Name: Sublimação da DAN Matrix para a Detecção e Visualização de gangliosídeos no cérebro de um rato do tecido por MALDI imagem Espectrometria de Massa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Aprenda a sublimação da matriz DAN para detecção de gangliosídeos em tecido cerebral de rato por espectrometria de massa MALDI. Este método avança pesquisas em neurobiologia e doenças neurológicas.

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Gostaríamos de agradecer a assistência técnica de Kristina Jurcic nas instalações do MALDI MS da University of Western Ontario, bem como do Conselho Nacional de Ciências e Engenharia (NSERC) por financiar este trabalho. Os autores também gostariam de agradecer ao grupo Caprioli (Vanderbilt University, TN) e ao grupo Chaurand (Université de Montreal, QC) por seus conselhos na otimização da técnica de sublimação apresentada neste manuscrito.

Todos os procedimentos de manipulação animal descrito abaixo aderir à Universidade do comitê de cuidados com os animais de Western Ontario (2016-014). 1. Preparação de tecidos e Seccionamento <ol><li> Extraia o tecido cerebral de ratos através de um processo conhecido como &quot;Fresco Congelado Extraction&quot; (FFE). <ol><li> Euthanize o rato com uma overdose de pentobarbital de sódio e monitorar reflexos nos membros. Uma vez que todos os reflexos cessaram, cortar a cabeça do rato, utilizando uma guilhotina. </li><li> Cuidadosamente separar os músculos e outros tecidos do crânio utilizando um bisturi. Use uma pinça de corte de osso para quebrar o crânio para expor o cérebro, a partir da base do crânio (buraco occipital) para a porção anterior. </li><li> Uma vez que o cérebro é exposto, colher-a cuidadosamente com uma espátula cirúrgica e colocar imediatamente em gelo seco esmagado para o flash de congelamento. NOTA: O cérebro vai ser muito maleável. Portanto, tome cuidado extremo ao colocar o cérebro emgelo seco. Se o cérebro é esmagado ou pressionado de encontro a uma superfície, que vai alterar a sua forma e congelar nessa posição. </li></ol></li><li> Remover o tecido fresco congelado (não perfundidos com formaldeído ou incorporado em OCT) de - 80 ° C freezer e colocar no gelo seco. </li><li> Coloque algumas gotas de água sobre um suporte de criostato e colocar em gelo seco ou barra de congelamento criostato. Imprensa tecido levemente no suporte criostato, uma vez que começa a congelar e segure até que a água congela em torno da base do tecido e ancora-lo no lugar. Adiciona-se água adicional para proteger ainda mais o tecido sobre o titular, se necessário. NOTA: A água é utilizada, em vez de meios de outubro de tecido de montagem, a fim de evitar a contaminação do tecido com os compostos que podem afectar a detecção do sinal desejado. </li><li> tecidos posição no criostato. Secção de tecido até ao local anatómico desejado. Certifique-se de que a espessura de corte é entre 8-12 mm. NOTA: Quando o corte de tecidos em criostato comunaldispositivos, é imperativo que os materiais separados, tais como lâminas, escovas, barras estabilizadoras, e os titulares de ser utilizada, a fim de evitar a contaminação com a incorporação de compostos. O interior do criostato também devem ser limpos cuidadosamente com etanol antes do uso. </li><li> Usando a barra anti-roll criostato, lentamente secção achatada secções de tecido. Furos ou marcas no tecido pode ocorrer se a colocação de barra de rolo está incorreto ou lâmina é maçante. Mova o tecido para o centro de cortar plataforma, usando pincéis limpos. </li><li> Montagem <ol><li> Congelar lâminas condutoras ou placas de metal, colocando-os no criostato, enquanto cortando. Quando o slide é completamente congelado, mova com cuidado o tecido seccionado para a superfície condutora da lâmina utilizando pincéis limpos. Uma vez que todas as secções de tecido são posicionados corretamente no slide, coloque um dedo sob o slide, em frente ao tecido, e pressione até que a secção descongela. NOTA: As Secções podem dobrar ou enrolar-se durante o processo de descongelamento quandousando este método de montagem. Este pode ser reduzido, mantendo a corrediça no criostato quando o descongelamento do tecido. Se estas questões tornar-se problemática, uma alternativa, warm-mount método é listado abaixo. </li><li> Alternativamente, dê uma temperatura ambiente de índio-estanho Oxide (ITO) de slides (ou placa de metal) e pressione levemente para baixo na seção de tecido congelado na superfície da plataforma do corte, o lado condutora para baixo. Isto conduzirá à secção de tecido descongelamento uniformemente sobre a superfície da lâmina com pouco de ondulação ou a dobragem do tecido. NOTA: A condensação pode aparecer abaixo da seção na montagem usando este método que pode levar a perda de certas proteínas e lipídios. </li></ol></li><li> Colocar as lâminas com o tecido em um exsicador para 5 - 10 min. </li></ol> 2. sublimador Aparelho Set-up