Isolamento de mitocôndrias intactas de Músculo Esquelético por centrifugação diferencial para medições Respirometria de alta resolução

O objetivo geral deste procedimento é isolar mitocôndrias do músculo esquelético por centrifugação diferencial e determinar as taxas respiratórias dos complexos I, II e IV da cadeia respiratória mitocondrial. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da bioenergética mitocondrial, como doenças e síndromes associadas à disfunção mitocondrial, por exemplo, diversas doenças neurológicas, sepse e distúrbios relacionados à idade. A principal vantagem desta técnica é a ausência da maioria dos fatores citológicos na preparação mitocondrial isolada, os quais podem interferir na análise das funções mitocondriais. A demonstração do procedimento será realizada por Sandra Nansoz, técnica do meu laboratório.

Para iniciar este procedimento, obtenha um béquer com amostras de músculo esquelético conforme descrito no protocolo textual. Coloque o béquer em um recipiente com gelo. Usando tesoura fina, pique o músculo em pedaços de um a dois milímetros de tamanho.

Em seguida, lave o tecido picado duas vezes com tampão de isolamento gelado, utilizando 20 mililitros para cada lavagem. Suspenda o tecido lavado em 10 mililitros de tampão de isolamento por grama de tecido e, então, adicione cinco miligramas de protease-G tecidual. Em seguida, coloque o béquer em banho de gelo com um agitador magnético e agite por 10 minutos.

Após isso, dilua a suspensão com mais 10 mililitros de tampão de isolamento suplementado com BSA desengordurada a 0,2% por grama de tecido. Em seguida, decante todo o tampão de isolamento do béquer. Lave o tecido duas vezes com tampão de isolamento gelado suplementado com BSA a 0,2%, utilizando 20 mililitros para cada lavagem.

Em seguida, re-suspenda o tecido em 10 mililitros de tampão de isolamento suplementado com BSA por grama de tecido. Utilize um homogeneizador de vidro semiautomático com pistilo folgado para homogeneizar o tecido. Em seguida, transfira o homogeneizado para um tubo de centrífuga e centrifugue a 10.000 × g por 10 minutos a quatro graus Celsius.

Usando uma pipeta serológica, descarte o sobrenadante. Re-suspenda o pellet com 10 mililitros de meio de isolamento suplementado com BSA frio a 4 °C por grama de tecido. Centrifugue a suspensão a 350 ×g por 10 minutos a 4 °C.

Após isso, utilize uma pipeta serológica para reservar o sobrenadante, descartando o precipitado. Filtre o sobrenadante em um béquer mantido em gelo através de duas camadas de gaze. Transfira a suspensão filtrada para um tubo de centrífuga e centrifugue a 7.000 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, descarte o sobrenatante. Re-suspenda o pellet bruto de mitocôndrias em cinco mililitros de tampão de isolamento suplementado com BSA por grama de tecido. Centrifugue esta suspensão a 7.000 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet em 20 mililitros de tampão de lavagem. Centrifugue a 7.000 ×g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Repita esse processo de re-suspensão e centrifugação mais uma vez.

Após isso, descarte o sobrenatante e re-suspenda o pellet em um mililitro de tampão de lavagem. Determine a concentração de proteína utilizando qualquer método padrão. Em seguida, mantenha a suspensão concentrada de mitocôndrias em gelo até o momento de realizar os ensaios de respirometria.

Para começar, re-suspenda o concentrado mitocondrial no tampão de respiração até uma concentração final de 0,4 miligramas por mililitro de proteína mitocondrial. Em seguida, aspire o meio de respiração da câmara do oxigrafo calibrada ao ar. Adicione 2,1 mililitros da suspensão mitocondrial isolada.

Insira uma rolha para fechar a câmara do oxígrafo. Em seguida, agite continuamente a suspensão mitocondrial a 700 rpm a 37 graus Celsius. Registre a respiração celular na linha de base por três a cinco minutos até que um sinal estável de fluxo de oxigênio seja alcançado.

