Sublimação da DAN Matrix para a Detecção e Visualização de gangliosídeos no cérebro de um rato do tecido por MALDI imagem Espectrometria de Massa

O objetivo geral deste protocolo de sublimação é fornecer um processo de preparação de amostra detalhado e fácil de seguir, para a detecção de gangliosídeos em experimentos de espectrometria de massa de imagem MALDI. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurobiologia, incluindo a distribuição anatômica e a função dos gangliosídeos, tanto no cérebro saudável quanto na patologia cerebral. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser adaptada para imagens de alta qualidade de muitas espécies lipídicas, poucas alterações no protocolo.

Para iniciar este procedimento, extraia o tecido cerebral do rato e prepare-se para o criostato conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, posicione o tecido no criostato. Corte o tecido até o local anatômico desejado.

Certifique-se de que a espessura de corte esteja entre oito e 12 mícrons. Usando a barra estabilizadora do criostato, corte lentamente a seção de tecido achatado. Furos ou marcações no tecido podem ocorrer se o posicionamento da barra de rolagem estiver incorreto ou se a lâmina estiver cega.

Mova o tecido para o centro da plataforma de corte usando pincéis limpos. Para mapear o tecido, congele lâminas condutoras ou placas de metal colocando-as no criostato durante o corte. Quando a lâmina estiver completamente congelada, mova cuidadosamente o tecido da seção para o serviço condutor da lâmina usando pincéis limpos.

Depois que todas as seções de tecido estiverem posicionadas corretamente na lâmina, coloque um dedo sob a lâmina oposta ao tecido e pressione até que a seção descongele. Em seguida, coloque as lâminas com tecido em um dessecador por cinco a 10 minutos. Como alternativa, use uma lâmina quente e pressione-a levemente, com o lado condutor voltado para baixo, contra as seções de tecido achatadas.

Trabalhando na hotte, coloque um banho de areia em um recipiente de alumínio em uma placa de aquecimento. A placa de aquecimento deve estar em um elevador de tesoura de metal com a área de superfície apropriada. Ligue a placa de aquecimento e ajuste a temperatura para 140 graus Celsius.

Use a sonda de feedback de temperatura para monitorar a temperatura da areia durante todo o experimento e garantir a consistência da temperatura. Em seguida, coloque 300 miligramas de matriz DAN na superfície inferior do aparelho de sublimação. Espalhe a matriz em uma camada uniforme no centro do aparelho até a largura e o comprimento aproximados da lâmina que está sendo sublimada.

Coloque uma placa de metal na superfície interna do aparelho com a placa fazendo contato direto com o fundo do condensador. Prenda uma lâmina de teste em branco na diagonal e atravesse a superfície da placa de metal, com uma fita colocada nas bordas externas da lâmina. Conecte as partes superior e inferior do aparelho com um anel de vedação de borracha no meio para garantir a vedação completa.

Coloque uma junta em U de metal ao redor do centro do aparelho e aperte os tornos até que a metade superior e inferior do aparelho estejam bem vedadas. Em seguida, coloque o aparelho no O-ring de metal sobre o banho de areia. Em seguida, coloque um punhado de gelo picado no condensador.

Encha o condensador de um quarto a meio com água fria para criar lama de gelo. A lama de gelo resfriará a placa de metal no interior do aparelho e, posteriormente, a lâmina aderiu a ela. Aguarde pelo menos cinco minutos para que a temperatura atinja um estado estacionário.

Em seguida, despeje 300 mL de metanol no recipiente da armadilha fria e coloque a vidraria no recipiente. Conecte a bomba de vácuo à saída do purgador frio usando tubos de borracha. Use outro pedaço de tubo de borracha para conectar a entrada da armadilha fria ao aparelho de sublimação.

Certifique-se de que a tubulação esteja bem presa com braçadeiras de metal. Use a bomba de vácuo para fornecer um vácuo de 30 a 50 militorr. Deixe as bombas funcionarem por pelo menos cinco minutos para equilíbrio de pressão.

Coloque dois a três pequenos pedaços de gelo seco no etanol, no fundo do recipiente da armadilha fria. A armadilha fria ajuda a evitar que partículas de matriz se acumulem na bomba de vácuo. Os vícios no anel em U do aparelho de sublimação podem precisar ser apertados quando a bomba de vácuo é ligada devido à diminuição da pressão no aparelho.

Certifique-se de que a temperatura do banho de areia tenha se estabilizado em 140 graus Celsius. Verifique também se o aspirador está ligado e se o aparelho está preso no O-ring de metal acima do banho de areia com todos os tubos conectados. Defina o cronômetro para sete minutos, mas não inicie o cronômetro.

Levante lentamente o elevador de tesoura e o banho de areia até o aparelho de sublimação até que a junta em U do sublimador esteja bem acima do O-ring de metal. Este espaço extra permite o ajuste do aparelho na areia. Pressione rapidamente o sublimador suavemente na superfície da areia para garantir que o aparelho esteja assentado uniformemente na areia.

E então, inicie imediatamente o cronômetro. Quando o temporizador soar, desligue a bomba de vácuo e abaixe cuidadosamente o elevador da tesoura até que o sublimador não esteja mais tocando o banho de areia e assente com segurança no O-ring de metal. Afrouxe lentamente a válvula de microventilação para liberar a pressão no aparelho.

Afrouxe a braçadeira de metal ao redor do tubo de borracha do aparelho de sublimação e comece lentamente a soltar o tubo. Uma vez que o tubo de borracha tenha sido ligeiramente afrouxado, dobre o tubo para um lado para permitir que a pressão residual escape. Quando a pressão ambiente retornar, remova cuidadosamente o tubo de borracha do aparelho de sublimação.

Em seguida, afrouxe os vícios na junta em U do aparelho e remova-os. Separe cuidadosamente as duas metades do aparelho de sublimação e retire a corrediça da parte superior da vidraria interna. Examine o slide para confirmar a distribuição uniforme da matriz.

Se a distribuição e a quantidade de matriz sublimada forem suficientes, cole uma nova lâmina com tecido no interior do sublimador e repita o processo de sublimação. Prossiga para realizar imagens e análises conforme descrito no protocolo de texto. O espectro de massa exibe abundância iônica de anólitos dentro de uma faixa de massa de 1000 a 2000.

Os principais gangliosídeos da série A são marcados ao longo do espectro. Aqui é mostrada a imagem molecular correspondente dos gangliosídeos no cérebro do rato. A imagem molecular mostra a distribuição anatômica de várias espécies de gangliosídeos por meio de codificação de cores, que foram sobrepostas e pseudocoloridas usando o software ImageJ.

Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades, pois há muitas variáveis no processo de preparação da amostra que podem influenciar a qualidade dos resultados do IMS que muitas vezes são deixadas de fora dos protocolos relatados. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de monitorar a quantidade de matriz que está sendo sublimada após cada experimento e modificar o tempo de sublimação de acordo com o slide. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem o papel dos lipídios da membrana, como os gangliosídeos, após lesão cerebral, doença de ner-jone e o processo natural de envelhecimento.

Este método pode fornecer informações sobre a abundância e distribuição anatômica de lipídios no cérebro, também pode ser aplicado a outros sistemas, incluindo tecidos fora do cérebro e até modelos de plantas e insetos. Trabalhar com raízes danificadas pode ser extremamente perigoso e precauções como luvas, máscaras e proteção para os olhos devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.