Reprogramação condicional de células Pediátrica Humano esofágico epiteliais para uso em Engenharia de Tecidos e Doença de Investigação

O objetivo geral deste procedimento é expandir células epiteliais esofágicas derivadas de biópsias endoscópicas de pacientes para estudar doenças esofágicas ou para criar um suporte esofágico tridimensional para modelagem posterior ou substituição do tecido esofágico. Este método pode ser utilizado para melhor compreender o papel das células epiteliais esofágicas nas doenças esofágicas. Elas também podem ser usadas para gerar suportes tridimensionais para modelagem ou implantação.

A vantagem desta técnica é que ela nos permite gerar células epiteliais específicas do paciente a partir de um fragmento muito pequeno de tecido, sem a necessidade de modificações genéticas ou permanentes. As implicações desta técnica estendem-se para a compreensão da patogênese da esofagite eosinofílica, bem como para o desenvolvimento de tratamentos para atresia esofágica e esofagite eosinofílica. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica terão dificuldade em remover completamente as células de suporte antes da coleta das células epiteliais esofágicas humanas, a fim de manter a pureza.

Demonstrará esta técnica Christopher Foster, um técnico do nosso laboratório. Pelo menos três dias antes da obtenção das amostras dos pacientes, plaque as células 3T3 em meio de cultura 3T3 em frascos T75 tratados para tecidos. No dia do experimento, logo antes da obtenção das amostras, desprenda as células 3T3 com 5 mililitros de Tripsina-EDTA 0,25% por frasco durante cerca de cinco minutos a 37 graus Celsius.

Quando a maioria das células estiverem em suspensão, adicione 5 mililitros de meio 3T3 para interromper a reação e transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação. Re-suspenda o pellet no meio para contagem. Em seguida, transfira o número apropriado de células para semeadura para um tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, adicione 25 mililitros de meio fresco 3T3 às células para irradiação em 3000 rads. Então, colete as células por centrifugação e re-suspenda o pellet em meio de programação condicional a cinco mililitros por placa de 100 milímetros. Após obter aproximadamente seis biópsias esofágicas no momento da endoscopia, coloque seis biópsias em um tubo cônico de 15 mililitros contendo meio de queratinócito completo sem soro, suplementado com Primocin em gelo úmido.

Coloque uma biópsia em cinco mililitros de formalina tamponada sobre gelo úmido e coloque outra biópsia em um pequeno molde criogênico contendo meio de inclusão. Mergulhe imediatamente o molde em um béquer com gelo ou pentano dentro de um recipiente com nitrogênio líquido. Assim que o tecido estiver congelado, coloque o molde criogênico em um saco amostral sobre gelo seco, dentro de um recipiente de isopor.

Em seguida, coloque os tubos com as biópsias dentro de um saco fechável, dentro de uma caixa de transporte com gelo úmido e rótulo de risco biológico, e feche e rotule ambos os recipientes com adesivo de risco biológico para transporte ao laboratório. Ao entrar no laboratório, transfira imediatamente a biópsia congelada para um armazenamento a menos 80 graus Celsius para cortes posteriores ou extração de RNA. Coloque a amostra em formalina em um refrigerador a quatro graus Celsius para fixação durante a noite e coloque as demais biópsias na centrífuga.

Substitua o meio em cada tubo por 10 mililitros de solução de dispase e feche os tubos para uma incubação de 15 minutos a 37 graus Celsius em banho-maria. Ao final da incubação, centrifugue novamente as biópsias e re-suspenda as amostras em cinco mililitros de tripsina-EDTA 0,25%. Transfira as biópsias para uma única placa estéril de 100 mililitros e utilize duas lâminas esterilizadas para picar os tecidos o mais finamente possível.

Quando todo o tecido tiver sido cortado, transfira os fragmentos de tecido para um novo tubo de 15 mililitros e lave a placa duas vezes com cinco mililitros de tripsina-EDTA 0,05%. Reúna as lavagens no tubo e retorne as amostras a um banho-maria a 37 graus Celsius. Após 10 minutos, centrifugue os fragmentos de tecido digeridos e as células alimentadoras e re-suspenda os pellets em cinco mililitros de meio de reprogramação condicional, cada um.

