois de 18, 20, 22 e 24 h de incubação co, removem 10 zigotos presuntivas do poço 4 pratos e vórtice, corrigir e manchá-las conforme descrito anteriormente (etapa 2.23.2). Manter o resto de zigotos presuntivas na incubadora nas mesmas condições.
	<ol><li>Avaliar a formação pró-nuclear e poliespermia sob um microscópio de epifluorescente/fase-contraste em ambos os grupos homólogos e heterólogos FIV pela coloração com Hoechst.</li>
		<li>Avaliar pró-nuclear formação em 10 zigotos híbrido presuntivo escolhidos aleatoriamente por amostra. Confirmar a formação pró-nuclear sob um microscópio na excitação do laser de argônio 488 nm e 515 para 530 nm deteção de exploração do laser confocal.</li>
		<li>Opticamente seção zigotos presuntivas sequencialmente (2 mm) e coletar imagens usando um software de imagem. Visualizar usando um pacote de software de análise 3D.</li>
		<li>Após 24 h de incubação co, lavar 50 zigotos presuntivas quatro vezes em PBS e duas vezes em meio de cultura.</li>
	</ol></li> <li>Transferi-los em grupos de 25 para microdroplets do meio de cultura previamente preparado e incubado.</li>
	<li>Manter a 38,5 ° C, sob uma atmosfera de 5% O 2 / 5% de CO 2 e no ar com umidade máxima.</li>
	<li>Após 26 e 28 h de incubação co, retire os pratos e vórtice, fix 10 zigotos presuntivas e manchá-las, como descrito anteriormente (etapa 2.23.2).</li>
	<li>Após 48 h de cultura, observar a clivagem sob um estereomicroscópio.</li>
	<li>Remover a zona pelúcida (ZP) ao transferir os embriões para uma solução de protease de 5 mg/mL.</li>
	<li>Lavar individualmente cada embrião três vezes em PBS. Snap-congele-os em nitrogênio líquido em tubos de microcentrifuga de 0,2 mL. Armazená-los a-80 ° C até análise.</li>
</ol> 3. PCR <ol><li>materiais e reagentes Nota: os reagentes, materiais e equipamentos utilizados para executar o protocolo PCR são detalhadas na tabela de materiais e incluir uma cremalheira do tubo do PCR e um conjunto de micropipetas (P2, P20, P200, P1000), 1,5 mL microcentrifuge tubos, tubos PCR e bonés, um termociclador, um iluminador UV, gel de agarose e tampão (Tris borato EDTA (TBE)).
	<ol><li>Suavemente descongelar todos os reagentes no gelo. Mantê-los no gelo durante todo o experimento. Use deoxynucleotides (dNTPs; dATP, dCTP, dTTP e dGTP), alvo de cartilhas sobre a referência gene que codifica para a proteína ribosomal de S de golfinho 18 (DQ404537.1); R1: TTGGACACACCCACGGTGCGG e F2: CAGAAGGACGTGAAGGATGGA), DNA polimerase, 5 X buffer, para a DNA-polimerase, DNA modelo, água estéril e cloreto de magnésio (MgCl 2 em uma concentração final de 5, 0mm).</li>
		Preparação de gel e amostra de <li>Agarose.
		<ol><li>DNA, esperma de golfinho e bovina preparar amostras.
			S. <ol><li>thaw um canudo congelado de cada espécie em banho-maria a 37 ° C por 50 adicionar 3 mL de solução de lavagem. Centrifugar a 250 x g por 10 min. Retire o sobrenadante. Adicionar 30 µ l de tampão de Lise STES (50 mM Tris-HCl, pH 8; 20 mM NaCl; e SDS 0,1% de 1 mM), 2 µ l de proteinase K (20 mg/mL) e 5 µ l de ditiotreitol (DTT); concentração final: 150 mM. Manter-se durante a noite a 55 ° C. Adicionar 200 µ l membros de água ultrapura. Centrifugar a 250 x g por 5 min. manter o sobrenadante. Medir a concentração de DNA usando um spectrophotometer.</li>
			</ol></li> <li>Realizar diluições em série do DNA de espermatozoides de golfinho (ou seja, 40, 4 e 0,4 ng/mL) com água ultrapura para verificar que as condições PCR são capazes de detectar uma pequena quantidade de golfinho DNA.</li>
			<li>Realizar diluições em série de esperma bovina DNA (isto é, 4.000, 400, 40 e 4 ng/mL) com água ultrapura para verificar que as condições PCR são capazes de detectar uma pequena quantidade de DNA bovino.</li>
			<li>Preparar os embriões de golfinhos e bovina. Descongele os embriões no gelo. Adicione 8 µ l de proteinase de µ g/mL 100 K e manter-se durante a noite a 55 ° C. Para parar a reação, coloque as amostras a 96 ° C por 5 min.</li>
			<li>Preparar amortecedor TBE de gel de agarose 2% e adicionar 20 µ l de ácido nucleico mancha usando as técnicas padrão.</li>
		</ol></li> <li>Preparação de PCR.
		<ol><li>Tubos de PCR de rótulo: diluições em série dos golfinhos (40, 4 e 0,4 ng/mL), as diluições de série bovina (4.000, 400, 40 e 4 ng/mL), homóloga bovina embrião de duas câmaras, duas câmaras presuntivas heterólogos embriões e controle negativo.</li>
			<li>Prepare uma mistura de mestre em um tubo estéril microcentrifuga de 1,5 mL para um volume final de 25 µ l por reação.
			<ol><li>Adicionar 5 µ l debuffer 5 X DNA polimerase flexi, 0,5 µ l de dNTPs (10 mM) 1,5 µ l de MgCl 2 (25 mM), 0,5 µ l de frente e verso da primeira demão (10 µM), 1,5 µ l do molde de ADN (esperma) ou 8 µ l do molde de ADN (embriões de duas câmaras) , 0,07 µ l da Taq polimerase e estéril destilada água até um volume final de 25 µ l. Misture bem.</li>
			</ol></li></ol></li></ol></li> <li>Protocolo de amplificação <ol><li>Coloque os tubos no termociclador. Selecione o programa a seguir: 94 ° C por 3 min; 40 ciclos de 94 ° C por 15 s, 59 ° C para 25 s, 72 ° C por 20 s; e 72 ° C por 5 min. iniciar o programa.</li>
		<li>Armazenar os tubos em 4 ° C. adicionar 2,5 μL, de carregando buffer para cada produto PCR em 4 ° C e carga 15 µ l da mistura nos poços do gel do agarose 2%. Use um marcador de escada de DNA para a estimativa do tamanho exato de fragmentos do PCR.</li>
		<li>Executar eletroforese por 15 min permitir a migração do DNA. Visualizado bandas usando um iluminador UV.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Para muitas espécies diferentes de mamíferos, existem diversas vantagens em usar o esperma congelado-descongelar. Estes incluem a capacidade de transferir material genético valioso, o potencial para distribuição em todo o mundo, o baixo risco de contaminação e a capacidade de preservar os gametas masculinos por décadas. O uso de espermatozoides criopreservados é essencial para o golfinho, porque esta espécie está protegida sob o apêndice II da CITES, que limita o transporte e o intercâmbio de animais entre diferentes par...

