Name: Caracterização biofísica das funções Flagellar motor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Aprenda a medir a rotação de micropartículas ligadas a motores flagelares em células bacterianas vivas usando E. coli. Este método de rastreamento em tempo real permite estudar a mecanobiologia e o comportamento de motores moleculares com alta precisão.

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Os autores agradecem a Howard Berg pelo presente do microscópio de rastreamento de contas / fotomultiplicadores e à Texas A & M Engineering Experiment Station pelos fundos.

1. Preparação de células <ol><li> Crescer culturas de uma noite da estirpe desejada carregando a fliC pegajoso alelo 15,22 em Caldo de triptona (TB, 1% de peptona, 0,5% de NaCl), seguida de inoculação a diluição 1: 100 em 10 mL de TB fresco. Crescer a cultura a 33 ° C numa incubadora agitadora até DO600 = 0,5. </li><li> Agregar as células a 1500 xg durante 5-7 minutos e re-dispersar vigorosamente o sedimento em 10 mL de tampão de filtro esterilizado motilidade (MB; 10 mM de tampão de fosfato: 0,05-0,06 M de NaCl, 10 -4 M de EDTA, 1 | iM de metionina, pH 7,0). </li><li> Repita o passo 1.2 mais duas vezes e re-dispersar o sedimento final em 1 ml MB. </li><li> Cisalhamento da suspensão, passando para trás e para a frente ~ 75 vezes entre duas seringas com 21 a 23 adaptadores calibre ligados por tubos de polietileno (7 - 12 cm de comprimento, diâmetro 0,58 mm interno). Limitar o tempo total para corte de 30 - 45 s. </li><li> Centrifugar as células cortadas a 1.500 g durante 5-7 minutos e voltar a dispersar apelete em 100 - 500 mL de MB. </li></ol> 2. Deslize Preparação <ol><li> Preparar uma câmara de imagem imprensando duas fitas adesivas de dupla face entre um cover-derrapante e uma lâmina de microscópio. Para ensaios de quimiotaxia, empregar qualquer câmara de microfluidos que permite a troca de MB e estimulantes químicos. </li><li> Adicionar solução de 0,01% de poli-L-lisina na câmara e depois de 5 min lave as superfícies com MB (80-100 mL). </li><li> Adicionar 40 ul de suspensão de células para dentro da câmara e permitir tempo suficiente para a ligação à superfície do vidro (7-8 min). Fluxo de Saída células unstuck pela adição de 100 uL MB de um lado da câmara, enquanto wicking a solução com um papel de filtro a partir do outro lado. </li><li> Adicionam-se 10 - 15? L de esferas de látex para dentro da câmara e permitir que as esferas de tempo suficiente para se estabelecer e anexar as células (7-8 min). Lave com 100 ul de MB, tal como descrito na etapa 2.3, para remover descolar grânulos. Use uma gama de talão-sizes para as experiências tanto tempo como um bom contraste está disponível. </li></ol> 3. Acompanhamento Bead <ol><li> Colocar a amostra em um estágio do microscópio e digitalizar a superfície para grânulos ligados a motores. Utilize uma objectiva de 40x fase para fazer observações, embora microscopia de fase não é necessário. Alternativamente, empregam imagem de campo brilhante, desde que contraste suficiente é mantida a distinguir claramente um grânulo brilhante sobre um fundo escuro. </li><li> Uma vez que um grânulo tenha sido seleccionado, mover a fase lateralmente para posicionar o grânulo em um canto pré-determinado, como mostrado na Figura 1B. grânulos posição na mesma curva para garantir que o sentido de rotação do grânulo é correctamente conhecido. A trajetória talão ideal é aproximadamente circular, mas trajetórias elípticas são admissíveis. </li><li> Manter a frequência de amostragem mais elevada do que duas vezes a frequência de rotação do motor para evitar erros associados com serrilhado. Neste trabalho, utilizar um motor que foi rotativo a50 Hz e a amostra a frequências que eram 10 vezes mais elevada (500 Hz), para obter um sinal bom. </li></ol> Análise 4. Dados <ol><li> Centro e escalar as tensões de saída PMT e elipticidade correta nas trajetórias com transformações afins, se necessário 23. Use uma análise de poder de espectro para determinar as taxas de rotação 17. </li><li> Determinar ângulos polares, θ (t) = atan (y (t) / x (t)). Determinar as variações de velocidades do motor e mudar ao longo do tempo por meio do cálculo ω <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/55240/55240eq1.jpg" /> 14. </li><li> Empregar um filtro de mediana para alisar os dados de velocidade do motor. Uma janela de filtro de mais de duas rotações completas é recomendado 23,24. </li></ol>