NOTA: Execute estas etapas em um exaustor. <ol><li> Coloque um banho de areia num recipiente de alumínio em um prato quente, com a placa quente em um elevador de metal tesourade área de superfície adequado (por exemplo maior do que a placa quente). Ligar a placa de aquecimento e ajustar a temperatura para 140 ° C. NOTA: O ponto de fusão para a matriz DAN é entre 187-190 ° C. Não exceda esta temperatura sobre a placa. <ol><li> Se a placa de aquecimento está equipado com uma sonda de realimentação de temperatura, usá-lo para monitorar a temperatura de areia ao longo da experiência e assegurar a consistência da temperatura. Esse recurso pode ajudar com reprodutibilidade experiência em vários experimentos de sublimação. NOTA: O banho de areia deve ser contido dentro de um recipiente de alumínio como um recipiente de vidro pode se quebrar a altas temperaturas. </li></ol></li><li> Coloque 300 mg de matriz de DAN sobre a superfície inferior do aparelho de sublimação. Coloque a matriz no centro do aparelho e espalhar-se numa camada uniforme na largura e no comprimento da lâmina aproximada sendo sublimada. CUIDADO: matriz DAN é tóxico. Portanto, é importante usar luvas, máscaras, e segurançaóculos de proteção em todos os momentos ao manusear a matriz em pó. DAN devem ser armazenadas no escuro, pois é sensível à luz. </li><li> Tape uma placa de metal para a superfície interior do aparelho, com a placa que faz contacto directo com o fundo do condensador, de modo a assegurar uma distribuição uniforme da temperatura de arrefecimento através de toda a superfície da lâmina durante a sublimação. Alternativamente, a areia do fundo do condensador para assegurar uma superfície plana. <ol><li> Colocar a fita ao longo das bordas exteriores da placa e aderir aos lados do material de vidro interior. Se a fita adesiva é colocada sob a placa e adere à parte inferior da superfície de vidro interior, a distribuição de temperatura pode não ser uniforme e pode resultar na distribuição desigual da matriz sobre a superfície da lâmina. </li><li> Tape um espaço em branco (teste) deslize em diagonal através da superfície da placa de metal com a fita de novo colocada sobre os bordos exteriores da corrediça. </li></ol></li><li> Ligar as porções superior e inferior do aparelho, Wom uma borracha O-ring no meio para assegurar uma vedação completa. </li><li> Coloque um metal L-articular em torno do centro do aparelho e apertar vícios até a metade superior e inferior do aparelho são hermeticamente fechadas em conjunto. Colocar no metal de O-ring acima do banho de areia. </li><li> Pegue um punhado de gelo picado e colocá-lo no condensador. Preencha condensador de ¼ a ½ cheio com água fria para criar lama gelo. A lama de gelo irá arrefecer a placa de metal no interior do aparelho e subsequentemente a corrediça aderida a ela. Espere pelo menos 5 minutos para que a temperatura chegar a um estado estacionário. </li><li> Pour 300 ml de etanol no recipiente armadilha fria e colocar o material de vidro para dentro do recipiente. Redução de 2 - 3 pequenos pedaços de gelo seco, para o etanol na parte inferior do recipiente armadilha fria. A entrada de câmara de frio tem um tubo de vidro de correr para o fundo do cilindro, enquanto que a saída não. </li><li> Ligue a bomba de vácuo para a saída de câmara de frio utilizando tubos de borracha. Use outro pedaço de borrachatubagem de entrada para ligar a câmara de frio para o aparelho de sublimação. Certifique-se de que o tubo esteja bem preso com grampos de metal, se disponível. </li><li> Utilizar a bomba de vácuo para proporcionar um vácuo de 30 - 50 mT. Deixe a bomba funcionar durante pelo menos 5 minutos para equilíbrio de pressão. Vícios de L-anel de aparelho de sublimação pode ter que ser novamente apertados uma vez que a bomba de vácuo é ligada por causa da diminuição da pressão no aparelho. NOTA: É altamente recomendável que um indicador de vácuo ser ligado à bomba para monitorar a pressão de vácuo durante a experiência e para testar a existência de fugas de pressão, a fim de alcançar a mais alta reprodutibilidade possível entre experiências. No entanto, a maioria das bombas são concebidos para manter uma pressão constante, por conseguinte, o medidor pode não ser essencial que os utilizadores experientes. Além disso, o selo de vácuo gordura podem ser usadas para ajudar a manter a pressão de vácuo. </li></ol> 3. A sublimação <ol><li> Certifique-se de que a temperatura do banho de areia tem stabilizado a 140 ° C e que o aparelho é fixado no metal de O-ring acima do banho de areia com toda a tubagem ligado e o vácuo ligada. </li><li> Definir temporizador para 7 min, mas não iniciar o temporizador. Lentamente levantar o elevador de tesoura e areia banho até o aparelho de sublimação até o U-conjunta do sublimador está bem acima do metal O-ring. Este espaço extra permite o ajuste do aparelho sobre a areia. <ol><li> Pressione rapidamente a