Name: Propagação em pequena escala de iPSCs humano em condições sem soro para a caracterização imunocitoquímica de rotina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Aprenda a propagar células-tronco pluripotentes induzidas humanas em pequena escala para caracterização imunocitoquímica de rotina. Este método econômico permite cultivo eficiente em lâminas de câmara para detecção de antigos de pluripotência.

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Fontes de financiamento: Universidade do Arizona, Fundação Jim Himelic e Centro de Biologia de Doenças Complexas do Arizona.

hiPSCs foram obtidos a partir de fibroblastos dérmicos humanos isolados a partir de 4 mm biópsias de pele e reprogramadas em casa através de Sendai reprogramação mediada por vírus 11. A Universidade do Arizona Institutional Review Board aprovou todos os procedimentos para o recrutamento assunto e coleta de biópsia. 1. Preparação de Matriz Extracelular superfície revestida para cultura iPSC <ol><li> Um dia antes da confluência de culturas hiPSC que crescem em iMEFs, preparar placas revestidas matriz extracelular (Matrigel). </li><li> degelo lento uma alíquota da matriz extracelular (muito dependentes, siga as instruções sobre a folha de especificações) em gelo em 4 ° C durante 2 h. </li><li> Num capuz segurança biológica, utilizando pontas de pipeta frio (armazenada a -20 ° C), adicione uma aliquota de matriz extracelular para Modified Eagle Médium / Nutrient mistura fria da Dulbecco F-12 (DMEM / F12 / HEPES) de acordo com o factor de diluição do lote específico . </li><li> Dispense ~ 60081; L de matriz extracelular por poço de cada nova cultura de células tratadas com placa de 12 poços necessários. </li><li> Incubar a placa a temperatura ambiente durante várias horas. Aqui, utilizar um tempo de incubação de 3 h. NOTA: As placas podem ser utilizadas imediatamente ou armazenadas a 4 ° C durante até duas semanas. </li></ol> 2. Transferência de hiPSCs crescido em células alimentadoras IMEF na Matriz Extracelular para Propagação <ol><li> No dia da Passaging, remover a placa revestida com matriz de 4 ° C e deixar que a placa se adapte à temperatura ambiente durante 1 h na capa de cultura de tecido. </li><li> Aspirar o meio a partir de um poço de uma placa de 6 poços de cultura hiPSC crescente em iMEFs e substituir com 500 ul de reagente de dissociação com colagenase (1 mg / mL em meio de cultura basal). </li><li> Incubar a 37 ° C durante ~ 10 - 30 minutos até as bordas das colónias IPSC parecem levantar ligeiramente. NOTA: O tempo de incubação é a linha dependente e irá variar. Monitorar dissociação sob um microscópio. </li><li> Carroefully aspirar o reagente de dissociação e lavar cuidadosamente 2 vezes com salino tamponado com fosfato (PBS, pH 7,4). </li><li> Adicionar 1 mL de temperatura ambiente mTeSR1 meio completo com 10 ng / mL de Rho-associado inibidor de proteína quinase (Y-27632 inibidor ROCHA) para o poço. NOTA: utilizando uma mistura 50:50 de meio condicionado e IMEF mTeSR1 durante esta passagem inicial é sugerida e pode ser benéfico para a sobrevivência dos hiPSCs durante esta transição meios. </li><li> Usando um pequeno microscópio de contraste de fase colocado parcialmente no interior do exaustor, marcar manualmente e escolher 1 - 2 colónias hiPSC (~ 700 - 1000 um de diâmetro) utilizando uma seringa e uma agulha (25 g, em 1 ½). Empurrar as peças marcados da colônia no meio com uma ponta de pipeta P200. </li><li> Aspirar e eliminar a matriz da nova placa, tomando cuidado para não perturbar o revestimento. </li><li> Transferir 1 ml da suspensão de células a partir da velha cavidades contendo as iPSCs marcados para a nova matriz bem revestido. </li><li> Place a placa na incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2. Balançar a placa em vários, vai-e-vem rápido, e lado-a-lado movimentos para espalhar uniformemente as células. Não perturbe a placa durante 24 h. </li><li> Realizar mudanças de mídia diários completos com mTeSR1 meio completo (adição de Y-27632 ROCHA inibidor não é necessário após o plaqueamento inicial no passo 2.5). </li></ol> Passaging 3. pequena escala de hiPSCs em placas revestidas de Matrix NOTA: De um modo geral, após a transferência inicial dos hiPSCs à matriz placas revestidas, as células devem ser passadas mais uma vez de um modo semelhante para assegurar que todos iMEFs ter sido eliminado e as células foram adaptadas para Alimentador livre condições. <ol><li> Um dia antes da iPSC confluência preparar as placas de matriz recém-revestida como discutido na seção 1. </li><li> No dia da passagem, remover a placa revestida com matriz de 4 ° C de incubação e permitir que a placa se adapte à temperatura ambiente durante 1 h no tecido culhood ture. </li><li> Aspirar o meio a partir de um poço de uma placa de 6 poços de hiPSCs (inicialmente transferida a partir do alimentador de matriz) e substituir com 500 ul de tampão de dissociação de células. NOTA: O tampão de dissociação celular comercial usado aqui (ver Tabela Materiais) é mais adequada para utilização com o meio mTeSR1 comparação com colagenase. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 3-7 min, até que os bordos das colónias IPSC parecem levantar ligeiramente. Como mencionado anteriormente, o tempo de incubação é de linha dependente e variável. Por isso, monitorizar a dissociação celular sob um microscópio para determinar o tempo óptimo. </li><li> Aspirar cuidadosamente o tampão de dissociação e lavar suavemente 2 vezes com PBS. </li><li> Adicionar 500 mL de temperatura ambiente mTeSR1 meio completo com 10 ng / mL Y-27632 inibidor ROCHA para o bem. </li><li> Em vez de colônias de pontuação como no Passo 2.6, pressione o número desejado de colônias na mídia usando uma ponta P200 e gentilmente triturar a suspensão de células 2 vezes against um canto do poço para quebrar as colónias hiPSC em aglomerados de ~ 50-200 uM de tamanho. Por exemplo, para uma placa de 12 poços, escolher 1 - 2 colónias de transferir para cada um novo poço. Transferir a suspensão de células a partir do antigo bem em um único poço de uma nova placa de 12 poços. </li><li> Balance a placa em vários rápida, para trás e para a frente, e os movimentos de lado-a-lado para espalhar uniformemente as células, e deixar o resto da placa durante 24 h num banho a 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> Realizar mudanças de mídia diários completos com mTeSR1 meio completo. Como mencionado anteriormente, não é necessário adicionar Y-27632 ROCHA inibidor após o revestimento inicial. NOTA: não utilizadas colónias IPSC do Passo 3.7 pode ser facilmente criopreservados neste momento. </li></ol> 4. Preparação de Câmara Slides e Lamelas para a semeadura de hiPSCs para Imunocitoquï¿½ica NOTA: O protocolo seguinte utiliza 4-bem lâminas de câmara de plástico e 12 lamelas mm de vidro com appropriate volumes de mídia nas multi-poços para apoiar imunocitoquímica rentável. No entanto, volumes de suporte pode ser aumentada, se for desejada a utilização de tamanhos maiores e bem lamela. <ol><li> Um dia antes da hiPSC confluência, preparar lâminas de câmara recém-revestidos com matriz extracelular como discutido na seção 1. Adicione solução de matriz suficiente (~ 300 - 500 L por cavidade de uma lâmina de câmara de 4 poços) para totalmente coat cada poço, sem qualquer preocupação de evaporação. Alternativamente, após a colocação de uma lamela limpa e esterilizada em cada poço de uma placa de 24 poços, 500 ul revestimento com matriz extracelular e garantir que a lamela não está a flutuar no topo da solução. </li><li> No dia da passagem, remover as lâminas com câmara revestidos / lamelas de 4 ° C e permitir a aclimatação à temperatura ambiente durante 1 h no capuz de cultura de tecidos. </li><li> Aspirar o meio a partir de um poço de uma placa de 12 poços de hiPSCs e substituir com 500 ul de tampão de dissociação. </li><li> Incubar a tempe quartoratura durante ~ 3-7 min, até que os bordos das colónias IPSC parecem levantar ligeiramente. </li><li> Aspirar cuidadosamente o tampão de dissociação e adicionar 1 mL de temperatura ambiente mTeSR1 meio completo com 10 ng / mL Y-27632 ROCHA inibidor para o bem. </li><li> Usando um microscópio de contraste de pequena fase colocado dentro da capa de cultura de tecido, escolher manualmente uma colónia / novo poço de uma lâmina de câmara de 4 poços ou de uma nova lamela a ser revestida (~ 1.000 - 1.500 m de diâmetro) utilizando uma ponta P200 pipeta, empurrando -lo para fora da superfície da placa para o meio. </li><li> Aspirar a matriz no novo slide câmara / lamela, tomando cuidado para não perturbar o revestimento. </li><li> Com cuidado, tritura-se a suspensão de células 2 vezes contra um canto do poço para quebrar as colónias hiPSC em aglomerados de ~ 50-200 uM de tamanho. Transferir 250 uL da suspensão de células a partir do antigo bem em cada poço de uma nova 4-corrediça bem câmara / lamela. </li><li> Traga o volume de cada novo poço até 500 mL com mTeSR1 containing 10 ng / mL de Y-27632 Inibidor ROCHA. </li><li> Coloque a câmara de deslizamento / lamelas na incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Após 24 h, realizar alterações na mídia diários completos com mTeSR1 meio completo. Mais uma vez, como mencionado anteriormente, a adição de Y-27632 Inibidor ROCHA não é necessário, depois de o plaqueamento inicial. </li></ol> 5. Preparação de iPSCs para Imunocitoquï¿½ica <ol><li> Uma vez confluentes, preservar as colônias hiPSC através de fixação, removendo a mídia dos poços e adicionar pré-aquecido CUIDADO paraformaldeído a 4% (~ 300 mL / poço de uma 4-bem slides câmara / lamela). Incubar à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Descartar o paraformaldeído apropriadamente de acordo com risco biológico institucional e as diretrizes de segurança de produtos químicos. </li><li> Lave as células 3 vezes durante 5 minutos cada, num agitador de bancada com PBS. NOTA: As células sobre lâminas de câmara / lamelas