<ol><li>Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+factors+of+uropathogenic+Echerichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Antimicrob.+Ag%22%5BJournal%5D)">Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli.</a> Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).</li>
<li>Lane, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+motility+in+the+colonization+of+uropathogenic+Escherichia+coli+in+the+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract.</a> Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).</li>
<li>Kao, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+interplay+among+bacterial+motility+and+virulence+factors+in+different+Escherichia+coli+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).</li>
<li>Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rotary+motor+of+bacterial+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The rotary motor of bacterial flagella.</a> Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).</li>
<li>McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+Dynamometer+Controls+Swarmer+Cell+Differentiation+of+V.+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus.</a> Cell. 54 (3), 345-351 (1988).</li>
<li>Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+mechanosensing+in+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).</li>
<li>Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+sensing+in+Vibrio+parahaemolyticus+triggers+a+programme+of+gene+expression+that+promotes+colonization+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence.</a> Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).</li>
<li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).</li>
<li>Belas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%2C+flagella%2C+and+mechanosensing+of+surfaces+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria.</a> Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).</li>
<li>Silverman, M., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+rotation+and+the+mechanism+of+bacterial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility.</a> Nature. 249, 73-74 (1974).</li>
<li>Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+Kinetics+in+Bacterial+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Adaptation Kinetics in Bacterial Chemotaxis.</a> J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).</li>
<li>Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+comparisons+in+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Temporal comparisons in bacterial chemotaxis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).</li>
<li>Blair, D. F., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+torque+in+defective+flagellar+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Restoration of torque in defective flagellar motors.</a> Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).</li>
<li>Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-generating+units+of+the+flagellar+motor+of+Escherchia+coli+have+a+high+duty+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio.</a> Nature. 403, 444-447 (2000).</li>
<li>Yuan, J., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resurrection+of+the+flagellar+rotary+motor+near+zero+load%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).</li>
<li>Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+of+the+bacterial+flagellar+motor+near+zero+load%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Switching of the bacterial flagellar motor near zero load.</a> J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).</li>
<li>Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-speed+Relationship+of+the+Na%2B-driven+Flagellar+Motor+of+Vibrio+alginolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus.</a> J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).</li>
<li>Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-speed+relationship+of+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).</li>
<li>Meacci, G., Tu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+bacterial+flagellar+motor+with+multiple+stators%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).</li>
<li>Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flagellar+motor+of+Caulobacter+crescentus+generates+more+torque+when+a+cell+swims+backwards%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Phys%22%5BJournal%5D)">The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards.</a> Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).</li>
<li>Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+thresholds+in+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Response thresholds in bacterial chemotaxis.</a> Sci Adv. 1 (9), e1500299(2015).</li>
<li>Berg, H. C., Turner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque+Generated+by+the+Flagellar+Motor+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli.</a> Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).</li>
<li>Bai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Spread+as+a+Mechanism+for+Cooperativity+in+the+Bacterial+Flagellar+Switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch.</a> Science. 327, 685-689 (2010).</li>
<li>Reid, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maximum+number+of+torque-generating+units+in+the+flagellar+motor+of+Escherichia+coli+is+at+least+11%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).</li>
<li>Chen, X., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-Speed+Relationship+of+the+Flagellar+Rotary+Motor+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli.</a> Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).</li>
<li>Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+switching+of+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor.</a> Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A fim de facilitar tethered talão de rastreamento e estimativa correcta do motor-torques, as seguintes informações devem ser revistos. Ao realizar essas medições com células flageladas, corte é um passo crítico. Cisalhamento reduz o filamento flagelar a um mero topo, assegurando desse modo que a carga no motor viscoso é predominantemente devido ao cordão e pode ser estimado dentro de erro de 10% 16. Shearing também melhora as chances de encontrar trajetórias circulares com excentricidades bem distribuídos (&l...

