Name: Reprogramação condicional de células Pediátrica Humano esofágico epiteliais para uso em Engenharia de Tecidos e Doença de Investigação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Aprenda a reprogramação condicional de células epiteliais esofágicas pediátricas humanas para engenharia de tecidos e pesquisa de doenças. Este método permite expandir células sem modificação genética.

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Gostaríamos de agradecer ao Financiamento de Pesquisa Estratégica do Connecticut Children's Medical Center por apoiar este trabalho.

biópsias esofágicas foram obtidos após consentimento informado foi obtido dos pais / responsáveis ​​dos pacientes pediátricos e de acordo com a placa de revisão institucional (IRB # 13-094). 1. esterilização de instrumentos e gelatina Solution <ol><li> forceps autoclave, lâminas de barbear e tesouras antes de manusear do tecido para evitar a contaminação. </li><li> Para fazer 200 ml de solução de gelatina a 0,1%, combinar 200 mL de água destilada com 0,2 g de gelatina. Autoclave e fresco antes da utilização. </li></ol> 2. revestindo placas de cultura de tecidos <ol><li> Aproximadamente 2 h antes do isolamento das células, suficiente adicionar 0,1% de gelatina, para cobrir uma placa de cultura de tecido (100 mm) e incuba-se a 37 ° C numa incubadora de cultura de células. NOTA: Estas placas também pode ser feita antes do tempo e mantido na incubadora antes de utilização. </li></ol> 3. Fazer Solução de Enzima para a dissociação <ol><li> Aproximadamente 30 minutos antes do isolamento de células, pesar10 unidades de dispase em um equilíbrio com base nas unidades por miligrama concentração no frasco. Colocar o pó num tubo cónico de 15 mL com 10 mL de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) e colocar num banho de água a 37 ° C. </li></ol> 4. Fazer celular Meio de Cultura <ol><li> Para fazer com que 50 ml de meio de reprogramação condicional, misturar os seguintes ingredientes em um tubo estéril cónico: 35 ml de F12 (Meio de Ham), 11,5 mL de DMEM, 0,5 mL de L-glutamina, 0,5 ml de 100 x penicilina / estreptomicina, 2,5 mL de soro fetal de bovino (FBS), 250 ug de insulina humana, 500 ng de factor de crescimento epidérmico humano (EGF). </li><li> Para tornar a 500 mL de meio de 3T3, misturar 50 mL de FBS, 5 mL de 100 x penicilina / estreptomicina e 5 mL de L-glutamina, com 500 mL de meio DMEM. </li><li> Para fazer 500 ml de meio isento de soro queratinócitos, descongelar suplementos extrato de pituitária bovina (BPE) (fornecidos com a mídia) EGF e. Adicionar aos complementos do mL garrafa de meio base 500 e adicionar 5 mL de 100 x penicilina / estreptomicina </li></ol> 5. cultura de células e irradiando 3T3 como fonte Feeder <ol><li> Prepare forma 3T3, que compreende DMEM, FBS a 10%, 1x penicilina / estreptomicina e 2 mM de L-glutamina. </li><li> Cultura em células 3T3 tratadas com tecido frascos T-75, pelo menos, 3 dias antes da chegada de amostras de doentes. <ol><li> Pouco antes da chegada das amostras dos pacientes, trypsinize 3T3 utilizando 5 mL de 0,25% de tripsina-EDTA por frasco e incubar a 37 ° C durante 5 min ou até que a maioria das células são flutuante </li></ol></li><li> Adicionar 5 mL de 3T3 meio para parar a reacção. Aspirar a suspensão de células e transferir para um tubo cónico de 15 mL. Rotação durante 5 minutos a 300 x g. </li><li> Aspirar o meio e ressuspender as células em um volume definido de tripano azul para contagem das células. Combinar 10 mL de células com 10 uL de azul Tripano para excluir as células mortas. Carga de 10 uL desta solução em um hemocitómetro para contagem das células. NOTA: Para este protocol, densidade de sementeira de células irradiadas 3T3 é 10.900 células por cm2, que é igual a 600.000 células por placa de 100 mm. </li><li> Alíquota o número de células necessárias para chapear uma placa de 100 mm por amostra do paciente e ressuspender em 25 ml de 3T3 meio num tubo cónico de 50 mL e irradiar com 3000 rads. </li><li> Após a irradiação, as células de spin para baixo por 5 min a 300 x g e ressuspender em meio reprogramação condicional em 5 mL por placa de 100 mm. </li><li> Definir o tubo de lado até que o revestimento de células do paciente ocorre mais tarde no protocolo (ver passo 7.6). </li></ol> 6. Obtenção, Preservar e Transportar pediátricos esofágicas Biópsias <ol><li> Adicionar 5 ml de meio isento de soro queratinócitos completo com 100 mcg / mL primocin 15 tubos cônicos ml e trazê-lo para o centro médico no gelo. NOTA: Estes tubos de meio pode ser armazenado a 4 ° C durante até 2 meses. </li><li> Obter aproximadamente 8 biópsias esofágicas na ti-me de endoscopia e separada como segue: <ol><li> Coloque seis biópsias no mL cônico de 15 contendo meio sem soro completa de queratinócitos com 100 mcg / mL primocin e colocar no gelo molhado. </li><li> Coloque uma biopsia em 5 ml de formalina tamponada e colocar em gelo molhado. </li><li> Coloque uma biópsia em uma pequena biópsia cryomold com o composto ideal temperatura de corte. <ol><li> Imediatamente diminua este molde para uma proveta de isopentano colocado em azoto líquido. Uma vez congelado, o cryomold colocar num saco de amostra e armazenar em gelo seco num recipiente de espuma de poliestireno. </li></ol></li></ol></li><li> Coloque os tubos contendo biópsias em médio ou formol dentro de um saco selado e em seguida, em uma caixa de transporte contendo gelo molhado. Selar e rotular a caixa com uma etiqueta de risco biológico e transportá-lo para o laboratório. NOTA: O recipiente que contém o gelo seco e congelado biópsia também é selado e etiquetado com uma etiqueta de risco biológico. </li></ol> 7. ProcessamentoTecido do paciente para a Cultura e Análise Downstream <ol><li> À chegada ao laboratório, transferir a biópsia de congelação em gelo seco a -80 ° C congelador por corte a jusante ou a extração de RNA. Colocar a amostra em formalina. Armazenar em um C geladeira 4 ° e permitir corrigir durante a noite. </li><li> Girar as biópsias restantes para baixo a 300 xg, e aspirar o meio. Adicionar 10 mL de solução de dispase ao tubo cónico, vedação e permitir que a incubar a 37 ° C num banho de água durante 15 min. </li><li> Após a incubação, as biópsias girar para baixo a 300 x g. Aspirar as biópsias médio e ressuspender em 5 mL de 0,05% de tripsina-EDTA. </li><li> Transferir a 5 mL de tripsina-EDTA contendo as biópsias para uma placa de 100 mm e estéril mediu as biópsias utilizando 2 lâminas de barbear esterilizados tão fina quanto possível. </li><li> Transferir a 5 mL de tripsina-EDTA contendo biópsias picadas para um novo 15 mL cónico. Lavar a placa duas vezes com um adicional de 5 mL de 0,05% de tripsina-EDTA e adicionar ao cónicatubo. Incubar o tubo durante 10 minutos num banho de água a 37 ° C. </li><li> Após a incubação, as biópsias girar para baixo a 300 xg (1,4 rpm) durante 5 min e aspirar o meio. Adicionar 5 mL de meio de reprogramação condicional para o tubo cônico, bem como a 5 mL de meio de reprogramação condicional contendo as células de alimentação irradiadas (veja o passo 5.7). </li><li> Adicionar inibidor de rocha (1 mL / mL) ao 10 mL de suspensão de células e aspiração do prato depois de gelatina do prato de cultura de tecidos. Incubar a 37 ° C. </li></ol> 8. A cultura e Células de Expansão <ol><li> Depois de aproximadamente 5 dias de cultura, aspirar o médio inicial contendo os pedaços picados por biópsia e lave o prato 2-3 vezes com 5 mL de PBS estéril. Adicionar novo meio para a placa incluindo inibidor ROCHA em 10? M. </li><li> Ao atingir 70% de confluência, expandir as células. Adicionar 5 ml de 0,05% de tripsina-EDTA para a placa e incubar numa incubadora a 37 ° C não superior a 2,5 min para remover the células alimentadoras. Na sequência desta incubação, aspirar a tripsina-EDTA e lavar a placa com 5 ml de PBS. </li><li> Aspirar o PBS e adicionar 5 mL de 0,25% de tripsina-EDTA para a placa e incubar durante 5-10 minutos ou até que as células estão soltas a partir da placa. Adicionar quantidades iguais de forma que a placa para parar a reacção e transferir todo o fluido para um tubo cónico de 50 mL e girar a 300 xg durante 5 min. </li><li> Ressuspender as células num volume definido de forma condicional reprogramação e misturar 10 ul da suspensão com 10 mL de azul de tripano. Contar com um hemocitômetro para determinar o número total de células. </li><li> Para expandir células, adicionar 1 milhão de células esofágicas humanos para uma placa de 150 mm ao longo com 1,2 milhões de células irradiadas 3T3 num volume total de 15 mL. Adicionar inibidor ROCHA fresco a 10 uM e adicionar a suspensão de células para uma placa revestida de gelatina de 150 mM. </li></ol> 9. As células congelar e armazenar Humano esofágico epiteliais <ol><li> Para tornar meio de congelamento, adicionar 10%DMSO a médio reprogramação condicional. Após trypsinizing e contagem, as células alíquota para congelar para um novo tubo de 50 mL cónico e girar a 300 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar o meio e adicionar meio de congelação a um volume de 2 ml por frasco de congelação. Uma vez que a suspensão de células é homogéneo, uma alíquota de 10 6 células em cyrovials pré-rotulados. Introduzem-se num recipiente de congelação a -80 ° C durante pelo menos 24 h antes de se mudar os frascos para armazenamento em azoto líquido a longo prazo. </li></ol>