sublimador suavemente na superfície da areia para garantir que o aparelho está sentado uniformemente sobre a areia, e em seguida, iniciar imediatamente o temporizador. </li></ol></li><li> Quando o temporizador soa, desligue a bomba de vácuo e baixe cuidadosamente o elevador de tesoura até o sublimador não está tocando o banho de areia e está bem presa no metal O-ring. <ol><li> Lentamente solte a válvula de micro-vent para liberar a pressão no aparelho. Solte a braçadeira de metal ao redor do tubo de borracha do aparelho sublimação e lentamente começam a soltar o tubo. Uma vez que o rubber tubo foi afrouxado ligeiramente, dobrar o tubo de um lado para permitir que a pressão residual de escapar. </li><li> Quando os retornos de pressão ambiente, remova cuidadosamente o tubo de borracha do aparelho sublimação. </li></ol></li><li> Solte os vícios do U-joint do aparelho e remover. Cuidadosamente separar as duas metades do aparelho de sublimação e retirar o slide a partir do topo do objeto de vidro interior. Examina a corrediça para confirmar a distribuição uniforme da matriz. NOTA: Se a matriz é desigual, a matriz em pó na parte inferior da sublimador pode ser reposicionada ou sublimador o aparelho pode ser reposicionada na areia para o slide seguinte. O processo de sublimação pode ser repetido várias vezes utilizando a mesma matriz, no entanto, a matriz acabará por se tornar mais escura por exposição repetida de calor e a quantidade de pó irá diminuir de tal forma que o tempo de sublimação terá de ser ligeiramente ajustados para compensar. Por esta razão, é importante controlar a quantidade de matriz being sublimou após cada experimento para assegurar a coerência na deposição de matriz entre os slides </li><li> Se a distribuição e quantidade de matriz sublimada é suficiente, grave um novo slide com o tecido para o interior da Secção sublimador e repita 3. NOTA: Para o controlo de qualidade (QC) fins, a quantidade de matriz sublimado pode ser medida após cada experiência por pesagem do diapositivo antes e após sublimação e dividindo o peso da matriz sublimada com a área de superfície da lâmina 2, deve notar-se que devido à falta de precisão da maioria das escalas além de 4 pontos decimais e variabilidade entre escalas, estas medidas devem ser ser usado apenas um guia para a deposição de matriz ideal em oposição a um meio totalmente quantificáveis de QC a menos que uma balança de alta precisão é usado (veja a Figura 3). </li></ol> 4. Tissue Armazenamento / Reidratação <ol><li> Depois de sublimação, loja desliza em um recipiente fechado ou pequena cassette em saco plástico selado. </li><li> Incubar as lâminas em freezer -20 ° C durante 2 h ou durante a noite. NOTA: O objectivo do processo de congelação é de actuar como um passo de re-hidratação para a dessorção de materiais de tecido no interior da matriz. O processo de congelamento também tem sido demonstrado para prevenir a degradação de sinais de lípidos durante até 1 semana, quando armazenados a -80 ° C 12. Por esta razão, a quantidade de tempo que as amostras são armazenadas em congelador pode ser variado em certa medida de acordo com as necessidades do experimentador, sem alterar de forma significativa a detecção de sinal (como observado no nosso laboratório). No entanto, temos notado alguma descoloração da matriz quando as amostras são congeladas por mais de 24 h a -20 ° C. Assim, recomendamos a imagiologia do tecido sublimado antes que o tempo ou o armazenamento de tecido a -80 ° C durante períodos de incubação mais longos. </li><li> Retirar as lâminas do congelador (e recipiente) e coloque em um secador durante 5 - 10 min. </li></ol> 5. Imaging and Análise <ol><li> Remover as lâminas da exsicador e aplicar normas de instrumentos para garantir a precisão massa de instrumento MALDI durante o exame. O tipo de padrões irá variar em função da instrumentação. Os padrões são geralmente aplicadas uniformemente ao longo de toda corrediça, em torno de tecido a ser visualizado (Figura 3D). </li><li> Inserir slide em instrumento MALDI e siga as instruções do fabricante para experimentos com imagens (métodos instrumento deve ser otimizado para um 1000 - faixa de massa 2,000). Resultado representativo (Figura 4) foi obtido em modo de reflectrão negativo com uma quadrícula de 70 uM e 20 disparos / espectro (aquisição em tempo ~ 2 h). </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este trabalho detalha um protocolo padronizado de sublimação matriz em tecidos para a detecção de lípidos carregados negativamente, tais como gangliósidos, em experimentos MALDI IMS. A preparação da amostra para MALDI IMS é altamente variável e deve ser personalizado para atender as propriedades únicas do analito de interesse. A aplicação da matriz sobre a superfície da amostra de tecido é um aspecto essencial do processo de preparação da amostra que diz respeito à qualidade dos resultados em IMS. Um cuidado especial de...

