Name: Mapeando as Interações RNA-ARN Globalmente Usando Psoraleno Biotinilado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Aprenda o método SPLASH para mapear interações RNA-RNA em nível genômico em leveduras, bactérias e células humanas. Esta técnica de alto rendimento utiliza psoraleno biotinilado para estudar dinâmicas de RNA in vivo.

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Agradecemos aos membros do laboratório Wan e do laboratório Nagarajan por discussões informativas. N.Nagarajan é apoiado pelo financiamento de A * STAR. Y.Wan é apoiado pelo financiamento de A * STAR e Sociedade em Ciência-Branco Weiss Fellowship.

<ol><li>Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+transcriptome+through+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">Understanding the transcriptome through RNA structure.</a> Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).</li>
<li>Kertesz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+measurement+of+RNA+secondary+structure+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast.</a> Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Measurement+of+RNA+Folding+Energies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies.</a> Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).</li>
<li>Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+RNA+structure+using+nuclease+digestion+and+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing.</a> Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).</li>
<li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+and+variation+of+RNA+secondary+structure+across+the+human+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome.</a> Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).</li>
<li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).</li>
<li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li>
<li>Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking%2C+ligation%2C+and+sequencing+of+hybrids+reveals+RNA-RNA+interactions+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).</li>
<li>Sugimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hiCLIP+reveals+the+in+vivo+atlas+of+mRNA+secondary+structures+recognized+by+Staufen+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1.</a> Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).</li>
<li>Engreitz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-RNA+interactions+enable+specific+targeting+of+noncoding+RNAs+to+nascent+Pre-mRNAs+and+chromatin+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites.</a> Cell. 159 (1), 188-199 (2014).</li>
<li>Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+determination+of+RNA+structure+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation.</a> Nat.Biotechnol. , (2015).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Duplex+Map+in+Living+Cells+Reveals+Higher-Order+Transcriptome+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure.</a> Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).</li>
<li>Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Mapping+of+Human+RNA-RNA+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions.</a> Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).</li>
<li>Aw, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Mapping+of+Eukaryotic+RNA+Interactomes+Reveals+Principles+of+Higher-Order+Organization+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation.</a> Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui, descrevemos em detalhes o fluxo de trabalho experimental e computacional para SPLASH, um método que nos permite identificar par-sábio RNA interações em um genoma-wide maneira. Utilizamos com sucesso SPLASH em bactérias, leveduras e culturas humanas e antecipamos que a estratégia pode ser amplamente aplicada a diversos organismos em diferentes estados celulares. Uma das etapas críticas no protocolo é começar com pelo menos 20 μg de RNA reticulado para ter material adequado para processos a jusante. O ARN é então fr...