pode ser armazenado com um amplo PBS a 4 ° C indefinidamente nesta fase.Alternativamente, eles podem ser imediatamente utilizados para ICC. </li></ol> 6. A imunocoloração de hiPSCs com pluripotência Markers NOTA: hiPSCs imunocoloração com anticorpos pluripotência padrão. Como exemplo, aqui estão as células duas vezes coradas com anticorpos alvo uma superfície e 1 1 antígeno intracelular de uma forma sequencial da seguinte forma: Anti-Stage-Specific Antigen Embryonic-4 (SSEA4) com proteína 4 (OCT- anti-octï¿½ero de ligação 4) e anti-Tra-1-60 com anti-SRY relacionados HMG BOX gene 2 (SOX2) (consulte a tabela Materiais para obter detalhes de anticorpos). <ol><li> Aspirar o PBS dos poços e adicionar 500 uL / ​​poço da solução de bloqueio, sem Triton-X-100. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> Prepara-se uma concentração pré-determinada (aqui, usar 1: 200) de anticorpos de superfície, quer SSEA4 ou Tra-1-60, diluindo-se em Solução de Bloqueio, sem Triton X-100. <ol><li> Para lâminas com câmara, preparar a 300 uL / ​​poço de uma lâmina de câmara de 4 poçospor mistura de 298,5 mL de solução de bloqueio de cima e 1,5 mL de anti-anticorpo primário ou SSEA4 Tra-1-60. </li><li> Para lamelas, preparar 40 mL / lamela misturando 199 mL de Solução de Bloqueio e 1 mL de anti-SSEA4 ou anticorpo primário Tra-1-60. </li></ol></li><li> Aspirar a solução de bloqueio a partir do slide câmara e dispensar o anticorpo primário nas cavidades apropriadas. Para lamelas, colocar uma folha de parafilme firmemente dentro de um prato Petri e dispensar 40 ul do anticorpo primário na parte superior como uma gotícula. Usando uma agulha de seringa dobrada e uma pinça, levantar cuidadosamente a lamela para fora do poço de cultura e coloque-o lado das células para baixo para a gota de anticorpo no parafilme. Incubar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Na manhã seguinte, lavar as células 3 vezes, 5 - 10 min cada, por remoção do anticorpo a partir da câmara de corrediça e adicionando em PBS. Para lamelas, levantar cada um fora do parafilme e colocá-lo de volta em um poço de uma placa de 24 poços, com o lado célula para cima. Adicione cuidadosamente PBS. </li><li> Preparar anticorpos secundários adequados a 1: 500 em solução de bloqueio. <ol><li> Para lâminas com câmara, preparar a 300 uL / ​​poço de uma lâmina de câmara de quatro poços por mistura de 499 ul de solução de bloqueio e 1 ul de anticorpo de cabra anti-rato IgG 3 Alexa Fluor 488 (por SSEA4) ou 1 ul de anticorpo de cabra anti-IgM de ratinho Alexa Fluor 488 (para Tra-1-60). </li><li> Para lamelas, preparar 40 mL / lamela por mistura de 499 ul de solução de bloqueio e 1 ul de anticorpo de cabra anti-rato Alexa Fluor 488 IgG3 (por SSEA4) ou 1 ul de anticorpo de cabra anti-IgM de ratinho Alexa Fluor 488 (por Tra-1-60 ). </li></ol></li><li> Aspirar o PBS a partir do slide câmara e dispensar o anticorpo secundário em poços apropriados. Para lamelas, a seguir ao Passo 6.2, inverter as lamelas na solução de anticorpo colocado em parafilme à temperatura ambiente durante 2 h. NOTA: Se fluorescente utilizando anticorpos secundários etiquetados, as células devem ser protegidas da luz. Colocar as lâminas de câmara e as lamelas em um env escuroironment durante incubações e lavagens. </li><li> Lavam-se as células 3 vezes durante 5 - 10 minutos a cada por remoção do anticorpo a partir da câmara de corrediça e adicionando em PBS. Para lamelas, levante cuidadosamente cada uma delas a partir do parafilme e colocar de volta em um poço de uma placa de 24 poços, com o lado célula para cima. Delicadamente adicionar PBS durante a lavagem. </li><li> Antes de sondagem para o segundo antigénio, Oct-4 intracelular ou SOX2, neste caso, novamente incubar em Solução de Bloqueio feita com o reagente de permeabilização (Triton-X-100) durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> Para imunocoloração para OCT-4 ou SOX2, basta seguir a metodologia descrita nos Passos 6.1-6.6 para a aplicação dos anticorpos primário e secundário. Para os efeitos do presente protocolo, utilizar OCT-4 e SOX2 a uma concentração de 1: 200 e o anticorpo de cabra anti-coelho secundário IgG Alexa Fluor 594 a 1: 500. </li><li> Após os tratamentos acima referidos anticorpos primários e secundários, lavar as células 3 vezes para 5 - 10 min cada com PBS e contracoloração com 4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-phenylindole, dicloridrato (DAPI), seguindo protocolos padrão se a visualização nuclear é desejada. </li></ol> 7. Preparação para visualização <ol><li> Para lâminas de câmara, retire cuidadosamente a câmara superior do slide, seguindo as instruções do fabricante. Em seguida, lavar em água destilada, e adicionar meio de uma lamela de montagem e para permitir microscopia. </li><li> Para lamelas, inverter as lamelas para uma gota de meio de montagem colocada numa lâmina de vidro de microscópio. </li><li> Imagem sob um microscópio de fluorescência padrão ou confocal. </li></ol>