Em seguida, combine as amostras do biópsia do alimentador e do esôfago em um único tubo e adicione o inibidor de rho quinase, ou inibidor ROCK, às células para seu cultivo conjunto em uma placa de cultura de tecidos revestida com gelatina. Após aproximadamente cinco dias, remova o meio e os fragmentos de biópsia picados por aspiração e enxágue a placa duas a três vezes com cinco mililitros de PBS estéril. Após a última lavagem, adicione 10 mililitros de meio fresco suplementado com inibidor ROCK à placa e retorne o cultivo conjunto ao incubador até que as células atinjam 70% de confluência.

Para expandir as células, remova as células alimentadoras com cinco mililitros de tripsina-EDTA 0,05% a 37 graus Celsius por não mais de dois minutos e meio. Enxágue a placa com cinco mililitros de PBS fresco para remover as células alimentadoras em suspensão e adicione cinco mililitros de tripsina-EDTA 0,25% para uma incubação de cinco a 10 minutos até que as células da amostra de biópsia se soltem do fundo da placa. Em seguida, interrompa a reação com 10 mililitros de meio fresco e transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros para centrifugação.

Re-suspenda o pellet em meio de reprogramação condicional fresco para contagem e, agora, transfira uma vez 10 à sexta potência de células esofágicas humanas para um novo tubo cônico. Adicione 1,2 vezes 10 à sexta potência de células 3T3 irradiadas às células esofágicas e complete o volume total no tubo para 15 mililitros com meio de reprogramação condicional fresco. Em seguida, adicione inibidor de ROCK fresco às células e plaque a co-cultura em uma placa de 150 milímetros revestida com gelatina.

Para congelar as células esofágicas para armazenamento a menos 80 graus Celsius, remova os alimentadores e desprenda as células esofágicas conforme acabou de ser demonstrado. Em seguida, transfira as células para um novo tubo cônico de 50 mililitros para centrifugação e re-suspenda o pellet numa concentração de um vezes 10 à sexta células por dois mililitros de meio de congelamento. Depois, transfira dois mililitros de células para cada criotubo previamente rotulado e armazene as amostras a menos 80 graus Celsius por pelo menos 24 horas antes de transferi-las para armazenamento prolongado em nitrogênio líquido.

Colônias de células epiteliais se formarão em aproximadamente quatro a cinco dias e estarão cercadas por células alimentadoras fibroblásticas. À medida que essas colônias se expandirem, fundir-se-ão com outras colônias para formar colônias maiores. Quando o cultivo atingir 70% de confluência, será necessário expandi-lo.

Após a remoção das células alimentadoras, as células epiteliais aderentes podem ser tratadas com tripsina e replantadas sobre novas células alimentadoras irradiadas. A caracterização fenotípica dessas células por meio de qRT-PCR revela uma superexpressão de P63, um marcador de células progenitoras, ao final da primeira passagem, em comparação com a amostra inicial da biópsia, indicando que as células foram reprogramadas para um estado mais semelhante ao de células-tronco progenitoras. Quando essas células são transferidas para placas de cultura de tecidos normais, a expressão de P63 diminui e as expressões da proteína de junção apertada um, ou TJP1, e da E-caderina aumentam, demonstrando uma mudança fenotípica de célula progenitora para um tipo celular epitelial mais diferenciado.

A análise citométrica de fluxo das células após a primeira passagem indica que mais de 90% das células também são positivas para EpCAM. A coloração por imunofluorescência demonstra que as células mantêm a expressão de marcadores epiteliais, de progenitores, de proliferação e de proteínas das junções apertadas epiteliais. O tempo de duplicação de células esofágicas de um paciente sem doença foi calculado em aproximadamente 36 a 40 horas, embora seja provável que o tempo de duplicação de células doentes seja mais lento.

Uma vez dominada, esta técnica deve ser concluída em aproximadamente uma hora. Ao realizar este procedimento, certifique-se de usar técnica estéril para prevenir contaminação e trabalhe com agilidade para manter a viabilidade celular. Após este procedimento, outros ensaios, como o cultivo em transwell, podem ser realizados para avaliar quais antígenos estão causando inflamação esofágica ou patogênese.

Após o desenvolvimento, este ensaio abrirá caminho para que pesquisadores identifiquem antígenos desencadeantes da esofagite eosinofílica, bem como novas opções de tratamento para esses pacientes. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar e expandir células epiteliais esofágicas a partir de biópsias endoscópicas para uso no estudo de doenças esofágicas ou na geração de modelos tridimensionais. Não se esqueça de que trabalhar com instrumentos cortantes e tecidos biológicos pode ser perigoso.

Certifique-se de descartar corretamente instrumentos cortantes e adote boas práticas de biossegurança.