Estudar como as macromoléculas se dobram e interagem entre si é a chave para a compreensão da regulação genética na célula. Embora muitos esforços tenham sido focados na década passada na compreensão de como o DNA e as proteínas contribuem para a regulação genética, relativamente menos se sabe sobre a regulação pós-transcricional da expressão gênica. O ARN contém informação tanto na sua sequência linear como na sua estrutura secundária e terciária 1 . Sua capacidade de basear o par com si e com os outros é importante para a sua função in vivo . Os avanços recentes na sondagem de estrutura secundária de RNA de alto rendimento proporcionaram informações valiosas sobre as localizações de regiões duplas e de cadeia simples no transcriptoma 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howeVer informações sobre o emparelhamento interação parceiros ainda está em grande parte ausente. Para determinar qual a sequï¿½cia de ARN que interage com outra regiï¿½ de ARN no transcriptoma, necessitamos de informaï¿½o global de pares. Mapear par-sábio RNA interações em um global, imparcial forma tem sido tradicionalmente um grande desafio. Embora as abordagens anteriores, tais como CLASH 9 , hiCLIP 10 e RAP 11 , sejam usadas para identificar as interações de RNA em uma maneira de grande escala, essas técnicas tipicamente mapeiam o par de bases de RNA para um subconjunto de RNAs que interagem com uma determinada proteína ou espécies de RNA. Os desenvolvimentos recentes no estudo de interacções de ARN globais incluem o método RPL 12 , que não estabiliza as interacções de ARN in vivo e, portanto, só pode capturar um subconjunto de interacções in vivo . Para superar esses desafios, nós e outros desenvolvemos estratégias genéticas, semP ARN interacional in vivo , utilizando versões modificadas do reticulador psoraleno 13 , 14 , 15 . Neste protocolo, descrevemos os pormenores para realizar a equalização de S de Hélidos H reticulados, S igated e S elegidos por P soralen (SPLASH), que utiliza psoraleno biotinilado para reticular ARNs de emparelhamento de bases in vivo , seguido por ligação de proximidade e sequenciação de alto rendimento a Identificar parceiros de ARN-base de ligação genoma-wide ( Figura 1 ] 15 . Neste manuscrito, descrevemos as etapas para realizar SPLASH usando células aderentes cultivadas, neste caso células HeLa. O mesmo protocolo pode ser facilmente adaptado a células de mamífero de suspensão e a células de levedura e bactérias. Resumidamente, as células HeLa são tratadas com psoraleno biotinilado e irradiadas a 365 nm para interligar os pares de bases de ARN em interacção in vivo. Os RNAs são então extraídos das células, fragmentados e enriquecidos para regiões de reticulação usando esferas de estreptavidina. Os fragmentos de ARN que interagem são então ligados em conjunto utilizando ligadura de proximidade e transformados numa biblioteca de cDNA para sequenciação profunda. Após sequenciação, os ARN quiméricos são mapeados no transcriptoma / genoma para identificar as regiões que interagem com o ARN que estão emparelhadas entre si. Utilizamos com sucesso SPLASH para identificar milhares de interações de RNA in vivo em leveduras e diferentes células humanas, incluindo emparelhamento de ARN intramolecular e intermolecular em diversas classes de RNAs, como snoRNAs, lncRNAs e mRNAs, vislumbrando os padrões de organização estrutural e interação De RNAs na célula.