motores flagelares permitir que as células para nadar girando filamentos extracelulares helicoidais. A quantidade de torque do motor pode gerar para um dado comprimento do flagelo (isto é, a carga viscosa) determina as velocidades de natação. Por outro lado, a sua capacidade de mudar o sentido de rotação controla a migração celular em resposta a produtos químicos, um processo conhecido como quimiotaxia. Quimiotaxia e motilidade sendo fatores de virulência 1-3, motores flagelares foram bem caracterizado ao longo dos anos 4. Evidências crescentes agora sugere que o motor actua como um mechanosensor - lo mecanicamente detecta a presença de substratos sólidos 5,6. Esta capacidade provável ajuda no desencadeamento de colonização superfície e infecções 5,7. Como resultado, os mecanismos pelos quais o motor sentidos superfícies e iniciados de sinalização são de importância 8,9. O motor flagelar pode ser facilmente estudado por amarrar o flagellhum a um substrato e observando a rotação celular. Esta operação foi primeiramente alcançada por Silverman e Simon, que trabalhou com um mutante polyhook em E. coli e ganchos ligados com sucesso para substratos de vidro com anticorpos anti-gancho 10. O ensaio de célula tethered permitiu aos investigadores a estudar as respostas de o interruptor do motor a uma variedade de estímulos químicos. Por exemplo, Segall e co-trabalhadores quimicamente estimulado células conectada com o auxílio de pipetas iontoforéticos. As alterações correspondentes no viés CW (a fração dos motores tempo de rotação no sentido horário, CW) lhes permitiu medir a cinética de adaptação na rede quimiotaxia 11,12. Enquanto o ensaio de células tethered foi eficaz em estudar respostas de switch, ele só foi capaz de oferecer insights sobre a mecânica do motor através de uma gama limitada de cargas viscosos 13. Para ultrapassar este problema, Ryu e colaboradores tethered esféricas, esferas de látex de filamento topos sobre as células presas às superfícies. Os grânulos eramentão rastreados usando interferometria de back-focal com fracos armadilhas ópticas 14. Ao trabalhar com contas de diferentes tamanhos, os pesquisadores poderiam estudar o motor ao longo de uma gama muito maior de cargas. Este ensaio foi posteriormente melhorado por Yuan e Berg, que desenvolveu uma técnica de talão-de rastreamento baseado photomultiplier combinada com iluminação a laser de campo escuro. Seu método de rastreamento habilitado de nanobeads tethered de ouro que foram tão pequena (~ 60 nm) que as resistências viscosos externos foram menores em comparação com as resistências viscosos internos para rotação 15,16. Isto conduziu às medições das velocidades máxima alcançável em E. coli (~ 300 Hz). Em V. alginolyticus, ensaios talão semelhantes permitiu medições das taxas de fiação em cargas intermédias viscosos (~ 700 Hz) 17. Ao permitir que as medições de respostas motoras ao longo de toda a gama possível de cargas viscoso (a partir de zero a carga de quase-box), os ensaios de Bead-forneceu uma ferramenta importante para compreender a biofísica tprocesso orque geração 18,19. Recentemente, nós modificamos o ensaio Yuan-Berg para incluir pinças ópticas que nos permitiram aplicar estímulos mecânicos precisos para motores individuais 6. Usando esta técnica, nós mostramos que a força-geradores que giram o motor são mechanosensors dinâmicos - eles remodelar em resposta às mudanças nas cargas viscosos. É possível que tal sensor de carga provoca a diferenciação de células em bactérias enxame, embora os mecanismos permanecem obscuros. Também é provável que os motores flagelares em outras espécies também são mechanosensitive 20, apesar de evidência directa que falta. Aqui, discutimos a abordagem baseada em fotomultiplicador (PMT) para acompanhar a rotação de esferas de látex amarrados a filamentos de flagelar 15. Em comparação com o acompanhamento com câmeras ultra-rápidos, o fotomultiplicador-setup é vantajoso porque é relativamente simples para rastrear esferas individuais em tempo real e mais longa durações. É particularmente útil quando se estuda a longo tempo remodelação em complexos motor flagelar devido a estímulos do meio ambiente 21. Embora nós detalhe protocolos específicos para E. coli, que pode ser facilmente adaptado para estudar motores flagelares em outras espécies.