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Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Os passos mais importantes, a fim de isolar e expandir células epiteliais esofágicas a partir de biópsias de pacientes são: 1) dissociação adequadamente tecido de biopsia com a morte celular mínima; 2) assegurar ROCHA inibidor é adicionado ao meio de cultura de células em cada mudança de meio; 3) Não use mais células alimentadoras do que o recomendado; 4) manter uma cultura asséptica limpo; e 5) células de passagem apenas antes de atingir a confluência. Devido às diferenças relacionadas com ...

engenharia de tecidos e esofagite eosinofílica (EoE) têm sido o foco de pesquisas em muitos laboratórios ao longo da última década. Defeitos congênitos, como a atresia de esôfago, são vistos em aproximadamente 1 em cada 4.000 nascidos vivos, o que resulta no desenvolvimento incompleto do esôfago levando à incapacidade de comer 1. A incidência e prevalência de EoE têm vindo a aumentar desde a identificação da entidade doença em 1993. A incidência de EoE variou entre 0,7 a 10 / 100.000 por pessoa-ano e a prevalência variou de 0,2-43 / 100.000 2. Uma nova abordagem cirúrgica atraente para o tratamento de longo intervalo atresia esofágica consiste na geração de construções de tecido para implante utilizando as células do próprio paciente. Estas células em conjunto com o andaime sintético irá gerar um construto autólogo que não exige imunossupressão. Alguns grupos já começaram a investigar os EUAe de células estaminais, como para engenharia de tecido esofágico 3, bem como a utilização de células epiteliais esofágicas nativas para repovoar a mucosa 4-7. Doenças que estão presentes no esófago do paciente pediátrico são muitas vezes difíceis de diagnosticar ou estudar sem intervenção. Além disso, utilizando modelos animais ou in vitro imortalizado modelos da linha celular para doenças pediátricas como EoE não abranger a patogênese da doença exata ou diferenças específicas dos pacientes 8. Portanto, a capacidade para o estudo do processo de doença de um paciente in vitro, a fim de identificar antigénios específicos de doença desencadeamento, avaliar os mecanismos subjacentes e investigar tratamentos com drogas seria novo e proporcionar aos médicos com informações que podem ajudar no tratamento do paciente. Tem havido muitos tipos de células autólogas ou específicas do paciente que têm sido propostas para utilização em tissue engenharia e estudando patogênese da doença humana. No entanto, alguns destes tipos de células são limitados na sua capacidade para gerar células suficientes de um fenótipo específico para semear um grande andaime ou executar alto rendimento em estudos in vitro. O uso de células-tronco pluripotentes ou multipotentes tem sido o tema de muita discussão pesquisa, no entanto, limitações e insuficiências para o uso dessas células têm sido bem descrito 9. A utilização de células estaminais embrionárias humanas é altamente debatido e apresenta muitas questões éticas. Mais importante, estas células formam teratomas, que são semelhantes a um tumor, se eles não são diferenciados a partir de seu estado pluripotentes antes de entregar os em um hospedeiro vivo 10. Além disso, a utilização de células estaminais embrionárias não seria-específico do paciente e pode desencadear uma resposta alogénica e a necessidade para a supressão imune 10. Induzidas células-tronco pluripotentes (iPSCs) são células pluripotentes que podemser derivado a partir de células do próprio paciente. As células somáticas, tais como as células da pele, pode ser induzido para um estado pluripotente usando uma variedade de técnicas de integração e não-integrativos. Essas células, então, servir como uma fonte de células específicas do paciente para engenharia de tecidos ou de investigação da doença. A integração de material genético indesejado para estas células é uma preocupação muitos descreveram e mesmo sequências são completamente removidos iPSCs aparecem para conservar uma &quot;memória&quot; epigenética para o tipo de célula a partir da qual eles foram derivados 11. Estas células também irá formar teratomas in vivo, se não diferenciadas antes do transplante 11. Muitos protocolos