Reprogramação condicional de células Pediátrica Humano esofágico epiteliais para uso em Engenharia de Tecidos e Doença de Investigação

O objetivo geral deste procedimento é expandir as células epiteliais esofágicas derivadas do paciente a partir de biópsias endoscópicas para estudar doenças esofágicas ou criar um andaime esofágico 3D para modelagem a jusante ou substituição de tecido esofágico. Este método pode ser usado para entender melhor o papel das células epiteliais esofágicas na doença esofágica. Eles também podem ser usados para ver andaimes 3D para modelagem ou implantação.

A vantagem dessa técnica é que ela nos permite gerar células epiteliais específicas do paciente a partir de um pedaço muito pequeno de tecido, sem a necessidade de modificações genéticas ou permanentes. As implicações dessa técnica se estendem à compreensão da patogênese da esofagite eosinofílica, bem como ao desenvolvimento de tratamentos para atresia esofágica e esofagite eosinofílica. Geralmente, os indivíduos novos nessa técnica terão dificuldade com a capacidade de remover completamente as células alimentadoras antes da colheita das células epiteliais esofágicas humanas para manter a pureza.

Demonstrando essa técnica estará Christopher Foster, um técnico de nosso laboratório. Pelo menos três dias antes da obtenção das amostras dos doentes, colocar as células 3T3 em meio de cultura 3T3 em balões T75 tratados com tecidos. No dia do experimento, pouco antes de obter as amostras, destacar as células 3T3 com 5 mililitros de 0,25% de tripsina-EDTA por frasco por cerca de cinco minutos a 37 graus Celsius.

Quando a maioria das células estiver flutuando, adicione 5 mililitros de meio 3T3 para interromper a reação e transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação. Ressuspenda o pellet no meio para contagem. Em seguida, transfira o número apropriado de células para semeadura em um tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, adicione 25 mililitros de meio 3T3 fresco às células para irradiação a 3000 rads. Em seguida, colete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em meio de programação condicional a cinco mililitros por placa de 100 milímetros. Após a obtenção de aproximadamente seis biópsias esofágicas no momento da endoscopia, coloque seis biópsias em um tubo cônico de 15 mililitros contendo meio queratinócito completo sem soro, suplementado com Primocin em gelo úmido.

Coloque uma biópsia em cinco mililitros de formalina tamponada em gelo úmido e coloque uma biópsia em um pequeno criomold de biópsia contendo meio de inclusão. Mergulhe imediatamente o molde em um copo de gelo ou pentano dentro de um recipiente com nitrogênio líquido. Uma vez congelado o tecido, coloque o criomold em um saco de amostra sobre gelo seco, em um recipiente de espuma de poliestireno.

Em seguida, coloque os tubos de biópsias dentro de um saco lacrado dentro de uma caixa de transporte com a etiqueta de risco biológico contendo gelo úmido e feche e rotule ambos os recipientes com um adesivo de risco biológico para transporte ao laboratório. Ao entrar no laboratório, transfira imediatamente a biópsia congelada para um armazenamento de 80 graus Celsius negativos para seccionamento a jusante ou extração de RNA. Coloque a amostra em formalina em um refrigerador de quatro graus Celsius para fixação durante a noite e coloque as biópsias restantes na centrífuga.

Substitua o meio em cada tubo por 10 mililitros de solução de dispase e sele os tubos para uma incubação de 15 minutos a 37 graus Celsius em banho-maria. No final da incubação, gire as biópsias novamente e ressuspenda as amostras em cinco mililitros de 0,25% de tripsina-EDTA. Transfira as biópsias para uma única placa estéril de 100 mililitros e use duas lâminas esterilizadas para picar os tecidos o mais finamente possível.

Quando todo o tecido tiver sido cortado, transfira os fragmentos de tecido para um novo tubo de 15 mililitros e enxágue a placa duas vezes com cinco mililitros de 0,05% de tripsina-EDTA. Acumule as lavagens no tubo e retorne as amostras para um banho-maria de 37 graus Celsius. Após 10 minutos, centrifugue os pedaços de amostra digeridos e as células alimentadoras e ressuspenda os pellets em cinco mililitros de meio de reprogramação condicional, cada um.