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<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Ruff, D., Lieu, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+stem+cells+using+quantitative+PCR+protein+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+bio%22%5BJournal%5D)">Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays.</a> Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).</li>
<li>Pripuzova, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+protein+marker+panel+for+characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28hiPSCs%29+using+global+quantitative+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+res%22%5BJournal%5D)">Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis.</a> Stem cell res. 14, 323-338 (2015).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+jpn+acad+ser+B+phys+biol+sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Bigdeli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+human+embryonic+stem+cells+to+feeder-free+and+matrix-free+culture+conditions+directly+on+plastic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces.</a> J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).</li>
<li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+bio%22%5BJournal%5D)">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo sistemática aqui apresentado oferece uma economia de tempo e método de custo-benefício, na forma de uma técnica de cultura em escala reduzida, projetado especificamente para apoiar a análise pluripotência eficaz através de imunocitoquímica. As principais vantagens do método descrito são as seguintes. Tradicionalmente, mais de 3 a 4 passagens são necessários para a transição iPSCs de camadas alimentadoras para Alimentador livre condições de cultura, a fim de eliminar iMEFs residua...

Reprogramação de células somáticas adultas humanas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) fornece uma maneira de obter uma fonte potencialmente ilimitada de células específicas do paciente para estudar a doença 1, 2. Recapitulando um fenótipo da doença in vitro, que tornam plausível para examinar os mecanismos celulares e moleculares associadas com a doença, e melhorar a descoberta da droga e da medicina personalizada 3. Além disso, iPSCs humanos (hiPSCs) oferecem a possibilidade de derivar tipos de células específicas que podem ser usadas como um recurso único para substituir as células mortas ou disfuncionais e restaurar a função no contexto de várias desordens 4, 5. Um pré-requisito importante para usando iPSCs nas aplicações acima é garantir que a sua pluripotentes e indiferenciado estado é mantido durante a expansão em cultura. Tipicamente, techniqUEs, tais como citometria de fluxo, Western blotting, reacção em cadeia com polimerase e os ensaios funcionais, que requerem grandes quantidades de células e equipamento especializado, são utilizados para a análise detalhada de iPSC pluripotência 6, 7, 8, 9, 10. No entanto, a avaliação de rotina do estado indiferenciado das iPSCs pode efetivamente ser alcançado através da propagação limitada destas células especificamente para imunocitoquímica (ICC), envolvendo, assim, tempo e recursos reduzidos. Recentes avanços permitir o crescimento de iPSCs em condições isentas de soro definidas, o que é uma melhoria significativa em relação aos sistemas de cultura convencionais que requerem camadas alimentadoras de fibroblastos murinos e meio de soro contendo. No entanto, a literatura atual não inclui protocolos passo a passo claras que descrevem como fazer a transição iPSCs de alimentadorcamada para sistemas sem alimentação. Neste contexto, o presente protocolo sistematicamente detalha como hiPSCs cultivadas em ratinho irradiado fibroblasto embrionário (IMEF) camadas alimentadoras podem ser (1) adaptado para propagar em meio isento de soro, e (2) em cultura em pequena escala para apoiar especificamente robusta análise imunocitoquímica. No geral, esta metodologia representa um procedimento oportuna e rentável para a propagação iPSCs humanos em condições isentas de soro para confirmar a sua pluripotência em uma base de rotina usando imunocitoquímica.