Tecnologias de reprodução assistida estão pouco desenvolvidas em animais selvagens, incluindo os mamíferos marinhos. A falta de métodos sensíveis para avaliar o sucesso de fertilização esperma contribui para o desenvolvimento de tecnologias de reprodução de espécies como o golfinho. Não era até recentemente que os parâmetros básicos seminais do golfinho-roaz (Tursiops truncatus) foram relatados1,2. No entanto, variáveis, tais como a motilidade e morfologia, embora amplamente utilizado, dar informações limitadas sobre a eficiência reprodutiva. O melhor indicador da qualidade do esperma é a avaliação do potencial de fertilização.
Recentemente, nosso grupo usou um método para avaliar esperma de golfinho fertilizando potencial, avaliando a formação pró-nuclear masculina e/ou formação de embrião híbrido depois da fertilização in vitro heteróloga usando oócitos bovinos intactos de zona3. O uso de fertilização in vitro heterólogo golfinho-bovinos tem vantagens importantes sobre fertilização in vitro homóloga, como ele supera a dificuldade de obtenção de oócitos de golfinho e facilita o uso do bem testado em vitro sistemas de maturação de ovócitos bovinos. Para evitar a especificidade da espécie, fecundação heteróloga é executada geralmente na ausência de ZP. Embora permite a avaliação da capacidade dos espermatozoides com acrossoma-reagiu se fundem com a membrana vitelínico, reduzes a avaliação de outras características relacionadas à fertilização. O procedimento descrito usa a zona de oócitos intacta e permite a avaliação dos seguintes parâmetros: vinculação de zona de esperma e fixação, penetração, poliespermia, formação pró-nuclear e clivagem de embriões híbridos.
Aqui, apresentamos vários protocolos para coleta de esperma, esperma básico análise, congelamento de espermatozoides, bem como a avaliação da funcionalidade do esperma de golfinho, avaliando a formação de embrião pró-nuclear e/ou híbrido masculina após a fertilização in vitro heteróloga usando zona intacta oócitos bovinos.

