MitoCeption: Transferir humano isolado MSC mitocôndrias de células-tronco Glioblastoma

O objetivo geral deste procedimento é transferir mitocôndrias previamente isoladas de células doadoras, como células-tronco mesenquimais, para células-alvo, como células-tronco de glioblastoma. Este procedimento pode ajudar a responder a questões-chave no campo do metabolismo, como os efeitos metabólicos e biológicos das mitocôndrias que são transferidas espontaneamente entre as células por processos como nanotubos de tunelamento ou microvesículas. A principal vantagem desta técnica é que os efeitos das mitocôndrias podem ser avaliados independentemente de outros fatores presentes no microambiente, como citocinas ou metabólitos, e também de outros compostos que também podem estar trafegando nos nanotubos de tunelização.

Para fins de imagem, as mitocôndrias MSC e GSC podem ser marcadas com corantes vitais antes da transferência das mitocôndrias por MitoCeption. Para começar, após pré-rotular as GSCs com corantes vitais de acordo com o protocolo de texto, colete as neuroesferas das GSC em um tubo de 50 mililitros por centrifugação a 270 vezes g a 20 graus Celsius por cinco minutos. Use cinco mililitros de HBSS para lavar as células e girar o tubo novamente.

Aspire o sobrenadante e com 100 microlitros de 0,25% de tripsina-EDTA ressuspenda suavemente o grânulo GSC. Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius por três minutos. Em seguida, adicione 10 microlitros de cloreto de cálcio 20 milimolares em dois microlitros a 10 miligramas por mililitro de DNase I ao tubo.

Dissocie as neuroesferas usando uma pipeta P200 para pipetar suavemente para cima e para baixo 30 a 50 vezes, evitando a formação de bolhas. Adicione 10 microlitros de inibidor de tripsina a 5% em 10 mililitros de HBSS às células e centrifugue os GSCs por sete minutos. Em seguida, rejeitar o sobrenadante e 10 mililitros de GSC Basal Medium para a amostra.

Agora, usando uma câmara de contagem de Thoma, conte as células antes de girar novamente. Adicionar o volume adequado de meio de proliferação de GSC para atingir um concentrado celular de 10 elevado ao sexto GSC por mililitro. Em seguida, semeie 10 ao quinto GSCs por poço de uma placa de 96 poços.

Centrifugue a placa de modo a que os GSC se depositem no fundo dos poços. Verifique as células ao microscópio. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius.

Para realizar o isolamento das mitocôndrias MSC, comece ajustando a temperatura da microcentrífuga para quatro graus Celsius. Prepare dois tubos de 1,5 mililitro marcados com A e C contendo reagentes para a extração das mitocôndrias. Prepare dois tubos adicionais rotulados como MSC e MiTo.

Mantenha os tubos no gelo. Prepare também tubos para as diluições em série das mitocôndrias que serão configuradas com a preparação das mitocôndrias. Use 10 mililitros de PBS pré-aquecidos a 37 graus Celsius para lavar as MSCs.

Em seguida, com dois mililitros de tripsina sem EDTA, lave as células por 10 segundos e adicione mais um mililitro de tripsina antes de incubar as células a 37 graus Celsius por cinco a 10 minutos. O uso de EDTA deve ser evitado de acordo com o protocolo, em particular para a tripsinização MSC e para o inibidor de protease usado na preparação das mitocôndrias. Recupere as MSCs adicionando 10 mililitros de Alpha MEM 10%FBS e transfira a suspensão para um tubo de 50 mililitros.

Em seguida, centrifugue as células. Descarte o sobrenadante e adicione 10 mililitros de Alpha MEM 10%FBS ao pellet celular. Em seguida, use uma câmara de contagem de Malassez para contar as MSCs antes de girar quatro a cinco vezes 10 para a quinta célula.

Descarte o sobrenadante, adicione um mililitro de Alpha MEM 10% FBS gelado ao pellet celular e transfira as células para o tubo previamente preparado com MSC, continuando a mantê-lo no gelo. Em seguida, centrifugue o tubo MSC a 900 vezes g a quatro graus Celsius por cinco minutos e remova todo o meio residual do tubo. Em seguida, adicione 200 microlitros de reagente de isolamento de mitocôndrias A com inibidores de protease livres de EDTA às MSCs e vórtice em velocidade média por cinco segundos.

Em seguida, deixe os tubos no gelo por exatamente dois minutos. Adicione 2,5 microlitros de reagente de isolamento de mitocôndrias B e vórtice as células na velocidade máxima por 10 segundos antes de colocar os tubos de volta no gelo. Repita o vórtice a cada 30 segundos por cinco minutos.