Em seguida, combine as amostras de alimentador e biópsia esofágica em um tubo e adicione rho quinase, ou inibidor de ROCK, às células para sua co-cultura em uma placa de cultura de tecidos revestida com gelatina. Após aproximadamente cinco dias, remova os pedaços de biópsia média e picada por aspiração e enxágue o prato duas a três vezes com cinco mililitros de PBS estéril. Após a última lavagem, adicionar 10 mililitros de meio fresco suplementado com inibidor de ROCK, à placa, e retornar a co-cultura à incubadora até que as células atinjam 70% de confluência.

Para expandir as células, remova os alimentadores com cinco mililitros de 0,05% de tripsina-EDTA a 37 graus Celsius por não mais que dois minutos e meio. Enxágue a placa com cinco mililitros de PBS fresco para remover as células alimentadoras flutuantes e adicione cinco mililitros de 0,25% de tripsina-EDTA por uma incubação de cinco a 10 minutos até que as células da amostra de biópsia sejam soltas do fundo da placa. Em seguida, pare a reação com 10 mililitros de meio fresco e transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros para centrifugação.

Ressuspenda o pellet em meio de reprogramação condicional fresco para contagem e, agora, contabilize uma vez 10 elevado à sexta célula esofágica humana em um novo tubo cônico. Adicione 1,2 vezes 10 às sextas células 3T3 irradiadas às células esofágicas e traga o volume total no tubo para 15 mililitros com meio de reprogramação condicional fresco. Em seguida, adicione um inibidor de ROCK fresco às células e coloque a co-cultura em um prato de 150 milímetros revestido de gelatina.

Para congelar as células esofágicas para armazenamento de menos 80 graus Celsius, remova os alimentadores e retire as células esofágicas conforme demonstrado. Em seguida, transfira as células para um novo tubo cônico de 50 mililitros para centrifugação e ressuspenda o pellet em uma vez 10 elevado à sexta célula por dois mililitros de concentração do meio de congelamento. Em seguida, transfira dois mililitros de células para cada criogenia pré-rotulada e armazene as amostras a menos 80 graus Celsius por pelo menos 24 horas antes de movê-las para armazenamento de nitrogênio líquido a longo prazo.

As colônias de células epiteliais se formarão em aproximadamente quatro a cinco dias e serão cercadas por células alimentadoras de fibroblastos. À medida que essas colônias se expandem, elas se fundem com outras colônias para formar colônias maiores. Uma vez que a cultura se tornou 70% confluente, eles precisam ser expandidos.

Após a remoção das células alimentadoras, as células epiteliais aderentes podem ser tripsonizadas e replaqueadas em novas células alimentadoras irradiadas. A caracterização fenotípica dessas células via qRT-PCR revela uma regulação positiva de P63, um marcador de célula progenitora no final da passagem um, em comparação com a amostra inicial de biospy, indicando que as células foram reprogramadas para um estado mais progenitor semelhante ao tronco. Quando essas células são transferidas para placas normais de cultura de tecidos, a expressão de P63 diminui e as expressões da proteína de junção apertada um, ou TJP1, e E-caderina aumentam, demonstrando uma mudança de fenótipo de célula progenitora para uma célula epitelial mais diferenciada.

A análise por citometria de fluxo das células após a passagem um indica que mais de 90% das células também são positivas para EpCAM. A coloração por imunofluorescência demonstra que as células retêm seu marcador epitelial, marcador progenitor, marcador de proliferação e expressão da proteína de junção apertada epitelial. O tempo de duplicação das células esofágicas de um paciente não doente foi calculado em aproximadamente 36 a 40 horas, embora seja provável que o tempo de duplicação das células doentes seja mais lento.

Uma vez dominada, essa técnica deve ser concluída em aproximadamente uma hora. Ao tentar este procedimento, certifique-se de usar uma técnica estéril para evitar contaminação e certifique-se de trabalhar rapidamente para manter a viabilidade celular. Após esse procedimento, outros ensaios, como a cultura transwell, podem ser realizados para avaliar quais antígenos estão causando inflamação esofágica ou patogênese.

Após o desenvolvimento, este ensaio abrirá caminho para os pesquisadores identificarem antígenos desencadeantes que causam esofagite eosinofílica, bem como novas opções de tratamento para o tratamento desses pacientes. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e expandir células epiteliais esofágicas de biópsias endoscópicas para uso no estudo de doenças esofágicas ou na geração de modelos 3D. Não se esqueça de que trabalhar com instrumentos pontiagudos e tecidos biológicos pode ser perigoso.

Certifique-se de descartar instrumentos pontiagudos adequadamente e use boas práticas de biossegurança.