laser assistida por matriz de Dessorção / ionização (MALDI) Imagiologia espectrometria de massa (IMS) está a tornar-se uma técnica muito procurado para a visualização da distribuição espacial dos lípidos, péptidos e proteínas através de superfícies intactas de amostra. MALDI IMS foi anteriormente conhecido como uma técnica analítica para analitos pré-purificado, mas em anos recentes, tem-se chamar a atenção em muitas outras disciplinas por causa da capacidade de combinar a precisão de espectrometria de massa com pontos de referência de alta resolução visuais / anatómicas sem a precisa para qualquer rotulagem externo. Como a associação científica dos investigadores que utilizam esta técnica continua a crescer, há um aumento da necessidade de protocolos, fácil de seguir normalizados para auxiliar no desenvolvimento e optimização das experiências IMS. Os gangliósidos, um grupo de lípidos da membrana altamente abundantes no sistema nervoso central, são ideais para experiências MALDI IMS como a sua localização, incorporado no interior da membrana, faz certa especificidadees impossível detectar utilizando Imuno-rotulagem convencional. Adicionalmente, temos mostrado, utilizando MALDI IMS, de que estes lípidos, que funcionam como moduladores da sinalização celular, entre outras coisas, têm perfis de distribuição anatómica original no cérebro de roedores saudáveis que são modificadas após a lesão cerebral 3, 4, 5. Os gangliósidos estão localizados a uma gama de massa mais elevada em comparação com a maioria das espécies de lípidos, e são, assim, mais adequado para a plataforma de imagem MALDI. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig1.jpg" /> Figura 1: Fluxo de trabalho de MALDI IMS Experiment. Diagrama do fluxo de trabalho geral de uma experiência MALDI IMS usando sublimação. Tecido congelado a -80 ° C é seccionado num criostato e 10 uM secções são montadas em lâminas de degelo ITO condutoras. A lâmina é então colocado num excicador até sublimação. Slides são inseridas no aparelho de sublimação e mesmo uma camada de matriz é aplicada à superfície da amostra de tecido. As amostras são congeladas durante a noite num congelador a -20 ° C e depois colocada num excicador durante 10 minutos. Uma vez que tenham sido aplicados os padrões, as amostras são inseridas no instrumento MALDI onde um laser é dirigido através do tecido, causando moléculas dessorvidas na matriz para ionizar. Os íons de viajar para baixo um tubo de vôo e separada com base em sua massa (time-of-flight / TOF) até chegar ao detector. A informação sobre a abundância iónica de analitos num (m / z) gama predeterminada de massa-carga é apresentada como uma imagem de ambos molecular e espectro de massa. Estes dados podem ser utilizados para visualizar e quantificar tanto a abundância iónica do analito de interesse dentro do tecido impressa. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Preparação de amostrapara MALDI IMS é altamente variável à medida que cada etapa do processo deve ser personalizado para os analitos de interesse. A característica definidora de experiências baseadas em MALDI é o uso de um revestimento de matriz depositada sobre a superfície da amostra antes da análise. Em adição à função de absorver e transferir energia de radiação do laser durante o processo de ablação, a matriz também serve para isolar vários analitos a partir da amostra, facilitando assim a análise de compostos de interesse 6, 7. aplicação homogénea da matriz para a superfície da amostra é a etapa mais importante no processo de preparação de amostras. Deposição de matriz inadequada pode levar a grandes formações heterogêneas cristal matriz e o desenvolvimento de artefatos, sinal de iões de baixa e pouca reprodutibilidade 7. Devido à afinidade de certas matrizes para isolar analitos específicos, do tipo de matriz seleccionado de um experimento podealterar significativamente o resultado. As matrizes utilizadas para geração de imagens de proteínas e péptidos são muitas vezes diferentes das utilizadas para a lípidos de imagem e o processo é ainda mais complicado pela necessidade de procedimentos adicionais, tais como passos de lavagem e re-hidratação, a fim de detectar sinais com sucesso a partir de tecido. Embora existam etapas de lavagem para o reforço de sinais de lipídios 8, eles não são um pré-requisito para a detecção da maioria das espécies de lipídios. Ao seleccionar uma matriz para uma experiência de imagem de lípidos, é importante ter em conta a polaridade do lípido de interesse como isso vai limitar a gama de matrizes adequadas. Por exemplo, gangliósidos contêm resíduos de ácido siálico, que lhes dão uma polaridade negativa global. Há um certo número de matrizes que podem eficazmente de s sorver e ionizar gangliósidos de tecido; No entanto, factores tais como picos de matriz derivada do espectro e estabilidade da matriz sob vácuo deve ser levado em consideração. 