<table><tbody><tr><td>DMEM-F12 / HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Ciências celulares humanas recombinantes FGF-Basic</td><td></td><td>CRF001B</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 inibidor</td><td>R & D</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Tipo IV</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Matriz qualificada para hESC Corning</td><td></td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 Basal Medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>05850</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 5x Suplemento</td><td>StemCell Technologies</td><td>05850</td><td></td></tr><tr><td>Gentle Cell Dissociation Buffer</td><td>StemCell Technologies</td><td>07174</td><td></td></tr><tr><td>0,1 M PO4 Tampão</td><td>interno</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído, prill</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>1x Solução salina tamponada com fosfato</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Life Technologies</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Sinalização celular mAb de camundongo</td><td> Sinalização celular Sinalização celular Sinalização celular</td><td>2840 3579 4755 4746</td><td>Alternativamente, uma combinação de 6 anticorpos primários de pluripotência pode ser adquirida em conjunto como um kit no Catálogo #9656</td></tr><tr><td>Cabra anti-Ms IgM Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21042</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21151</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-Rb IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Cultura de Células Multipoços</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>0720080/0720081</td><td>Disponível em tamanhos de 6, 12, 24, 48, 96 poços</td></tr><tr><td>Corrediças de Câmara</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12 565 21</td><td>Disponível em Vidro ou Plástico Permanox em tamanhos de poço de 1, 2, 4, 8, 16</td></tr><tr><td>Tampa de vidro para crescimento</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12 545 82</td><td>Disponível nos tamanhos de 12, 15, 18, 22 e 25 mm</td></tr></tbody></table>

propagação em pequena escala de ipscs humano em condições sem soro para a caracterização imunocitoquímica de rotina