<table><tbody><tr><td>FERT-TALP médio</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCM-199</td><td>Sigma</td><td>M-4530</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>B-2261</td><td></td></tr><tr><td>Pratos de 4 poços</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Gradiente de densidade BoviPure</td><td>Nidacon International</td><td>BP-100</td><td></td></tr><tr><td>Solução de lavagem Boviwash</td><td>Nidacon International</td><td>BW-100</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Promega</td><td>A35 1H</td><td></td></tr><tr><td>Água estéril</td><td>Mili Q sintesis A10 Millipore</td><td>A35 1H</td><td></td></tr><tr><td>Buffer Tris Borato EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>MB agarose</td><td>Biotools</td><td>20.012</td><td></td></tr><tr><td>5X GoTaq flexi buffer</td><td>Mili Q sintesis A10 Millipore</td><td>M 890 A</td><td></td></tr><tr><td>MB agarose</td><td>Biotools</td><td>20.012</td><td></td></tr><tr><td>Taq polimerase</td><td>Promega</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SafeView</td><td>NBS Biologicals Ltd.</td><td>M 890 A</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de contagem Makler</td><td>Câmara Sefi Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thoma</td><td>Hecht-Assistant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pHmeter MicropH 2000</td><td>Crison Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osmômetro Micro osmômetro avançado 3300</td><td>Norwood</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de análise de esperma assistido por computador</td><td>Projectes y Serveis I+D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio MZ 95</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Óptica epifluorescente Eclipse Te300</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de assistente confocal 4.02</td><td>Software de</td> análise <td></td><td>Bio-Rad 3D</td></tr><tr><td>Microscopia confocal de varredura a laser</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropippetes (P2. P20, P200, P1000)</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iluminador UV</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Termociclador Primus 96 Plus</td><td>MWG AG Biotech</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bottlenose dolphin (tursiops truncatus) espermatozoides: recolha, criopreservação e heterólogo fertilização in vitro

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization

O uso de espermatozoides criopreservados golfinho facilita a troca de material genético entre parques aquáticos e torna espermatozoides acessível aos laboratórios para estudos aprofundar nossa compreensão da reprodução de mamíferos marinhos. Fertilização in vitro heterólogo, um substituto para fertilização in vitro homólogo, poderia fornecer um meio para testar a fertilidade do esperma potencial; para estudar a fisiologia de gametas e desenvolvimento precoce do embrião; e para evitar o uso de oócitos valioso golfinho, que são difíceis de obter. Aqui, apresentamos os protocolos que têm sido utilizados com sucesso para recolher e cryopreserve espermatozoides de golfinho. A colheita de sémen é executada pela estimulação manual sobre golfinhos treinados. Criopreservação é realizada usando um extensor de gema de ovo com base TRIS com glicerol. Além disso, apresentamos um protocolo que descreve a fertilização in vitro heterólogo usando espermatozoides golfinho e oócitos bovinos e que verifica a natureza híbrida do embrião resultante usando PCR. Fertilização heteróloga gera perguntas sobre fertilização e pode ser usada como uma ferramenta para estudar a fisiologia de gametas e desenvolvimento precoce do embrião. Além disso, o sucesso da fertilização in vitro heterólogo demonstra o potencial desta técnica para testar o esperma de golfinho fertilizando a capacidade, o que vale a pena o exame adicional.