1,5-diaminonapthalene (DUma matriz) é suficientemente estável sob condições de vácuo instrumento para a maioria das aplicações de imagem e demonstrou um elevado grau de sensibilidade para a dessorção lipídica e pode ser utilizado para a análise de lípidos em ambos os modos de iões positivos e negativos 2. matriz DAN, quando comparada com outras matrizes de afinidade lipídica negativa, tais como o ácido di-hidroxibenzóico (DHB), 9-aminoacridina (9-AA), e 5-cloro-2-mercaptobenzotiazole (CMBT), foi capaz de dessorver mais eficientemente gangliosidos de cérebro de rato tecido no modo de iões negativos (manuscrito em preparação). Selecionando o método adequado para a deposição de matriz é de igual importância para a seleção da própria matriz. métodos de deposição de matriz molhado em que a matriz sólida é dissolvido num solvente orgânico, e depositadas por pneumático ou pulverizadores ou observadores automatizadas, são particularmente eficazes para a dessorção de proteínas e péptidos como o líquido penetra a amostra para permitir adicionalcção de compostos e de co-cristalização com a matriz. Embora estas técnicas também podem ser usados para aplicações de lipídios, deslocalização de analitos e formações de cristal da matriz irregular são ocorrências comuns devido à grande abundância e solubilidade de lipídios na solventes, particularmente no tecido 2, 9. Porque os lípidos são prontamente ionizadas a partir de tecidos, técnicas de deposição de matriz seco, tal como a sublimação, oferecem uma alternativa de custo simples, eficaz para pulverizadores, contornando muitos dos desvantagem destas técnicas. O sucesso da sublimação em experiências MALDI IMS é atribuído a funções tais como a morfologia da matriz microcristalina que aumenta a área de superfície para a matriz de ligação para a substância analisável, o aumento da pureza da matriz, e deposição de matriz homogénea que conduzem ao aumento da reprodutibilidade da matriz em comparação com as técnicas sanitária 1, 10. invo sublimaçãoLves aquecimento de uma matriz em pó sob vácuo imediatamente abaixo de uma superfície de uma amostra arrefecida resultante em sólido de transição de fase gasosa da matriz em pó seguido de deposição sobre a superfície da amostra de tecido. Durante a sublimação, a deposição de matriz pode ser controlada por factores variáveis, tais como tempo, temperatura e pressão para proporcionar resultados altamente reprodutíveis. Uma experiência única sublimação pode levar de 5 a 20 minutos, dependendo do tipo de matriz seleccionado, o qual pode ser re-utilizada várias vezes antes da sua eliminação. O aparelho pode ser adquirido comercialmente a uma fracção do preço de pulverizadores automáticos e é facilmente desmontado para limpeza e manutenção. O baixo custo e relativa simplicidade dessa técnica deposição de matriz tornam ideal para pesquisadores iniciantes ou expandindo aplicações de imagem lipídico em MALDI IMS. Embora a informação detalhando protocolos para a sublimação dos tecidos para IMS foram relatados 11, alguns protocolos padronizados existem which focar o fluxo de trabalho básico envolvido com a realização de um experimento de sublimação para imagiologia lipídios de alta massa no modo de iões negativos, o que torna difícil estabelecer a técnica sem extensa tentativa e erro. O que se segue é um protocolo experimental com o objetivo de preencher essa lacuna para a sublimação da matriz DAN em secções de cérebro de rato para imagens de alta resolução e detecção de gangliosídeos. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig2.jpg" /> Figura 2: A sublimação Aparelho. A fotografia (A) e diagrama esquemático (B) do aparelho de sublimação. A bomba de vácuo ligada a um tubo de borracha para uma armadilha fria cheio com 300 ml de etanol. A câmara de frio é então ligado por tubos de borracha para o aparelho de sublimação. O aparelho é constituído por duas peças separadas de material de vidro que são seladas juntamente com um metal de L-articular. A metade superior da sublimadorcontém o condensador que é enchido com lama de gelo. A placa de amostra é gravado na parte inferior do condensador, no interior do aparelho de vidro selado. A metade inferior do aparelho de sublimação contém a matriz DAN, espalhar-se uniformemente em frente da placa de amostra. Durante a sublimação, o aparelho de vidro é colocada sobre um banho de areia aquecida a 140 ° C por uma placa quente directamente por baixo dele. A sonda de temperatura ajuda a manter uma temperatura estável durante todo o experimento sublimação através de realimentação da temperatura do banho de areia em comparação com a temperatura predefinida para o experimento. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Sublimator</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG3038-01</td><td></td></tr><tr><td>1,5-Diaminonaftaleno (DAN) matriz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D21200&nbsp;</td><td>100 gramas</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td></td><td>CryoStar NX50</td></tr><tr><td>Placa quente com feedback de temperatura</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>HP88857290</td><td>Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V</td></tr><tr><td>Macaco de Aço Inoxidável</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>2216479</td><td>10x10</td></tr><tr><td>Cold Trap</td><td></td><td></td><td>Bomba de vácuo personalizada no local</td></tr><tr><td>Franklin</td><td>Electric</td><td>1102180403</td><td>Savant VP100</td></tr><tr><td>Slides de óxido de índio-estanho (ITO)</td> de dois estágios <td>Tecnologia de superfície Hudson</td><td>PSI 1111000</td><td>tipo II, 1,1 mm/25 cada</td></tr><tr><td>MALDI TOF/TOF 5800 Instrumento</td><td>AB Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dessecador</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2797</td><td>dessecador de mesa</td></tr></tbody></table>

