Mapeando as Interações RNA-ARN Globalmente Usando Psoraleno Biotinilado

O objetivo geral deste vídeo é descrever o método de sequenciamento de híbridos ligados e selecionados reticulados com psoraleno ou SPLASH em que as interações RNA-RNA in vivo em pares são mapeadas de maneira genômica. Esta técnica é um método simples e de alto rendimento para mapear a interação do RNA in vivo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da genômica de RNA, como como diferentes regiões ao longo de uma única fita de RNA ou entre diferentes fitas de RNAs interagem umas com as outras.

Embora esse método possa fornecer informações sobre leveduras e células humanas, ele também pode ser aplicado a estudos em outros organismos modernos, incluindo bactérias e membranas nas células. Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando queríamos criar uma maneira de mapear a interação molecular. Observe que o procedimento a seguir contém vários pontos de parada.

Nesses momentos, o experimento pode ser pausado brevemente ou indefinidamente. Os detalhes podem ser encontrados no texto que acompanha. Comece este procedimento lavando as células HeLa duas vezes com cinco mililitros de PBS.

Coloque o prato verticalmente por um minuto para drenar completamente o excesso de PBS. Em seguida, adicione um mililitro de PBS contendo 200 psoraleno biotinilado micromolar e 0,01% de digitonina, o que aumenta a permeabilidade celular. Tome cuidado para adicionar a solução uniformemente sobre a superfície das células.

Incube a 37 graus Celsius por cinco minutos. Após a incubação, retire a tampa do prato e coloque-o no gelo dentro de um reticulador UV a três centímetros da lâmpada UV. Irradie com UV de 365 nanômetros por 20 minutos.

Após 20 minutos, remova o prato do reticulador e, em seguida, isole o fragmento e precipite o RNA das células HeLa de acordo com as instruções no documento anexo. Carregue amostras desnaturadas de escada e RNA em um gel quadrado de ureia de 6% TBE de 8,6 centímetros. Fracionamento de tamanho por eletroforese a 180 volts por 40 minutos.

Manchar o gel em 10 mililitros de tampão TBE contendo uma diluição de 1:10.000 de coloração de gel de ácido nucleico por cinco minutos no escuro. Enquanto o gel está manchando, use uma agulha de calibre 24 para perfurar um tubo de microfuga limpo de 0,6 mililitro na parte inferior. Coloque-o em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros.

Usando um transiluminador, visualize as bandas no gel pós-corado e corte uma fatia de gel correspondente a 90 a 110 nucleotídeos. Transfira a fatia de gel para o tubo de microfífugo de 0,6 mililitro perfurado no tubo de microfífugo de dois mililitros. A seleção do tamanho nos permite definir o comprimento mínimo para os fragmentos quiméricos e distinguir entre produtos ligados e produtos não ligados posteriormente.

Centrifugue as fatias de gel a 12.000 vezes g à temperatura ambiente por dois minutos para triturar a fatia de gel e coletá-la no tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Após a centrifugação, descarte o tubo vazio de microcentrífuga de 0,6 mililitro. À fatia de gel triturado, adicione 700 microlitros de tampão de eluição.

Incubar a quatro graus Celsius durante a noite com rotação constante para permitir a difusão das amostras no tampão. Transferir as fatias de gel e o tampão de eluição para um filtro de tubo de centrifugação e centrifugar a 20 000 vezes g durante 20 minutos. Após a centrifugação, as fatias de gel ficarão presas no compartimento superior do filtro, que pode ser descartada.

Precipitar e quantificar o RNA conforme descrito no documento anexo. Congele rapidamente e armazene o RNA a menos 80 graus Celsius em nitrogênio líquido até que seja usado. Para enriquecer as regiões de reticulação de RNA, comece adicionando 100 microlitros de tampão de lise contendo inibidor de RNase para lavar grânulos magnéticos revestidos de estreptavidina em um tubo de microcentrífuga.

A um tubo de centrífuga cônico de 15 mililitros, adicione dois mililitros de tampão de hibridização recém-preparado, um mililitro de tampão de lise suplementado, 1,5 microgramas de RNA fracionado de tamanho e 100 microlitros de grânulos ressuspensos. Vortex o tubo suavemente. Incube a 37 graus Celsius por 30 minutos com rotação de ponta a ponta.