Todos os resultados, tabelas e figuras (1 e 2) aqui apresentadas foram reproduzidas com permissão3.
Espermatozoides de golfinho tem alta mobilidade após congelação e descongelação
A golfinho congelado-descongelar ejacula mostrou percentagens (% ± DP) de 84.5 ± 5,3 total motile e 69,1 ± 5,1 espermatozoides móveis progressivos. Em termos de mobilidad...

Aqui, apresentamos os protocolos que foram usados com sucesso para a coleta de espermatozoides de golfinho, criopreservação e desempenho de fertilização in vitro heterólogo usando oócitos bovinos.

Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) espermatozoides: recolha, criopreservação e heterólogo fertilização In Vitro

The use of cryopreserved dolphin spermatozoa facilitates the exchange of genetic material between aquatic parks and makes spermatozoa accessible to ...

O objetivo geral desta técnica é avaliar a funcionalidade do esperma de golfinho criopreservado por meio da fertilização heteróloga in vitro, utilizando espermatozoides de golfinho criopreservados e óvulos bovinos com zona pelúcida intacta. Neste vídeo, mostraremos como coletar, avaliar e criopreservar espermatozoides de golfinho. Em seguida, avaliaremos a interação e a penetração espermática até a zona pelúcida.Formação do pronúcleo masculino e clivagem do embrião híbrido. Um ponto crítico no desenvolvimento das tecnologias de reprodução assistida é a avaliação da função espermática, que é melhor indicada pela sua capacidade de fertilizar. Técnicas homólogas de FIV são comumente utilizadas para a avaliação da função espermática, mas a obtenção de ovócitos de golfinho é muito difícil.A principal vantagem da fertilização in vitro heteróloga é sua simplicidade. Os óocitos bovinos são facilmente obtidos e podem ser processados in vitro por meio de protocolos bem testados. Também demonstraremos como criopreservar espermatozoides de golfinho utilizando vapores de nitrogênio líquido.Uma técnica simples que não requer equipamento de congelamento altamente especializado. Para este procedimento, o golfinho macho deve ser previamente treinado por seis meses utilizando reforço positivo. Deixe o animal deitar em decúbito dorsal próximo à borda da piscina.Realizam-se várias estimulações táteis mediante pressão suave na região cranial do sulco genital para provocar a extrusão voluntária do pênis. Após alcançar uma ereção completa, direciona-se a ponta do pênis para um recipiente estéril. Mantém-se o ejaculado a 37 graus Celsius até a análise.Quando necessário, repita a estimulação tátil para coletas sucessivas de ejaculado, utilizando um novo tubo de polipropileno a cada vez. Imediatamente após a coleta, avalie os ejaculados, mantendo-os a 37 graus Celsius durante todo o processo. Determine o volume, cor, pH e osmolaridade dos ejaculados.Em seguida, a partir de uma alíquota de 10 microlitros, determine a concentração de espermatozoides em uma câmara de contagem. Coloque o ejaculado em uma lâmina sobre uma platina aquecida do microscópio a 37 graus Celsius. Utilizando um sistema de análise assistida por computador, avalie a motilidade dos espermatozoides.Se necessário, dilua o esperma com meio de fecundação para facilitar a visualização. Em seguida, utilizando uma alíquota de 20 microlitros do ejaculado, avalie a viabilidade e a morfologia dos espermatozoides por meio de coloração convencional com Eosina Nigrosina e Spermac. Para criopreservação, transfira primeiro a amostra de esperma para um tubo de centrífuga.Em seguida, pelote o esperma a 250 G durante cinco minutos. Agora, ao longo de cinco minutos, faça lentamente uma diluição 1:1 da amostra de esperma com tampão à base de gema de ovo com traços contendo 1,5% de glicerol. Em seguida, resfrie a amostra a 5% Celsius por 1,5 hora.Uma hora depois, repita a diluição 1:1 com o mesmo tampão e, em seguida, mantenha a suspensão de espermatozoides a cinco graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, carregue a suspensão em palhetas de 0,25 mililitro e feche-as com selagem térmica. Coloque as palhetas em um suporte e suspenda o suporte a 4,5 centímetros acima do nitrogênio líquido por 10 minutos.Em seguida, mergulhe as palhetas no nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo. Para este protocolo, utilize ovários de bovino mantidos em solução salina aquecida, coletados nas últimas três horas. Inicie lavando os ovários três vezes com solução salina.Mantendo-os sempre a 37 graus Celsius. Em seguida, aspire todos os folículos de dois milímetros a oito milímetros utilizando uma agulha de calibre 18 e uma seringa. Transfira para um tubo de 50 mililitros e deixe os ovócitos sedimentarem por 15 minutos.Em seguida, remova o sobrenadante e re-suspenda os folículos em PBS. Recupere os COCs sob um microscópio estereoscópico em placas de 90 milímetros. Selecione os óvulos de grau um e dois, que apresentam citoplasma homogêneo e são cercados por pelo menos três camadas de células do cumulus.Transfira esses ovócitos para PBS em uma placa de 35 milímetros. Em seguida, lave os COCs três vezes em PBS e uma vez