de diferenciação têm sido investigados concentrando-se em linhagens epiteliais 12, 13, 14, no entanto, é muito importante notar que os tipos de células que resultam no final de diferenciação não são homogéneos e óomente possuir uma fracção do tipo de células de interesse. Isto resulta em baixo rendimento e a necessidade de purificar o tipo de célula desejado. Embora iPSCs são uma potencial fonte de células específicas do paciente, o processo para obter um tipo de células de interesse, quer para a engenharia de tecidos ou de investigação da doença é muito ineficiente. Células epiteliais humanas foram isolados com sucesso a partir de uma variedade de ambos os tecidos doentes e não doentes no corpo humano, incluindo: 15 pulmão, de mama 16, 17 intestino delgado, cólon 18, 19 da bexiga e do esófago 20. É importante notar que as células humanas primárias têm um número finito de passagens em que o fenótipo é mantida 21, 22. Infelizmente, isto significa que o número de células necessário para a investigação da doença ou para semear um andaime engenhariapara o implante não pode ser alcançado. Portanto, as novas técnicas são necessários para expandir células do paciente enquanto ainda mantém um fenótipo epitelial. Reprogramação condicional de células epiteliais normais e cancerosos utilizando células alimentadoras e inibidor ROCHA foi descrito em 2012 por Liu et al. 2 3. Esta técnica foi utilizada para expandir células epiteliais cancerosas obtidos a partir de biópsias de câncer de próstata e de mama, utilizando células de alimentação irradiadas, inibidor ROCHA e médias reprogramação condicional. O objetivo era gerar células suficientes para ensaios in vitro, como o rastreio de drogas. Esta técnica é capaz de se expandir células epiteliais indefinidamente por &quot;reprogramar&quot; as células para um tronco ou progenitoras estado semelhante, que é altamente proliferativo. Foi demonstrado que estas células são não-tumorigénico e não possuem a capacidade para formar teratomas 23, 24. Além disso, nenhumanomalias cromossómicas ou manipulações genéticas estavam presentes após passaging estas células em cultura usando esta técnica 23, 24. Mais importante ainda, essas células só são capazes de se diferenciar em células do tipo nativo de interesse. Portanto, esta técnica oferece um grande reservatório de células epiteliais específicos do paciente para investigação da doença ou engenharia de tecidos sem a necessidade de imortalização. A obtenção de tecido epitelial de um órgão específico, a fim de estudar processos de doença é muitas vezes limitada e nem sempre é possível, devido ao risco de paciente. Para os pacientes que sofrem de doença ou defeitos esofágico, recuperação endoscópica biópsia é uma abordagem minimamente invasiva para a obtenção de tecido epitelial que podem ser dissociados e condicionalmente reprogramadas de modo a proporcionar uma fonte de células indefinida que é específico para a mucosa do esófago que do paciente. Isso, então, permite estudos in vitrodas células epiteliais para avaliar os processos de doença e tela para potenciais agentes terapêuticos. Um processo de doença que poderiam beneficiar grandemente de esta abordagem é esofagite eosinofílica, que tem sido descrita como doença alérgica do esófago 8. Testes de alergia, bem como abordagens terapêuticas poderiam ser avaliada in vitro utilizando as próprias células epiteliais do paciente e estes dados podem então ser transmitida para o médico assistente para desenvolver planos de tratamento individualizado. A técnica de reprogramação condicional em conjunto com a obtenção de biópsias endoscópicas de pacientes pediátricos oferece a capacidade de expandir as células epiteliais do esôfago normais por tempo indeterminado a partir de qualquer paciente. Esta fonte de células poderiam, portanto, ser agrupado em conjunto com andaimes natural ou sintética para fornecer uma opção cirúrgica específica para cada paciente por defeitos, doença ou trauma. Ter um número de celular por tempo indeterminado ajudaria engenharia construções de esôfago que possuem uma completamente reseededlúmen com células epiteliais esofágicas, a fim de ajudar a facilitar a regeneração dos tipos de células restantes.