Small-scale Propagation of Human iPSCs in Serum-free Conditions for Routine Immunocytochemical Characterization

Há um grande interesse na utilização de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) para modelagem de doenças e terapêutica celular devido à especificidade do paciente e à estaminalidade característica. No entanto, a pluripotência das iPSCs, que é essencial para sua funcionalidade, deve ser confirmada antes que essas células possam ser usadas em tais aplicações. Embora uma caracterização rigorosa das iPSCs, por meio de diferentes ensaios celulares e funcionais, seja necessária para estabelecer sua pluripotência, a avaliação rotineira da manutenção da pluripotência pode ser alcançada de forma mais simples e eficaz por meio de técnicas imunocitoquímicas. Aqui, apresentamos um protocolo sistemático para a cultura de hiPSCs, de forma reduzida, para facilitar particularmente a verificação de seu estado pluripotente usando imunocitoquímica. Mais especificamente, essa metodologia abrange um meio eficiente e econômico de cultivar iPSCs em condições livres de soro e plaqueá-las em pequenas lâminas de câmara ou lamínulas de vidro ideais para imunocitoquímica.

Este protocolo fornece uma descrição passo a passo de como iPSCs humano pode ser transferido de camada alimentadora para Alimentador livre condições e, posteriormente propagada de forma limitada para permitir especificamente imunocitoquímica de custo eficaz para confirmar a manutenção da pluripotência. A Figura 1 mostra uma representação esquemática deste protocolo. A Figura 2A mostra que crescem em colónias hiPSC iMEFs em placas de 6 poços. Estas colóni...

A caracterização regular de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), para verificar a manutenção de seu estado pluripotente, é um passo importante antes que essas células sejam usadas para outras aplicações. Aqui descrevemos um método para a propagação em pequena escala de iPSCs humanas especificamente projetado para permitir sua caracterização fácil e rotineira via imunocitoquímica.

Propagação em pequena escala de iPSCs humano em condições sem soro para a caracterização imunocitoquímica de rotina

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient ...