em meio de maturação. Então, distribua os COCs em placas de quatro poços, com 50 COCs e 500 mililitros de meio de maturação por poço, e incube os COCs por 24 horas.Uma vez que os ovócitos apresentem células do cumulus expandidas, eles estão maduros. Em seguida, lave-os duas vezes em meio de fertilização e transfira-os para placas de quatro poços em grupos de 50, com 250 mililitros de meio de fertilização por poço. Agora, retorne os COCs ao incubador e prepare o esperma para fertilização.Encha uma palheta congelada contendo espermatozoides de golfinho e uma palheta contendo espermatozoides de bovino em banho-maria a 37 °C durante 50 segundos. Em seguida, avalie subjetivamente a motilidade utilizando microscópio de contraste de fase. A seguir, transfira a amostra de sêmen para um tubo de gradiente de densidade e centrifugue por 10 minutos a 250 ×g. Remova cuidadosamente o sobrenadante.E adicione novamente três mililitros da solução de lavagem. Em seguida, re-suspenda os espermatozoides com mistura suave. Agora, centrifugue o tubo novamente e remova a maior parte do sobrenadante, deixando os espermatozoides em 300 microlitros.Agora conte os espermatozoides e ajuste a concentração para dois milhões por mililitro, diluídos com meio de fecundação. Adicione 250 microlitros da suspensão a cada poço de ovócitos para obter uma concentração final de espermatozoides de um milhão por mililitro. Sob um microscópio estereoscópico, observe os ovócitos maduros expandidos cercados por espermatozoides móveis de bovino ou de golfinho, sendo os espermatozoides de golfinho menores que os de bovino.Coincubar os gametas por 18 horas. Para avaliar a interação dos espermatozoides com a zona pelúcida, retire 20 ovócitos do recipiente 2,5 horas após a coincubação. Remova os espermatozoides fracamente aderidos pipetando vigorosamente através de uma pipeta de Pasteur de pequeno orifício.Em seguida, fixe e marque os ovócitos com ganchos para 3342. Transfira os ovócitos marcados individualmente para gotas de dois microlitros de meio de montagem e conte o número de espermatozoides aderidos aos ovócitos utilizando um microscópio de contraste de fase. A partir de 18 horas de coinubação, transfira os 10 zigotos presumíveis para um tubo cônico de 15 mililitros contendo dois mililitros de PBS e vortexie suavemente por três minutos para remover as células do cumulus.Lave duas vezes em PBS e fixe e marque conforme descrito anteriormente. Adicionalmente, após 18 horas de coincubação, colete 50 zigotos para cultivo. Vortexie-os em PBS por três minutos e, em seguida, lave-os duas vezes em PBS.Após lavar os zigotos selecionados com citoplasma homogêneo para cultivo, transfira-os em grupos de 25 para gotas de 25 microlitros de fluido sintético do oviduto suplementado com 5% de soro fetal bovino. Em seguida, cultive os zigotos presumíveis por 48 horas e avalie sua taxa de clivagem utilizando um microscópio estereoscópico.Posteriormente, avalie mais detalhadamente sua composição genética por PCR, conforme o protocolo descrito no texto. Os espermatozoides de ejaculados de golfinhos descongelados apresentavam cerca de 85% de motilidade e 70% de motilidade progressiva. Esses valores são representativos de espermatozoides criopreservados de alta qualidade.Os espermatozoides de golfinho aderiram à zona pelúcida bovina após 2,5 horas de coinubação em uma porcentagem maior do que os espermatozoides bovinos. Os espermatozoides de golfinho foram capazes de penetrar os óvulos bovinos com zona pelúcida intacta, levando à formação de pronúcleos e clivagem. No grupo de fertilização in vitro heteróloga, não foi observada poliespermia.A formação de pronúcleos atingiu a porcentagem mais alta em 24 horas. A formação de pronúcleos foi mais rápida no grupo homólogo. A taxa de clivagem em 48 horas foi menor nas fertilizações heterólogas do que nas fertilizações homólogas.A PCR confirmou a presença de material genético de golfinho nos embriões híbridos. Foram testados primers para o gene da ribossomo 18 s de golfinho, resultando em um produto de 190 pares de bases. As linhas de um a 30 são híbridos de golfinho e bovino.Os controles foram DNA de golfinho nas linhas S e dois embriões bovinos celulares nas linhas C. O protocolo apresentado para fertilização in vitro autóloga demonstrou que golfinhos-botenas são capazes de fertilizar ócitos bovinos intactos, resultando em embriões híbridos.O aperfeiçoamento e a otimização adicionais dessa técnica facilitarão a avaliação da funcionalidade do espermatozoide de golfinho. A criopreservação de espermatozoides de golfinho utilizando vapores de nitrogênio líquido é um método rápido, simples e de baixo custo que proporciona bons parâmetros de motilidade progressiva e permite a fertilização in vitro heteróloga com sucesso. A observação de que os espermatozoides de golfinho são capazes de fertilizar óvulos bovinos abre um novo campo de pesquisa sobre a reprodução do golfinho e de outros animais marinhos.Levanta também questões sobre os mecanismos da fertilização que permanecem amplamente sem resposta.