<table><tbody><tr><td>Primocin</td><td>InVivogen</td><td>ant-pm2</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane Sigma</td><td>Aldrich</td><td>277258-1L</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de pele suína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>TissueTek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>Cryomatrix OCT</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td>6769006</tr><tr><td>Tubos Cônicos de 15 mL</td><td>Denville Scientific</td><td>C1017-p</td><td></td></tr><tr><td>Soro Completo de Queratinócitos Meio Livre</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10724011</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Solução de Insulina 35050061</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ml</td><td></td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Epidérmico Humano (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de ROCK (Y-27632)</td><td>Fisher Scientific</td><td>125410</td><td></td></tr><tr><td>F-12 Medium&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Soro Bovino</td><td>Denville Scientific</td><td>FB5001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Pratos</td><td>Denville Pratos Scientific</td><td>T1110-20</td><td></td></tr><tr><td>150 mm</td><td>Denville Scientific</td><td>T1115</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Cônicos</td><td>Denville Scientific</td><td>&nbsp; C1062-9;</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos de solução salina tamponada com fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de 25 mL</td><td>Pipetas Pasteur</td><td>de</td> 1367811 <td></td></tr><tr><td>9"</td><td>da Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3 Células</td><td>ATCC</td><td>CRL1658</td><td></td></tr></tbody></table>

reprogramação condicional de células pediátrica humano esofágico epiteliais para uso em engenharia de tecidos e doença de investigação