<table><tbody><tr><td>Solução de poli-L-lisina (0,1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Polybead Microspheres</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>7307</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Seringa de Ponta Deslizante Luer de 1 mL</td><td>Exel Int.</td><td>26048</td><td>http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php</td></tr><tr><td>Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>427565</td><td>http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp</td></tr><tr><td>Tubulação de Polietileno</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-8325</td><td>http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html</td></tr><tr><td>Fotomultiplicador Tubos</td><td>Hamamatsu</td><td>R7400U-20</td><td>Faixa de resposta espectral de 300 a 920 nm, Comprimento de onda máximo de 630 nm,&nbsp; Tempo de resposta de 0,78 ns&nbsp; http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html</td></tr><tr><td>3 x 1 mm fendas de precisão</td><td>Edmund Optics</td><td>NT39-908</td><td>2 fendas montadas em ângulos retos entre si em tubos fotomultiplicadores</td></tr><tr><td>Osciloscópio</td><td>Tektronix</td><td>TBS 1032B</td><td>Marcas alternativas são aceitáveis. Osciloscópio Digital, Série TBS 1000B, 2 Analógicos, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts&nbsp; http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope</td></tr><tr><td>Filtro LP/HP de 8 Polos</td><td>Krohn-Hite</td><td>3384</td><td>Marcas alternativas são aceitáveis. Recomenda-se uma faixa de frequência de 0,1 Hz a 200 kHz.&nbsp; &nbsp; &nbsp; http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf</td></tr><tr><td>Microscópio Optiphot</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>Qualquer microscópio de fase vertical ou invertida pode ser usado. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754</td></tr><tr><td>50:50 (R:T) Divisor de feixe de cubo</td><td>ThorLabs</td><td>BS013</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterização biofísica das funções flagellar motor

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

O papel dos motores flagelares na motilidade bacteriana e na quimiotaxia é bem compreendido. Descobertas recentes sugerem que os motores flagelares são capazes de se remodelar em resposta a uma variedade de estímulos ambientais e estão entre os gatilhos para colonização superficial e infecções. Os mecanismos precisos pelos quais os motores remodelam e promovem a adaptação celular provavelmente dependem dos principais atributos motores. A técnica de rastreamento de esferas baseada em fotomultiplicador apresentada aqui permite a caracterização biofísica precisa das funções motoras, incluindo adaptações nas velocidades do motor e na dinâmica do interruptor. Essa abordagem oferece a vantagem do rastreamento em tempo real e a capacidade de sondar o comportamento motor por longos períodos. Os protocolos discutidos podem ser prontamente estendidos para estudar motores flagelares em uma variedade de espécies bacterianas.

A configuração do fotomultiplicador é mostrado na Figura 1A. É importante que os PMTs ter alta sensibilidade ao longo do intervalo de comprimentos de onda dispersa pelas esferas de interesse. Os PMTs empregadas aqui operam nas faixas visíveis e do infravermelho próximo, e foram capazes de detectar a luz dispersa pelas esferas iluminadas por uma fonte de luz halógena. As condições de iluminação ideais e tensões de alimentação irá variar de uma instalação para outra. Para ...

Descobertas recentes sugerem que os motores flagelares bacterianos detectam uma variedade de sinais ambientais e se remodelam em resposta. Espera-se que os ensaios de contas discutidos aqui ajudem a explicar o papel da remodelação na adaptação celular aos estressores ambientais.