O objetivo geral deste método de cultivo é propagar células-tronco pluripotentes induzidas humanas, ou iPSCs humanas, em pequena escala, especificamente para permitir sua caracterização rotineira por meio de imunocitoquímica. Este protocolo do meu laboratório apresenta uma técnica de redução de escala para transferir células-tronco pluripotentes induzidas humanas da camada fetal subjacente para um substrato mais adequado para a detecção de antígenos utilizando anticorpos específicos de pluripotência. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece um meio eficaz em termos de tempo e custo para cultivar células pluripotentes em lâminas com câmaras pequenas ou sobre lamínulas, que são ideais para imunocitoquímica.No dia da passagem, retire a placa revestida com matriz de quatro graus Celsius e deixe a placa aclimatar à temperatura ambiente por uma hora na cabine de cultura de tecidos. Em seguida, aspire o meio de um poço de uma placa de seis poços com cultura de iPSCs humanas crescendo sobre iMEFs e substitua por 500 microlitros de reagente de dissociação com colagenase. Posteriormente, incube as células a 37 graus Celsius por 10 a 30 minutos, até que as bordas das colônias de iPSCs pareçam levantar levemente, conforme observado ao microscópio; então, aspire cuidadosamente o reagente de dissociação e lave as células suavemente duas vezes com PBS.Como o perfil de dissociação de cada linhagem específica de iPSC pode diferir, é importante monitorar a dessanexão das colônias sob um microscópio para determinar o período ideal de incubação necessário com o reagente de dissociação. Adicione um mililitro de meio completo mTeSR à temperatura ambiente com inibidor de ROCK a 10 nanogramas por mililitro ao poço. Utilizando um pequeno microscópio de contraste de fase colocado parcialmente dentro da câmara de fluxo laminar, marque manualmente e selecione uma a duas colônias de iPSC humanas.Empurre as partes cortadas da colônia para o meio com a ponteira de uma pipeta P200. Em seguida, aspire a matriz dos novos poços que serão semeados, tomando cuidado para não perturbar o revestimento. Transfira um mililitro da suspensão celular do poço antigo contendo os iPSCs cortados para o novo poço revestido com matriz.Coloque a placa no incubador e movimente-a com vários movimentos rápidos para frente e para trás e de um lado para o outro para distribuir uniformemente as células. Incube a 37 graus Celsius por 24 horas. Após a transferência dos iPSCs humanos de iMEF para a matriz extracelular, eles são repassados para uma placa de 12 poços de maneira semelhante aos passos anteriores de repasse.Esta passagem permite a eliminação de quaisquer iMEFs remanescentes da cultura e garante que as células se adaptem a condições livres de camada de alimentação. Empurre o número desejado de colônias para o meio utilizando a ponteira de um P200 e, suavemente, titule a suspensão celular duas vezes contra um canto do poço para fragmentar as colônias de iPSCs humanas em agregados de aproximadamente 50 a 200 micrômetros de tamanho. Para uma placa de 12 poços, desprenda uma a duas colônias para o meio, em seguida transfira a suspensão celular do poço antigo para um único novo poço de uma placa de 12 poços.Agite a placa com vários movimentos rápidos para frente e para trás e de um lado para o outro para distribuir uniformemente as células e deixe a placa em repouso por 24 horas a 37 graus Celsius. Esta seção envolve o repicamento dos iPSCs nas placas de 12 poços e o seu cultivo em lâminas de câmara pequenas e lamínulas ideais para imunocitoquímica. Neste procedimento, aspire o meio de um poço de uma placa de 12 poços contendo iPSCs humanos e substitua por 500 microlitros de tampão de dissociação.Incube as células à temperatura ambiente por cerca de três a sete minutos, até que as bordas das colônias de iPSCs pareçam levantar ligeiramente. Em seguida, aspire cuidadosamente o tampão de dissociação e adicione um mililitro de meio completo mTeSR à temperatura ambiente com inibidor de ROCK a 10 nanogramas por mililitro ao poço. Usando um microscópio pequeno de contraste de fase colocado dentro da cabine de cultura de tecidos, desprenda as colônias soltas da superfície da placa para o meio, depois aspire a matriz da nova placa de 24 poços com lamínulas e lâmina de câmara, tomando cuidado para não perturbar o revestimento.Titule suavemente a suspensão celular duas vezes contra um canto do poço para fragmentar as colônias de iPSCs humanas em agregados de aproximadamente 50 a 200 micrômetros de tamanho. Transfira 250 microlitros da suspensão celular do poço antigo para cada novo poço de uma lâmina com câmara de quatro poços. Ao semear sobre lamínulas, desprenda uma colônia do poço original, titule e transfira a suspensão celular para as lamínulas nos novos poços de uma placa de 24 poços.Posteriormente, complete o volume de cada novo poço até 500 microlitros com mTeSR1 contendo 10 nanogramas por mililitro do inibidor ROCK Y27632. Em seguida, coloque a lâmina com câmara e as lamínulas no incubador a 37 graus Celsius. Assim que as iPSCs humanas atingirem confluência, as células estarão prontas para imunocitoquímica, utilizando fixação padrão com paraformaldeído e bloqueio antes da incubação com o anticorpo primário.Agora, prepare uma concentração predeterminada do anticorpo de superfície, seja SSEA4 ou TRA-1-60, diluindo-o na solução bloqueadora sem Triton X-100. Para lâminas com câmara, prepare quantidade suficiente de solução de anticorpo misturando 298,5 microlitros de solução bloqueadora e 1,5 microlitro de anticorpo primário anti-SSEA4 ou TRA-1-60, de modo que cada poço receba 300 microlitros de solução de anticorpo. Aspire a solução bloqueadora da lâmina com câmara e adicione o anticorpo primário nos poços apropriados.Para lamínulas, coloque 40 microlitros da solução de anticorpo em um recipiente forrado com Parafilm. Coloque cuidadosamente a lamínula com o lado das células voltado para baixo sobre a solução e incube as células durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, remova a solução de anticorpo das lâminas com quatro poços e lave as células três vezes, por cinco a dez minutos cada vez, com PBS.Para as lamínulas, coloque-as novamente nos poços de uma placa de 24 poços e lave-as com PBS, em seguida prossiga de maneira semelhante à incubação com o anticorpo primário para a incubação com o anticorpo secundário antes de preparar as células imunomarcadas para microscopia de fluorescência. É mostrada aqui a colônia densa de iPSC cultivada em células alimentadoras iMEF. Após a passagem inicial para uma placa de 12 poços revestida com matriz em meio livre de soro, alguns iMEFs ainda podem ser observados na cultura.Esta imagem mostra a morfologia típica de uma colônia de iPSCs em monocamada cultivada sem células de apoio, e não há iMEFs remanescentes nesta fase do cultivo. As imagens representativas de imunofluorescência de iPSCs obtidas por microscopia confocal mostram expressão positiva dos marcadores de pluripotência Oct-4 e SSEA4 com a coloração nuclear DAPI, e Sox2 e TRA-1-60 com DAPI. Essas duas são imagens sobrepostas.Uma vez dominada, esta técnica oferece uma maneira econômica de transferir iPSCs de camadas de alimentação iMEF para superfícies de matriz e realizar imunocitoquímica, economizando tempo e reagentes caros. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que cada linhagem primária de iPSCs se comporta de maneira diferente em cultura e precisa ser monitorada durante os processos de passagem e semeadura. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como cultivar e passar iPSCs humanos em pequena escala de forma econômica para caracterização rotineira por imunocitoquímica.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Suspensão coloração imunocitoquímica de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para marcadores da superfície celular (SSEA-3/SSEA-4) foi alcançada com base na utilização de um aparelho cytospin self-made para criar uma monocamada de células para observação e quantificação.