bottlenose-dolphin-tursiops-truncatus-spermatozoa-collection

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Neste vídeo-artigo apresentamos uma demonstração passo-a-passo sobre como coletar e criopreservar oócitos de hamster com altas taxas de sobrevivência pós-descongelamento. O mesmo procedimento também pode ser aplicado com sucesso congelar e descongelar embriões de camundongos em diferentes estágios de desenvolvimento pré-implantação.

Recolha e criopreservação de óvulos e embriões de camundongos Hamster

Este é um high-throughput protocolo de criopreservação de esperma para zebrafish. Espermatozóides criopreservados utilizando este protocolo tem uma média de fertilidade de 25% na fertilização in vitro subseqüentes e é estável durante muitos anos.

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Aqui demonstramos a recém-desenvolvida I • kit Cryo para mouse criopreservação de esperma. Duas células desenvolvimento embrionário palco com descongelado esperma foi melhorado consistentemente em cinco linhagens de camundongos com a utilização deste kit. Durante um período de 1,5 anos, 49 linhas de camundongos geneticamente modificados foram arquivados por criopreservação de espermatozóides com a Cryo kit • I e mais tarde recuperados com sucesso por fertilização in vitro.

Criopreservação do mouse Sperm and Recovery utilizando o I · Cryo Kit

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Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) espermatozoides: recolha, criopreservação e heterólogo fertilização In Vitro

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