Caracterização biofísica das funções Flagellar motor

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

O objetivo geral deste procedimento experimental é medir a rotação de microesferas marcadoras ligadas a motores flagelares individuais em células bacterianas vivas. A técnica que descreveremos oferece a vantagem do rastreamento em tempo real das respostas do motor e da capacidade de discriminar entre dados admissíveis e inadmissíveis em tempo real. A abordagem está nos ajudando a responder perguntas fundamentais na área da mecanobiologia e a descobrir a física subjacente ao comportamento dos motores moleculares.Embora empreguemos predominantemente essas técnicas para estudar motores flagelares em E.coli, esses protocolos podem ser facilmente adaptados para estudar motores em outras espécies de bactérias flageladas. Incube culturas durante a noite da linhagem desejada, portadora do alelo sticky fliC, em TB. No dia seguinte, inóculo 10 mililitros de TB fresco em uma diluição de 1:100. Incube a cultura a 33 graus Celsius em um incubador com agitação até que a densidade óptica em 600 nanômetros atinja 0,5.Pelotize as células a 1500 vezes G durante cinco a sete minutos. Em seguida, redispersa-se vigorosamente o pellet em 10 mililitros de tampão de motilidade filtrado e esterilizado. Repita a centrifugação e a ressuspensão mais duas vezes.Redispersar o pellet final em um mililitro de MB. Cisalhar a suspensão passando-a de um lado para o outro aproximadamente 75 vezes entre duas seringas com adaptadores de 21 a 23 gauge conectados por tubo de polietileno. Limitar o tempo total de cisalhamento a 30 a 45 segundos. Após a centrifugação das células cisalhadas, redispersar o pellet em 100 a 500 microlitros de MB. Preparar uma câmara de imagem colocando duas fitas adesivas dupla face entre uma lamínula e uma lâmina de microscópio.Adicione solução de poli-L-lisina a 0,01% na câmara e, após cinco minutos, enxágue suavemente as superfícies com MB. Adicione 40 microlitros da suspensão celular na câmara e deixe tempo suficiente para a adesão à superfície de vidro. Remova as células não aderidas adicionando 100 microlitros de MB em um lado da câmara, enquanto absorve a solução com papel de filtro do outro lado. Em seguida, adicione 10 a 15 microlitros de microesferas de látex na câmara.Utilize uma variedade de tamanhos de microesferas para os experimentos que resultem em um bom contraste. Deixe as microesferas com tempo adequado para sedimentarem e se ligarem às células. Enxágue suavemente as microesferas com 100 microlitros de MB para remover as microesferas soltas.Coloque a amostra sobre a platina do microscópio e examine a superfície em busca de microesferas ligadas aos motores. Utilize imagem em campo claro com uma objetiva de 60X, desde que o contraste seja suficiente para distinguir claramente uma microesfera brilhante sobre um fundo escuro. Após a seleção de uma microesfera, mova a platina lateralmente para posicionar a microesfera em um canto previamente determinado.Posicione as esferas no mesmo canto para garantir que a direção de rotação da esfera seja corretamente conhecida. Mantenha a frequência de amostragem superior a duas vezes a frequência de rotação do motor para evitar erros associados ao aliasing. Neste trabalho, foram utilizadas frequências de amostragem 10 vezes maiores para observar um motor girando a 50 hertz.Se, após a ligação, as microesferas parecerem oscilar com uma excentricidade maior que uma a duas vezes o raio da microesfera, recomenda-se cisalhar as células um número maior de vezes. É mostrada aqui uma comparação visual entre uma microesfera adequadamente ligada e uma microesfera não ligada. As saídas dos dois fotomultiplicadores, amostradas a 500 hertz, são representadas ao longo de um pequeno período da medição.As saídas filtradas dos PMTs, após centralização e escalonamento, foram utilizadas para reconstruir as trajetórias circulares da esfera em rotação, conforme mostrado aqui. A trajetória ideal da esfera é aproximadamente circular, mas trajetórias elípticas são aceitáveis. As velocidades angulares calculadas a partir das trajetórias da esfera para um único motor são representadas em uma janela de três segundos.As transições repetidas do motor entre as direções de rotação anti-horária e horária são indicadas por alternâncias entre valores positivos e negativos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como rastrear esferas ligadas a motores flagelares individuais com alta precisão, utilizando as técnicas baseadas em fotomultiplicadores apresentadas aqui. O motor flagelar bacteriano apresenta um conjunto único de desafios porque é capaz de girar em velocidades de várias centenas de hertz.O rastreamento com alta precisão de microesferas ligadas a motores moleculares facilitou a caracterização de diversos tipos de motores, incluindo quinesinas, miosinas e F1-ATPase. A extensão da técnica de ligação por microesferas a motores flagelares permitiu aos pesquisadores estudar a mecânica dos motores com uma precisão sem precedentes. A demonstração visual deste método ajudará pesquisadores que desejam utilizar esta técnica a superar desafios, como localizar adequadamente microesferas ligadas a motores individuais.Espera-se que os métodos demonstrados aqui permitam o desenvolvimento de novas perspectivas sobre a adaptabilidade dessas nanomáquinas em diversas espécies bacterianas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O transporte intracelular de cargas, como vesículas ou organelas, é realizado por proteínas motoras moleculares que rastreiam microtúbulos polarizados. Este protocolo descreve a correlação da direcionalidade do transporte de partículas de carga individuais que se movem dentro dos neurônios, com a quantidade relativa e o tipo de proteínas motoras associadas.

Caracterizar a composição de motores moleculares sobre Movimentação axonal Carga Utilizando Análise &quot;Mapeamento Cargo&quot;

O objetivo deste protocolo é formar conjuntos de motores moleculares em nanoestruturas de DNA origami e observar a motilidade do conjunto usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total.