sublimação da dan matrix para a detecção e visualização de gangliosídeos no cérebro de um rato do tecido por maldi imagem espectrometria de massa

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

A preparação da amostra é a chave para a detecção e a visualização de analitos em experiências com laser assistida por matriz de Dessorção / ionização (MALDI) Imagiologia espectrometria de massa (IMS) óptima. Determinação do protocolo apropriado para seguir em todo o processo de preparação da amostra pode ser difícil já que cada passo tem de ser optimizado para satisfazer as características únicas dos analitos de interesse. Este processo envolve não só em encontrar uma matriz compatível que pode desorver e ionizam as moléculas de interesse de forma eficiente, mas também seleccionar a técnica de deposição de matriz apropriada. Por exemplo, uma técnica de deposição húmida da matriz, o que implica a dissolução de uma matriz no solvente, é superior para a dessorção da maior parte das proteínas e péptidos, enquanto que as técnicas de deposição de matriz secas são particularmente eficazes para a ionização de lípidos. A sublimação foi classificado como um método altamente eficiente de deposição da matriz seco para a detecção de lípidos no tecido por MALDI IMS devido à homogeneity de deposição de cristais de matriz e mínima deslocalização analito, em comparação com muitos métodos de deposição molhadas 1, 2. Em termos gerais, que envolve colocar uma amostra em pó e a matriz em uma câmara de vácuo com as amostras pressionada contra uma superfície fria. O aparelho é então reduzido para um banho aquecido (areia ou óleo), resultando em sublimação da matriz em pó sobre a superfície da amostra de tecido arrefecida. Descrevemos aqui um protocolo de sublimação utilizando 1,5-diaminonaftaleno matriz (DAN) para a detecção e a visualização de gangliósidos no cérebro de rato utilizando MALDI IMS.

Após a conclusão da experiência sublimação, as duas metades do aparelho de vidro estão separadas no exaustor de fumos e a corrediça, gravado para o condensador, pode ser removida (Figura 3A). Neste ponto, a lâmina deve ser examinada para a distribuição desigual de matriz e o tempo, a temperatura, ou a colocação do aparelho em banho de areia pode ter que ser ajustada para o slide seguinte. Um experimento sublimação DAN bem sucedido resultará num revestimento uniforme da m...

Um protocolo para a sublimação da matriz DAN no tecido cerebral de ratos para a detecção de gangliosídeos usando espectrometria de massa de imagem MALDI é apresentado.

Sublimação da DAN Matrix para a Detecção e Visualização de gangliosídeos no cérebro de um rato do tecido por MALDI imagem Espectrometria de Massa