Agora, adicione 200 microlitros de reagente C de isolamento de mitocôndrias com inibidores de protease sem EDTA ao tubo e misture o conteúdo inclinando o tubo aproximadamente 30 vezes. Centrifugue os tubos a 700 vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos. Transfira o sobrenadante contendo as mitocôndrias MSC para o tubo MiTo previamente preparado.

Centrifugue a amostra a 3.000 vezes g a quatro graus Celsius por 15 minutos. Depois de descartar o sobrenadante, use 200 microlitros de reagente C para enxaguar o pellet mitocondrial. Em seguida, gire a suspensão a 12.000 vezes g a quatro graus Celsius por cinco minutos para pellet as organelas.

Para transferir mitocôndrias MSC isoladas para GSCs, adicione 200 microlitros de meio de proliferação de GSC pré-resfriado ao pellet mitocondrial. Diluir a preparação mitocondrial em meio de proliferação de GSC para permitir consistentemente a adição de 20 microlitros de suspensão mitocondrial aos GSCs. Em seguida, adicione lentamente as mitocôndrias perto do fundo do poço.

Para controlar o vazamento de corante vital das mitocôndrias MSC, adicione a mesma quantidade de preparação de mitocôndrias aos poços de uma placa de 96 poços contendo apenas meio de proliferação de GSC. Centrifugar as placas a 1 500 vezes g a quatro graus Celsius durante 15 minutos. Em seguida, coloque imediatamente as culturas a 37 graus Celsius.

No dia seguinte, para analisar os poços de controle quanto ao vazamento de corante vital, semeie as células GSC conforme descrito anteriormente, centrifugue a placa e incube as culturas a 37 graus Celsius por uma hora. Centrifugue a placa de 96 poços contendo apenas mitocôndrias. Em seguida, aspirar o meio da placa de poço GSC 96 e substituí-lo pelo sobrenadante mitocondrial.

Incubar as GSCs com o sobrenadante mitocondrial a 37 graus Celsius por duas horas. Por fim, realizar análise de transferência de mitocôndrias, análise FACS e imagem confocal de acordo com o protocolo de texto. As GSCs são células-tronco cancerígenas cultivadas como neuroesferas para preservar suas propriedades de células-tronco.

Pouco antes da transferência mitocondrial, elas são semeadas como células únicas para permitir uma alta eficiência de transferência de mitocôndrias e, no dia seguinte, como mostrado aqui, as células são observadas novamente formando neuroesferas. Nesta figura, as mitocôndrias MSC marcadas com fluorescência podem ser vistas localizadas dentro de Gb4 GSCs. As mitocôndrias MSC aparecem em todas as GSCs semelhantes às mitocôndrias GSC.

A transferência de mitocôndrias MSC pode ser observada para a maioria das GSCs na reconstrução 3D a partir de imagens confocais de GSC confirmam a localização intercelular das mitocôndrias MSC transferidas. A pré-marcação de GSCs com corantes vitais celulares azuis e mitocondriais vermelhos permitiu visualizar a localização das mitocôndrias MSC transferidas vistas em verde em relação às mitocôndrias endógenas do GSC. Como mostrado aqui, a MitoCeption com quantidades crescentes de mitocôndrias fluorescentes MSC levou ao aumento dos sinais FACS e com várias ordens de magnitude maiores do que o sinal de controle.

O protocolo de transferência de mitocôndrias aqui apresentado, realizado em GSCs de célula única, mostrou uma resposta dose-dependente e intensidade média relativa de fluorescência. Finalmente, embora a transferência de mitocôndrias MSC também tenha sido alcançada em neuroesferas de GSC, a eficácia da transferência para GSCs nessas condições foi menor em comparação com a transferência mitocondrial para GSCs semeadas pela primeira vez como células únicas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter a preparação das mitocôndrias no gelo o tempo todo. Seguindo esses procedimentos, outros métodos como FACS, microscopia confocal, QPCR no DNA mitocondrial podem ser realizados para visualizar e quantificar a transferência mitocondrial das MSC para as células-alvo. Estudos funcionais também podem ser realizados para determinar os efeitos biológicos das mitocôndrias transferidas.

Lembre-se de que esses estudos geralmente serão realizados com quantidades menores de mitocôndrias do que as usadas para visualizar a transferência de mitocôndrias. Esta técnica permitirá explorar o resultado e os efeitos biológicos das mitocôndrias que são transferidas espontaneamente entre células em condições fisiológicas ou patológicas normais e, assim, contribuirá para o desenvolvimento de novos tratamentos terapêuticos.