<table><tbody><tr><td>1 kb Plus DNA Ladder</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10787026</td><td>DNA ladder</td></tr><tr><td>10 bp DNA ladder</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10821-015</td><td>DNA ladder</td></tr><tr><td>20% SDS solution</td><td>Primeira BASE</td><td>BUF-2052-1L&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>First BASE</td><td>BUF-3050-20X1L</td><td></td></tr><tr><td>3.0 M Solução de Acetato de Sódio</td><td>First BASE</td><td>BUF-1151-1L-pH5.2&nbsp; &nbsp;</td><td>Necessário para precipitação de ácido nucleico</td></tr><tr><td>Solução de Acrilamida 40%, 19:1</td><td>Bio-Rad</td><td>1610145</td><td>TBE Componente de gel de ureia</td></tr><tr><td>Kit de tampão Ambion</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>AM9010</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de Amônio, Grau Molecular&nbsp; &nbsp;</td><td>Promega</td><td>V3131&nbsp;</td><td>TBE Componente do gel de ureia</td></tr>Extração azul do <tr><td>RNA</td>do<td>clorofórmio</td><td>Merck</td><td>1,02445.1000</td></tr> de <tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td>do azul de <td>Bromofenol</td></tr><tr>Epicentro <td>CL9025K do</td><td>epicentro do Spin-X do diodo do ADN do ligador da fita do</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS8160-96EA</td><td></td>Filtros</tr><tr><td>cristalinos D5628-1G DIGITONIN CRISTALINO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628-1G</td><td>Para tratamento celular</td></tr><tr><td>Dark Reader Transilluminator&nbsp;</td><td>Clare Chemical Research</td><td>Dark Reader DR89X Transiluminador Transiluminador</td> de <td>luz azul</td></tr><tr><td>DNA Gel Loading Dye (6x)</td> <td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>R0611</td><td>Necessário para eletroporação de gel de agarose</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Pan BioTech</td><td>P04-03500</td><td>Para cultura de células Hela</td></tr><tr><td>Grânulos magnéticos de estreptavidina</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>65002</td><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1&nbsp;</td></tr><tr><td>Suporte magnético para 15&nbsp; Tubos mL</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>12301D</td><td>DynaMag-15</td></tr><tr><td>Suporte magnético para 15&nbsp; Tubos mL Life</td><td>Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>5382 000.015</td><td>Eppendorf ThermoMixer&nbsp; C</td></tr><tr><td>Psoraleno biotinilado</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>29986</td><td>EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotina</td></tr><tr><td>F8T5/BL&nbsp;</td><td>Hitachi</td><td>F8T5/BL&nbsp;</td><td>Lâmpada UV de 365 nm</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10270106&nbsp; &nbsp;</td><td>Componentes do meio Hela</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Promega</td><td>H5052&nbsp; &nbsp;</td><td>Componente no buffer de hibridização</td></tr><tr><td>G8T5</td><td>Sankyo-Denki</td><td>G8T5</td><td>Lâmpada UV de 254 nm</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>10814010</td><td>Necessário para precipitação de ácido nucleico</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>Nanodrop 2000</td><td>Espectrofotômetro para quantificação de ácido nucleico</td></tr><tr><td>Água livre de nuclease&nbsp;</td><td>Primeira BASE</td><td>BUF-1180-500ml&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina Penicilina&nbsp; &nbsp;</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>15140122&nbsp; &nbsp;</td><td>Componentes do meio Hela</td></tr><tr><td>Polimerase DNA de Alta Fidelidade (2x)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>F531L&nbsp;</td><td>Master Mix de PCR de alta fidelidade Phusion com tampão HF (2x)</td></tr><tr><td>Conjunto de Primers 1</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335L&nbsp;</td><td>Primers de PCR</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel de DNA</td><td>QIAgen</td><td>28106</td><td>Kit de extração de gel QIAquick</td></tr><tr><td>Kit de quantificação fluorométrica</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>Q32854</td><td>Qubit dsDNA HS Kit</td></tr><tr><td>de limpeza de RNA</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>RNeasy Mini Kit Coluna de membrana de sílica</td></tr><tr><td>Inibidor de Rnase</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>AM2696</td><td>SUPERase In</td></tr><tr><td>Transcriptase reversa</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>18080400</td><td>SuperScript III Síntese de primeira vertente SuperMix</td></tr><tr><td>Gel de ácido nucleico Stain</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>S11494</td><td>SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL</td></tr><tr><td>T4 Polinucleotídeo Quinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td>Enzima de reparo final</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td><td>Enzima para ligação de proximidade</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 2, truncado KQ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0373L</td><td>Enzima para ligação do adaptador</td></tr><tr><td>Temed</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td>TBE Componente de gel de ureia</td></tr><tr><td>Tiocianato de guanidínio-fenol-clorofórmio</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd</td><td>15596018</td><td>TRIzol&reg; Reagente para extração de RNA</td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Primeira BASE</td><td>BIO-2070-5kg&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Reticulador UV</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>UV Stratalinker 1800</td></tr><tr><td>Transiluminador UV</td><td>UVP</td><td>95-0417-01</td><td>Para visualização de bandas</td></tr><tr><td>Xileno Cyanol FF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr><tr><td>Limpeza de DNA</td><td>Zymo Research&nbsp;</td><td>D4004</td><td>Zymo DNA concentrator-5&nbsp;</td></tr><tr><td>Lista de softwares necessários</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>software FastQC</td><td>0.11.4</td><td>http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td><td></td></tr> <tr><td>software SeqPrep</td><td>1.0.7</td><td>https://github.com/jstjohn/SeqPrep</td><td></td></tr><tr><td>software BWA</td><td>0.7.12</td><td>http://bio-bwa.sourceforge.net/</td><td></td></tr> <tr><td>software SAMTOOLS</td><td>1.2.1</td><td>http://www.htslib.org/</td><td></td></tr> <tr><td>PULLSEQ software</td><td>1.0.2</td><td>https://github.com/bcthomas/pullseq</td><td></td></tr><tr><td>software STAR</td><td>2.5.0c</td><td>https://github.com/alexdobin/STAR</td><td></td></tr><tr><td>rem_dups.py script PYTHON</td><td>PYTHON 2.7.11</td><td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</td><td></td></tr><tr><td>find_chimeras.py script PYTHON</td><td>2.7.11</td><td></td><td></td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</tr><tr><td>pickJunctionReads.awk AWK script</td><td>AWK GNU 4.1.2</td><td>https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src</td><td></td></tr><tr><td>Composição do tampão<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Tampão de eluição</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,3 M acetato</td><td></td><td></td><td></td> de sódio</tr><tr><td>Lysis Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 7.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sempre adicione Superase-in fresco antes de usar, exceto ao lavar contas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K Buffer&nbsp; </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-Cl pH 7,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Tampão de hibridização</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>750 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 7.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15% formamida (armazenar no escuro a 4 &graus; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sempre adicione Superase-in fresco antes de usar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>2x Tampão de lavagem SSC</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x NaCl e citrato de sódio (SSC) (diluído do estoque SSC Invitrogen 20x)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>0,5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>2x tampão de fragmentação de RNA</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mM MgCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>450 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 mM Tris-Cl pH 8,3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>2x Carga de RNA Corante</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% Formamida</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,02% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,02% azul</td><td></td> de bromofenol<td></td><td></td></tr><tr><td>0,01% de xileno cianol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><<tr>td colspan="4">3' Sequência do adaptador de RNA: 
5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC</td></tr><tr><td colspan="4">RT sequência de primer: 
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG</td></tr></tbody></table>