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

O objetivo geral deste protocolo de sublimação é fornecer um processo detalhado e de fácil execução para a preparação de amostras, destinado à detecção de gangliosídeos em experimentos de espectrometria de massas com imagem MALDI. Este método pode auxiliar na resposta de questões fundamentais na área de neurobiologia, incluindo a distribuição anatômica e a função dos gangliosídeos, tanto no cérebro saudável quanto em condições patológicas cerebrais. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser adaptada para a obtenção de imagens de alta qualidade de diversas espécies lipídicas com poucas alterações no protocolo.Para iniciar este procedimento, extraia o tecido cerebral do rato e prepare-o para o criostato conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, posicione o tecido no criostato. Seccione o tecido até a localização anatômica desejada.Certifique-se de que a espessura de corte esteja entre oito e 12 mícrons. Usando a barra anti-rolamento do criostato, seccione lentamente a seção de tecido achatado. Podem ocorrer furos ou marcas no tecido se o posicionamento da barra de rolamento estiver incorreto ou se a lâmina estiver desgastada.Transfira o tecido para o centro da plataforma de corte usando pincéis limpos. Para mapear o tecido, congele lâminas condutoras ou placas metálicas colocando-as no criostato durante o corte. Quando a lâmina estiver completamente congelada, transfira cuidadosamente o corte do tecido para a superfície condutora da lâmina usando pincéis limpos.Uma vez que todas as seções de tecido estejam posicionadas corretamente sobre a lâmina, coloque um dedo sob a lâmina, do lado oposto ao tecido, e pressione até que a seção descongele. Em seguida, coloque as lâminas com o tecido em um dessecador por cinco a dez minutos. Alternativamente, utilize uma lâmina aquecida e pressione-a levemente, com o lado condutor voltado para baixo, contra as seções de tecido achatadas.Trabalhando na câmara de exaustão, coloque um banho de areia em um recipiente de alumínio sobre uma placa aquecedora. A placa aquecedora deve estar sobre um elevador metálico articulado com área de superfície apropriada. Ligue a placa aquecedora e ajuste a temperatura para 140 graus Celsius.Utilize a sonda de realimentação de temperatura para monitorar a temperatura da areia durante todo o experimento e garanta a consistência térmica. Em seguida, coloque 300 miligramas da matriz DAN na superfície inferior do aparelho de sublimação. Espalhe a matriz em uma camada uniforme no centro do aparelho, com largura e comprimento aproximados do lâmina que será sublimada.Coloque uma placa de metal na superfície interna do aparelho, de modo que a placa entre em contato direto com a base do condensador. Fixe um lâmina de teste em branco diagonalmente sobre a superfície da placa de metal, utilizando fita nas bordas externas da lâmina. Conecte as partes superior e inferior do aparelho com uma junta de borracha em forma de O no centro, para garantir um selamento completo.Coloque uma junta metálica em formato de U ao redor do centro do aparato e aperte as mordentes até que a metade superior e a metade inferior do aparato estejam firmemente seladas. Em seguida, coloque o aparato dentro da junta metálica em forma de anel ao redor do banho de areia. Depois, coloque uma quantidade de gelo picado no condensador.Encha o condensador até um quarto ou metade da capacidade com água fria para criar uma mistura de gelo. A mistura de gelo resfriará a placa metálica na parte interna do aparelho e, consequentemente, a lâmina aderida a ela. Aguarde pelo menos cinco minutos para que a temperatura atinja um estado estável.Em seguida, despeje 300 mL de metanol no recipiente do armadilha fria e coloque a vidraria dentro do recipiente. Conecte a bomba de vácuo à saída da armadilha fria utilizando uma mangueira de borracha. Use outra mangueira de borracha para conectar a entrada da armadilha fria ao aparelho de sublimação.Certifique-se de que o tubo esteja firmemente preso usando braçadeiras metálicas. Use a bomba de vácuo para aplicar um vácuo de 30 a 50 militorr. Deixe as bombas funcionando por pelo menos cinco minutos para a equilibração da pressão.Coloque duas a três pequenas peças de gelo seco no etanol, na parte inferior do recipiente da armadilha fria. A armadilha fria ajuda a impedir que partículas da matriz se acumulem na bomba de vácuo. Os grampos no anel em U do aparelho de sublimação podem precisar ser apertados assim que a bomba de vácuo for ligada, devido à diminuição da pressão no aparelho.Certifique-se de que a temperatura do banho de areia esteja estável em 140 graus Celsius. Verifique também se o vácuo está ligado e se o aparelho está fixado no anel metálico acima do banho de areia, com todas as tubulações conectadas. Ajuste o temporizador para sete minutos, mas não inicie o temporizador.Eleve lentamente o elevador de tesoura e o banho de areia até o aparato de sublimação, até que o junção-em-U do sublimador esteja bem acima do anel metálico em O. Esse espaço extra permite o ajuste do aparato sobre a areia. Pressione rapidamente o sublimador suavemente contra a superfície da areia para garantir que o aparato esteja assentado de maneira uniforme sobre a areia.Em seguida, inicie imediatamente o cronômetro. Quando o cronômetro soar, desligue a bomba de vácuo e abaixe cuidadosamente o elevador de tesoura até que o sublimador não esteja mais tocando o banho de areia e esteja firmemente apoiado no anel metálico em forma de O. Abra lentamente a válvula de microventilação para liberar a pressão no aparelho.Solte o grampo metálico ao redor da tubulação de borracha do aparelho de sublimação e comece lentamente a afrouxar o tubo. Assim que o tubo de borracha estiver ligeiramente solto, dobre-o para um dos lados para permitir que a pressão residual escape. Quando a pressão ambiente for restabelecida, remova cuidadosamente a tubulação de borracha do aparelho de sublimação.Em seguida, solte as morsas na junta universal do aparelho e remova-as. Separe cuidadosamente as duas metades do aparelho de sublimação e retire a lâmina da parte superior do vidro interno. Examine a lâmina para confirmar a distribuição uniforme da matriz.Se a distribuição e a quantidade de matriz sublimada forem suficientes, fixe um novo lâmina com o tecido no interior do sublimador e repita o processo de sublimação. Prossiga para realizar a obtenção de imagens e análise conforme descrito no protocolo textual. O espectro de massa exibe a abundância iônica de anólitos dentro de uma faixa de massa de 1000 a 2000.Os principais gangliosídeos da série A estão identificados ao longo do espectro. É mostrada aqui a imagem molecular correspondente de gangliosídeos no cérebro de rato. A imagem molecular mostra a distribuição anatômica de várias espécies de gangliosídeos por meio de codificação por cores, que foram sobrepostas e pseudocoloridas usando o software ImageJ.Em geral, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades, pois existem muitas variáveis no processo de preparação da amostra que podem influenciar a qualidade dos resultados de IMS e que muitas vezes são omitidas nos protocolos relatados. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de monitorar a quantidade de matriz sendo sublimada após cada experimento e modificar o tempo de sublimação de acordo com a lâmina. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para que pesquisadores explorassem o papel dos lipídios da membrana, como os gangliosídeos, após lesão cerebral, doença de Ner-jone e o processo natural de envelhecimento.Embora este método possa fornecer informações sobre a abundância e distribuição anatômica de lipídios no cérebro, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, incluindo tecidos fora do cérebro e até modelos de plantas e insetos. Trabalhar com raízes danificadas pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de luvas, máscaras e proteção ocular devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