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

Identificar e expandir células específicas do paciente em cultura para uso em engenharia de tecidos e investigação de doenças pode ser muito desafiador. A utilização de vários tipos de células-tronco para derivar tipos de células de interesse costuma ser cara, demorada e altamente ineficiente. Além disso, os tipos de células indesejados devem ser removidos antes de usar essa fonte de célula, o que requer outra etapa do processo. Para obter células epiteliais esofágicas suficientes para projetar o lúmen de uma construção esofágica ou para rastrear abordagens terapêuticas para o tratamento de doenças esofágicas, as células epiteliais esofágicas nativas devem ser expandidas sem alterar sua expressão gênica ou fenótipo. A reprogramação condicional do tecido epitelial esofágico oferece uma abordagem promissora para expandir as células epiteliais esofágicas específicas do paciente. Além disso, essas células não precisam ser classificadas ou purificadas e retornarão a um estado epitelial maduro após removê-las da cultura de reprogramação condicional. Essa técnica foi descrita em muitos estudos de rastreamento de câncer e permite a expansão indefinida dessas células em várias passagens. A capacidade de realizar ensaios de triagem esofágica ajudaria a revolucionar o tratamento de doenças esofágicas pediátricas, como a esofagite eosinofílica, identificando o mecanismo de gatilho que causa os sintomas do paciente. Para aqueles pacientes que sofrem de defeito congênito, doença ou lesão do esôfago, essa fonte de células pode ser usada como um meio de semear uma construção sintética para implantação para reparar ou substituir a região afetada.

Um resumo das principais etapas isolar células epiteliais do esôfago de biópsias de pacientes estão resumidos na Figura 1. As colónias de células epiteliais vai formar em cerca de 4-5 dias e vai ser rodeado por células de alimentação de fibroblastos (Figura 2A). À medida que essas colônias expandir eles vão fundir-se com outras colónias para formar grandes colônias (Figura 2B). Uma vez que as culturas se tornaram 70% confluentes, eles pr...

Expansão de células epiteliais humanas esofágicas pediátricos utilizando reprogramação condicional fornece investigadores com uma população específica no paciente de células que pode ser utilizada para engenharia construções esofágicas autólogo para implantação para tratar defeitos ou ferimentos e servir como um reservatório para ensaios de pesquisa de terapêuticos.

Reprogramação condicional de células Pediátrica Humano esofágico epiteliais para uso em Engenharia de Tecidos e Doença de Investigação

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

O objetivo geral deste procedimento é expandir células epiteliais esofágicas derivadas de biópsias endoscópicas de pacientes para estudar doenças esofágicas ou para criar um suporte esofágico tridimensional para modelagem posterior ou substituição do tecido esofágico. Este método pode ser utilizado para melhor compreender o papel das células epiteliais esofágicas nas doenças esofágicas. Elas também podem ser usadas para gerar suportes tridimensionais para modelagem ou implantação.A vantagem desta técnica é que ela nos permite gerar células epiteliais específicas do paciente a partir de um fragmento muito pequeno de tecido, sem a necessidade de modificações genéticas ou permanentes. As implicações desta técnica estendem-se para a compreensão da patogênese da esofagite eosinofílica, bem como para o desenvolvimento de tratamentos para atresia esofágica e esofagite eosinofílica. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica terão dificuldade em remover completamente as células de suporte antes da coleta das células epiteliais esofágicas humanas, a fim de manter a pureza.Demonstrará esta técnica Christopher Foster, um técnico do nosso laboratório. Pelo menos três dias antes da obtenção das

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Descrevemos um método para estabelecer enteróides humanos a partir de criptas do intestino delgado e colonóides a partir de criptas do cólon coletadas de tecido cirúrgico e biópsias. Neste artigo metodológico, apresentamos as modalidades de cultura que são essenciais para o crescimento e manutenção bem-sucedidos de enteróides e colonóides humanos.