Após a incubação, lave as contas cinco vezes com tampão de lavagem pré-aquecido. No final da quinta lavagem, coloque o tubo de microcentrífuga contendo as contas no suporte magnético por um minuto e, em seguida, remova o tampão de lavagem. Adicione um mililitro de tampão polinucleotídeo quinase T4 frio às contas lavadas.

Incube as contas por cinco minutos a quatro graus Celsius com rotação de ponta a ponta. Coloque o tubo de microcentrífuga contendo as contas na tarja magnética. Após um minuto, remova cuidadosamente o tampão.

Repita esta etapa para um total de duas lavagens e remova o tampão após a última lavagem. Em seguida, siga as instruções no documento que acompanha para converter as cinco extremidades principais e três principais para serem compatíveis com a ligação e executar a ligação de proximidade. Após uma lavagem, adicione 100 microlitros de tampão PK de RNA às esferas e ressuspenda-as pipetando para cima e para baixo.

Aqueça as amostras a 95 graus Celsius por 10 minutos em um bloco de calor. Em seguida, resfrie a amostra no gelo por um minuto. Adicione 500 microlitros de tiocianato-fenol-clorofórmio de guanidínio à amostra.

Misture por vórtice vigorosamente por 10 segundos. Incube a mistura em temperatura ambiente por 10 minutos. Após a incubação, use um kit para precipitar, limpar e recuperar o RNA, garantindo que mesmo os RNAs pequenos sejam retidos.

Eluir o RNA em 100 microlitros de água livre de nuclease. Transfira 100 microlitros das amostras eluídas para um poço de uma placa de 24 poços em nice. Mantendo a amostra no gelo, os raios UV a irradiam a 254 nanômetros por cinco minutos.

Transfira a amostra reticulada reversa para um tubo de microcentrífuga limpo. Adicione 10 microlitros de acetato de sódio, um microlitro de glicogênio e 300 microlitros de etanol 100%. Precipite o RNA a menos 20 graus Celsius por pelo menos uma hora.

Para recuperar o RNA, centrifugue o RNA precipitado a 20.000 vezes g por 30 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e adicione um mililitro de etanol a 70% frio para lavar o pellet de RNA. Centrifugar o pellet lavado a 20 000 vezes g durante 15 minutos a quatro graus Celsius.

Remova o tampão de lavagem e adicione 4,25 microlitros de água livre de nuclease para ressuspender o RNA. Transfira o RNA para um tubo de PCR de 0,2 mililitro. Por fim, transcreva reversamente, circularize e amplifique o cDNA de acordo com as instruções no documento anexo.

Este esquema descreve o fluxo de trabalho SPLASH. Após a adição de psoraleno biotinilado na presença de 0,01% de digitonina e reticulação UV, o RNA total é extraído das células e um dot blot é realizado para garantir que a reticulação seja eficiente. Os oligos de 20 bases biotiniladas são então usados como controles positivos para titular a quantidade de psoraleno biotinilado a ser adicionado às células, de modo que aproximadamente uma em cada 150 bases seja reticulada.

A amplificação por PCR em pequena escala é então realizada usando um número crescente de ciclos de PCR para determinar o número mínimo de ciclos necessários para o sequenciamento profundo. Em um processo eficiente de preparação de biblioteca, uma biblioteca de sequenciamento de cDNA pode ser amplificada a partir de uma entrada de RNA selecionada de 1,5 micrograma de tamanho em menos de 15 ciclos de amplificação por PCR. A biblioteca é então sequenciada usando duas leituras de 150 pares de bases em uma máquina de sequenciamento de alta qualidade.

As leituras de sequenciamento são então processadas de acordo com o pipeline computacional. O resultado final é uma lista de interações quiméricas filtradas que inclui interações RNA-RNA intramoleculares e intermoleculares no transcriptoma. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de verificar a incorporação de psoraleno biotinilado ao usar SPLASH em novos organismos.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia do RNA explorarem as interações do RNA em diversos organismos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer uma biblioteca de sequenciamento que capture interações de RNA em pares globalmente na célula.