mapeando as interações rna-arn globalmente usando psoraleno biotinilado

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Saber como os RNAs interagem entre si e com os outros é fundamental para entender a regulação genética baseada no RNA na célula. Embora existam exemplos de interacções ARN-ARN, tais como interacções ARNm-ARNm, mostrou-se que regulam a expressão genética, a extensão total em que as interacções ARN ocorrem na célula é ainda desconhecida. Métodos anteriores para estudar as interações de RNA focaram principalmente em subconjuntos de RNAs que estão interagindo com uma determinada proteína ou espécies de RNA. Aqui, detalhamos um método chamado S equenciamento de P soralen reticulado, L igated, e S elegido H ybrids (SPLASH) que permite a captura do genoma de ARN interações in vivo de forma imparcial. SPLASH utiliza reticulação in vivo , ligação de proximidade e sequenciação de alto rendimento para identificar parceiros de ligação de bases de ARN intramoleculares e intermoleculares globalmente. SPLASH pode ser aplicado a diferentes organismos, incluindo bactérias, leveduras e células humanas, bemS diversas condições celulares para facilitar a compreensão da dinâmica da organização do RNA sob diversos contextos celulares. Todo o protocolo SPLASH experimental leva cerca de 5 dias para ser concluído eo fluxo de trabalho computacional leva aproximadamente 7 dias para ser concluído.

A Figura 1 ilustra o esquema do fluxo de trabalho SPLASH. Após a adição de psoraleno biotinilado na presença de 0,01% de digitonina e reticulação UV, o ARN total é extraído das células e é efectuada uma transferência de pontos para assegurar que a reticulação do biotinilado com o ARN tenha ocorrido eficientemente ( Figura 2 ). Utilizamos oligos biotinilados de 20 bases como controlos positivos para titular a quantidade de psoral...

Aqui, detalhamos o método de equação de S de sorgo de P soralen reticulado, L igado e Híbridos H elegidos (SPLASH), que permite o mapeamento genômico de interações intramoleculares e intermoleculares RNA-RNA in vivo . SPLASH pode ser aplicado para estudar os interactomas de RNA de organismos, incluindo leveduras, bactérias e seres humanos.

Mapeando as Interações RNA-ARN Globalmente Usando Psoraleno Biotinilado

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

O objetivo geral deste vídeo é descrever o método de sequenciamento de híbridos ligados e selecionados com ligação cruzada por psoraleno, ou SPLASH, no qual interações RNA-RNA em pares são mapeadas in vivo de maneira genoma abrangente. Esta técnica é um método simples e de alto rendimento para mapear interações de RNA in vivo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de genômica de RNA, como, por exemplo, como diferentes regiões ao longo de uma única fita de RNA ou entre diferentes fitas de RNA interagem entre si.Embora este método possa fornecer informações sobre células de levedura e humanas, ele também pode ser aplicado a estudos em outros organismos modernos, incluindo bactérias e membranas em células. Tivemos a ideia inicial deste método quando desejávamos desenvolver uma maneira de mapear interações moleculares. Observe que o seguinte procedimento contém vários pontos de interrupção.Nestes momentos, o experimento pode ser pausado brevemente ou indefinidamente. Detalhes podem ser encontrados no texto acompanhante. Inicie este procedimento lavando as células HeLa duas vezes com cinco mililitros de PBS.Coloque o recipiente verticalmente por um minuto pa

mapping-rna-rna-interactions-globally-using-biotinylated-psoralen

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Transcrições RNA estão sujeitos à regulamentação posttranscriptional extensa que é mediada por uma multidão de proteínas RNA-binding trans-acting (RBPs). Aqui apresentamos um método generalizado para identificar com precisão e em escala transcriptoma-wide os sites ligação do RNA RBPs.