sublimation-dan-matrix-for-detection-visualization-gangliosides-rat

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Farmacoterapia de reposição de dopamina uso de L-DOPA é o tratamento mais comumente utilizado sintomático da doença de Parkinson, mas é acompanhado por efeitos secundários, incluindo movimentos involuntários anormais, discinesia...

Espectrometria de Massa MALDI imagem de neuropeptídeos na Doença de Parkinson

Um método específico e sensível para obter informações sobre o perfil de expressão de antígenos glicoesfingolipídeos em órgãos e células do sistema imunológico é descrito. O método tira partido da espectrometria de massa de iões armadilha permitindo passo a passo de fragmentação de moléculas de glicoesfingolipídeos para análise estrutural em comparação com padrões de síntese química.

Análise por espectrometria de massa de Antígenos glicoesfingolipídeos

Ditranol (DT; 1,8-di-hidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) foi previamente relatada como uma matriz de DLAMI para a imagiologia de tecido de pequenas moléculas; protocolos para a utilização de DT para a imagiologia de MALDI de lípidos endógenos na superfície de cortes de tecido por positivo-ion MALDI-MS em um ultra-alta resolução quadrupolo-FTICR instrumento são fornecidos aqui.

Dithranol como Matrix Assisted Laser Matrix para dessorção / ionização de imagem em um Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Uma fonte de imagem de espectrometria de massa (MSI) operada à pressão atmosférica foi desenvolvida acoplando dessorção a laser de infravermelho médio e pós-ionização por eletrospray. A matriz de gelo exógena foi usada como matriz de absorção de energia para facilitar a dessorção ressonante do material relacionado ao tecido. Este manuscrito fornece um protocolo passo a passo para a realização de IR-MALDESI MSI de camundongos neonatais de corpo inteiro.

Whole-body Espectrometria de Massa de imagem por infravermelhos matriz assistida por laser de Dessorção Ionização por Electrospray (IR-MALDESI)

Imagem molecular com laser assistida por matriz baseada em ionização/dessorção de imagem espectrometria de massa (MALDI-IMS) permite o mapeamento simultâneo de vários analitos em amostras biológicas. Aqui, apresentamos um protocolo para a detecção e visualização da proteína β amiloide nos tecidos do cérebro de doença de Alzheimer e amostras de Angiopatia amiloide cerebral usando MALDI-IMS.

Visualização dos depósitos β amiloide no cérebro humano com Matrix-assisted Laser dessorção/ionização de imagem espectrometria de massa

O objetivo deste protocolo é fornecer orientação detalhada sobre a preparação da amostra ao planejar experimentos usando MALDI MSI para maximizar a detecção metabólica e molecular em amostras biológicas.

Preparação de amostras para perfil metabólico usando imagem de espectrometria de massa MALDI

Gangliosides são glicósfoliópidos portadores de ácido sálico que são particularmente abundantes no cérebro. Sua natureza anfíppática requer técnicas orgânicas/aquosas de extração e purificação para garantir uma recuperação ideal e análises precisas. Este artigo fornece visões gerais da extração de ganglioside em escala analítica e preparatória, purificação e análise de cromatografia de camada fina.

Extração de ganglioside, purificação e perfil

Um método avançado foi desenvolvido para imagens por espectrometria de massa (MSI) de organoides cerebrais que permite mapear distribuições de metabólitos dentro desses modelos. Essa tecnologia oferece insights sobre as vias metabólicas do cérebro e assinaturas de metabólitos durante o desenvolvimento inicial e na doença, prometendo uma compreensão mais profunda da função cerebral humana.

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Este protocolo descreve o uso de microMS para espectrometria de massa MALDI-2 de célula única guiada por fluorescência, permitindo um perfil molecular aprimorado de células neuronais primárias de ratos.

Dessorção/ionização a laser assistida por matriz guiada por fluorescência com espectrometria de massa de postionização induzida por laser de células neurais de ratos individuais

Este protocolo detalha os passos principais para permitir uma medição rigorosa e reprodutível tanto do glicogênio quanto dos glicanos N-ligados por meio de imagens por espectrometria de massas.

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Aprenda a sublimação da matriz DAN para detecção de gangliosídeos em tecido cerebral de rato por espectrometria de massa MALDI. Este método avança pesquisas em neurobiologia e doenças neurológicas.

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Sublimação da DAN Matrix para a Detecção e Visualização de gangliosídeos no cérebro de um rato do tecido por MALDI imagem Espectrometria de Massa

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