Produção de conjuntos de motor de dynein e de Kinesin em nanostructures do ADN origami para a única observação da molécula

Muitas bactérias usam motilidade impulsionada por flagela para navegar em seu ambiente e colonizar ambientes favoráveis tanto individualmente quanto como coletivos. Demonstrado aqui é o uso de três métodos estabelecidos que exploram a motilidade como ferramenta de seleção para identificar componentes/caminhos que contribuem para a natação e a motilidade.

Investigando a Motilidade Impulsionada por Flagella em Escherichia coli aplicando três técnicas estabelecidas em uma série

Apresentado aqui é um procedimento para expressar e purificar a minodã 5a seguida de uma discussão de sua caracterização, usando ensaios baseados em microscopia de fluorescência in vitro, e como esses métodos podem ser modificados para a caracterização da minosina não-musculo 2b.

Adaptações específicas de miose de ensaios de motilidade baseados em microscopia de fluorescência in vitro

Apresenta-se aqui um protocolo abrangente para a realização de experimentos ultrarrápidos de pinça de força em motores processivos de miosina-5, que poderia ser facilmente estendido para o estudo de outras classes de motores processivos. O protocolo detalha todas as etapas necessárias, desde a instalação do aparato experimental até a preparação da amostra, aquisição e análise dos dados.

Dissecando as propriedades mecanoenzimáticas de miosinas processivas com espectroscopia de força-braçadeira ultrarrápida

Aqui, descrevemos a construção de mutantes nulos de Aeromonas em glicosyltransferases específicas ou regiões contendo glicosyltransferases, os ensaios de motilidade e a purificação de flagela realizadas para estabelecer o envolvimento e função de suas enzimas codificadas na biossíntese de um glicano, bem como o papel deste glicano em patógenos bacterianos.

Geração de Mutantes Nulos para Elucidar o Papel das Glicosyltransferases Bacterianas na Motilidade Bacteriana

A cinesinismo mitostática bi-direcional-5 Cin8 acumula-se em aglomerados que se dividem e se fundem durante sua motilidade. O acúmulo em clusters também altera a velocidade e a direcionalidade do Cin8. Aqui, é descrito um protocolo de ensaios de motilidade com Cin8-GFP purificado e análise de propriedades motile de moléculas únicas e aglomerados de Cin8.

Motilidade de Moléculas Únicas e Aglomerados de Kinesin-5 Cin8 Bidiso

A formação de feixes de actomiosina in vitro e a medição da geração de força do conjunto de miosina usando pinças ópticas são apresentadas e discutidas.

Sondando a mecânica do conjunto de miosina em feixes de filamentos de actina usando pinças ópticas

Aqui, apresentamos um protocolo para reconstituir feixes de microtúbulos in vitro e quantificar diretamente as forças exercidas dentro deles usando aprisionamento óptico simultâneo e microscopia de fluorescência de reflexão interna total. Este ensaio permite a medição em nível de nanoescala das forças e deslocamentos gerados por conjuntos de proteínas dentro de redes ativas de microtúbulos.

Forças de Medição Direta Dentro de Feixes de Microtúbulos Ativos Reconstituídos

Este estudo detalha a purificação do KIF1A(1-393LZ), membro da família das cinesinas-3, utilizando o sistema de expressão do Sf9-baculovírus. A análise in vitro de deslizamento de molécula única e multimotor desses motores purificados exibiu propriedades de motilidade robustas comparáveis aos motores do lisado de células de mamíferos. Assim, o sistema Sf9-baculovírus é passível de expressar e purificar a proteína motora de interesse.

Análise de molécula única de motores da família Sf9 superprocessiva superprocessiva cinesina-3

Este protocolo detalha os procedimentos para produzir recombinantemente a holoenzima miosina-7a humana usando o sistema MultiBac Baculovirus e para estudar sua motilidade usando um ensaio de deslizamento de filamento in vitro personalizado.

Purificação baseada no sistema MultiBac e caracterização biofísica da miosina-7a humana

Aprenda a medir a rotação de micropartículas ligadas a motores flagelares em células bacterianas vivas usando E. coli. Este método de rastreamento em tempo real permite estudar a mecanobiologia e o comportamento de motores moleculares com alta precisão.

Caracterização biofísica das funções Flagellar motor

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