Estabelecimento de epiteliais humanas Enteroids e Colonoids de tecido inteiro e biópsia

Este manuscrito descreve a produção, caracterização e usos potenciais de uma engenharia de tecidos construção de esôfago 3D preparado a partir de fibroblastos de esôfago normais primária humana e células epiteliais escamosas semeadas dentro de um andaime porcino de-celularizado. Os resultados demonstram a formação de um epitélio estratificado maduro semelhante ao esófago humano normal.

Produção, Caracterização e usos potenciais de uma mucosa esofágica Modelo 3D Human Tissue-engenharia

Geração de células estaminais pluripotentes induzidas proporciona perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e trabalhoso re-diferenciação ainda dificulta a tradução clínica. Aqui nós descrevemos a derivação de fibroblastos humanos adultos ea sua conversão direta em células progenitoras neurais induzidos ea subsequente diferenciação em linhagens neuronais.

Derivação de adultos fibroblastos humanos e sua conversão direta em Expansível Neural células progenitoras

Este manuscrito descreve a criação de tecidos cardíacos projetados definidos usando expressão de marcadores de superfície e classificação celular. Os tecidos definidos podem então ser usados em um biorreator multitecido para investigar os mecanismos da terapia com células cardíacas, a fim de fornecer um sistema modelo funcional, mas controlado, do coração humano.

Construção de Engineered Definido cardíaca humana Tecidos para estudar os mecanismos da terapia celular cardíaca

Esta publicação demonstra métodos para amostragem e cultura bem-sucedidas da mucosa epitelial nasal de crianças e reprogramação dessas células para células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs).

Cultivar células primárias Nasal epiteliais de Crianças e reprogramar em células-tronco pluripotentes induzidas

A reconstrução do esôfago é um procedimento desafiador, e o desenvolvimento de um esôfago projetado por tecido que permite a regeneração da mucosa esofágica e muscular e que pode ser implantado à medida que um enxerto artificial é necessário. Aqui, apresentamos nosso protocolo para gerar um esôfago artificial, incluindo fabricação de andaimes, cultivo de bioreatores e várias técnicas cirúrgicas.

Enxerto projetado por tecido para reconstrução circunferencial do Esôfago em Ratos

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Bioreator guiado por imagem para geração de tecido das vias aéreas bioengenharia

O presente protocolo descreve as capacidades e as modalidades de cultura essenciais do Open-Top Organ-Chip para o estabelecimento e maturação bem-sucedidos de culturas organ-on-chip de espessura total de tecidos primários (pele, alvéolo, vias aéreas e intestino), proporcionando a oportunidade de investigar diferentes aspectos funcionais da interface epitelial/mesenquimal e vascular humana in vitro.

Reconstituindo a citoarquitetura e a função de tecidos epiteliais humanos em um chip de órgão de topo aberto

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Aqui, é fornecido um protocolo para a cultura de organoides esofágicos humanos e cultura de interface ar-líquido. A cultura de interface ar-líquido dos organoides esofágicos pode ser usada para estudar o impacto das citocinas na barreira epitelial esofágica.

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O presente protocolo descreve o estabelecimento e a análise histológica de modelos organoides esofágicos que representam diferentes estágios da progressão tumoral. Este método permite que os pesquisadores estudem mudanças na morfologia celular, organização espacial e padrões de expressão de marcadores moleculares durante a transição de tecidos normais para cancerígenos.

Estabelecimento e Análise Histológica de Organoides Esofágicos Modelando a Progressão de Tecidos Normais para Cancerosos

Aprenda a reprogramação condicional de células epiteliais esofágicas pediátricas humanas para engenharia de tecidos e pesquisa de doenças. Este método permite expandir células sem modificação genética.

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