PAR-Clip - um método para identificar em toda a Transcriptoma Sítios de Ligação de Proteínas RNA Binding

as interações RNA-proteína estão no centro de muitos processos celulares. Aqui, descrevemos um método in vivo para isolar RNA específico e identificar novas proteínas associadas a ele. Isso pode lançar uma nova luz sobre como os RNAs são regulados na célula.

Novel de Ligação a RNA Proteínas Isolamento pelo rápido Metodologia

Os lasers são frequentemente utilizados em estudos sobre a resposta celular a danos no ADN. No entanto, eles gerar lesões cujo espaçamento, de frequência, e colisões com garfos de replicação são raramente caracterizado. Aqui, descrevemos uma abordagem que permite a determinação destes parâmetros com a laser localizada ligações cruzadas intercadeias.

Único Análise Molécula do laser localizadas psoralênica adutos

Descreveremos um protocolo para identificar proteínas RNA-obrigatórias e mapear suas regiões de ligação de RNA em células vivas, usando photocrosslinking UV-mediada e espectrometria de massa.

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Aqui, apresentamos um protocolo de captura interativo aplicado aos protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis thaliana . Este método baseia-se criticamente na reticulação UV in vivo e permite o isolamento e identificação de proteínas de ligação a mRNA de plantas a partir de um ambiente fisiológico.

Capacidade de interactomo do mRNA a partir de protoplastos de plantas

Um protocolo detalhado para a aplicação a clique química assistida RNA-interactome captura (CARIC) estratégia para identificar proteínas obrigatório para ambos os de codificação e não-codificante RNAs é apresentado.

Captura e identificação de proteínas de ligação de RNA usando clique química assistida RNA-interactome capturam estratégia (CARIC)

Complexos de RNA/proteínas purificados usando estratégia botin-streptavidin são eluídos a solução sob condições de desnaturação de forma inadequada para mais de purificação e análise funcional. Aqui, descrevemos uma modificação desta estratégia que utiliza um foto-cleavable vinculador em RNA e um passo de UV-eluição suave, produzindo complexos de RNA/proteína nativos e totalmente funcionais.

Purificação de etapa única de complexos macromoleculares usando RNA ligado à biotina e um foto-cleavable vinculador

Aqui, nós descrevemos o conjunto de complexos do alongamento do polymerase II (pol II) do RNA que exigem somente o ADN sintético curto e oligonucleotídeos do RNA e o pol purificado II. Esses complexos são úteis para estudar mecanismos subjacentes ao processamento cotranscricional de transcrições associadas ao complexo de alongamento pol II.

Complexos artificiais de alongamento de RNA polimerase II para dissecar eventos co-transcricionais do processamento de RNA

São apresentados aqui protocolos para ensaios bioquímicos in vitro usando rótulos de biotina que podem ser amplamente aplicáveis para o estudo de interações ácido proteína-nucleico.

Ensaios bioquímicos in vitro utilizando rótulos de biotina para estudar interações ácido proteína-nucleico

Aqui, apresentamos um método in vitro otimizado para descobrir, quantificar e validar interatores proteicos de sequências específicas de RNA, usando extrato proteico total de células humanas, esferas de estreptavidina revestidas com RNA biotinilado e análise por espectrometria de massas.

Uma Análise Pull-Down Quantitativa Otimizada de Proteínas Ligadoras de RNA Usando RNA Biotinilado Curto

Aprenda o método SPLASH para mapear interações RNA-RNA em nível genômico em leveduras, bactérias e células humanas. Esta técnica de alto rendimento utiliza psoraleno biotinilado para estudar dinâmicas de RNA in vivo.

Mapeando as Interações RNA-ARN Globalmente Usando Psoraleno Biotinilado

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