Para iniciar a respiração dependente do complexo I, injete 12,5 microlitros de malato 0,8 molar em uma câmara de oxigrafia preparada com a suspensão mitocondrial isolada através da porta de injeção de titânio da rolha. Em seguida, injete 10 microlitros de glutamato 2 molar. Registre a respiração celular por três a cinco minutos até que um sinal estável de fluxo de oxigênio seja alcançado.

Após isso, injete 10 microlitros de ADP 0,05 molar na câmara através do portão de injeção. Registre a respiração celular até que o sinal de fluxo de oxigênio aumente, depois diminua e se estabilize. Para a respiração dependente do complexo II, injete dois microlitros de rotenona 0,2 milimolar na câmara de oxigrafia preparada com suspensão mitocondrial isolada.

Registre a respiração celular até que um sinal estável de fluxo de oxigênio seja alcançado. Em seguida, injete 20 microlitros de succinato um molar. Registre a respiração celular até que um sinal estável de fluxo de oxigênio seja alcançado.

Após isso, injete 10 microlitros de ADP 0,05 molar na câmara através do portão de injeção. Registre a respiração celular até que o sinal de fluxo de oxigênio aumente, depois diminua e se estabilize. Para a respiração dependente do complexo IV, injete 2,5 microlitros de ascorbato 0,8 milimolar em uma câmara de oxigrafia preparada com suspensão mitocondrial isolada.

Em seguida, injete imediatamente 2,5 microlitros de TMPD 0,2 molar e 10 microlitros de ADP 0,05 molar. Registre a respiração celular até que um sinal estável de fluxo de oxigênio seja alcançado. Então, injete 10 microlitros de azida de sódio 1 molar.

Registre a respiração celular até que o sinal de fluxo de oxigênio diminua e, em seguida, se estabilize. Neste estudo, mitocôndrias intactas são isoladas de músculo esquelético. As taxas respiratórias dependentes do complexo I são então medidas por meio de respirometria de alta resolução.

Como pode ser observado, a taxa de respiração mitocondrial aumenta imediatamente após a adição de ADP. A taxa de respiração diminui após o esgotamento de ADP, atingindo níveis semelhantes aos observados antes da adição de ADP. Isso indica que a razão entre o estado 3 e o estado 4, conhecida como razão de controle respiratório, ou RCR, é alta e que a integridade mitocondrial é bem preservada durante o procedimento de isolamento.

As taxas respiratórias dependentes do complexo II são então observadas ao inibir a respiração do complexo I com rotenona e injetar o substrato do complexo II, succinato. Em seguida, é adicionado ADP, resultando em um aumento imediato da respiração. Uma vez que o ADP é esgotado, a respiração diminui para níveis semelhantes aos observados antes da adição de ADP, indicando um alto RCR, o que demonstra que a integridade mitocondrial foi bem preservada durante o isolamento.

As taxas de respiração dependentes do complexo IV são observadas pela adição de ascorbato, TMPD e ADP. Em seguida, é adicionado azida de sódio para inibir o complexo IV. A diferença no consumo de oxigênio antes e após a adição de azida de sódio é interpretada como a respiração real do complexo IV. A alta taxa de respiração dependente do complexo IV observada no estado 3 indica que a integridade mitocondrial é bem preservada durante o procedimento de isolamento.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em menos de uma hora e meia, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de calibrar previamente os sensores de oxigênio antes da homogeneização. Após este procedimento, outros métodos, como medições do teor celular de ADP, potencial da membrana mitocondrial e atividade enzimática da ATP sintase como níveis de substrato, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como se as alterações nas taxas respiratórias são devidas à falta de substrato mitocondrial, potencial de membrana ou atividade enzimática reduzida da ATP sintase.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar mitocôndrias de um músculo esquelético por meio de centrifugação diferencial e como medir as taxas respiratórias dos complexos mitocondriais I, II e IV utilizando respirometria de alta resolução. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área do metabolismo energético mitocondrial explorarem a função energética das mitocôndrias em campos como doenças mitocondriais genéticas, miopatias e lesão por isquemia e reperfusão em mitocôndrias isoladas. Não se esqueça de que o trabalho com antimicina A, rotenona, azida de sódio e FCCP pode ser extremamente perigoso.

E precauções, como o uso de luvas e jalecos de laboratório, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.