Análise imunocitoquímica de células-tronco humanas pluripotentes usando um Self-Made Aparelho Cytospin

Nós apresentamos um protocolo para a reprogramação eficiente de células somáticas humanas em células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC) usando vetores retrovirais codificando OCT3 / 4, Sox2, KLF4 e c-myc (OSKM) e identificação de hiPSC corretamente reprogramado pela coloração ao vivo com tradi- 1-81 anticorpo.

Seleção e isolamento de colônias de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de fibroblastos adultos reprogramado

Células-tronco pluripotentes, tanto as células-tronco embrionárias ou pluripotentes induzidas (iPS), constituem uma valiosa fonte de células diferenciadas humanos, incluindo os cardiomiócitos. Aqui, vamos nos concentrar na indução cardíaco de células iPS, mostrando como usá-los para obter os cardiomiócitos humanos funcionais através de um protocolo de corpos baseada embryoid.

Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas

Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) representam uma fonte de tecidos específicos do paciente para aplicações clínicas e de pesquisa básica. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para reprogramar células humanas mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) obtidos a partir de crostas inflamatórias congelados em iPSCs virais-livre usando não-integração plasmídeos epissomais.

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco Congelado Buffy Coats usando não-integração epissomais Plasmids

Este protocolo descreve como gerar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) a partir de células T periféricas humanas em condições livres de alimentador usando uma combinação de vetores de vírus matrigel e Sendai contendo fatores de reprogramação.

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco periférico humano T células usando Sendai Virus em condições livres de Alimentador

Aqui, relatamos um protocolo para desenvolver um sistema tridimensional (3-D) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) chamado corpo embrionóide sem soro (SFEB). Este modelo 3-D pode ser usado como uma cultura de fatia organotípica para modelar o desenvolvimento cortical humano e para a interrogação fisiológica do desenvolvimento de circuitos neurais.

Desenvolvimento de corpos de embrióide livres de soro derivado de HiPSC para a interrogação de culturas de células estaminais 3-D usando ensaios relevantes para o fisiologismo

Este protocolo descreve detalhadamente a geração de células-tronco livre pegada pluripotentes induzidas (iPSCs) de células do pâncreas humanas em condições de livre de alimentador, seguido pela edição usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas e caracterização de modificado clones de célula única.

Eficiente geração e edição de IPSCs livre de alimentador de células pancreáticas humanas utilizando o sistema CRISPR-Cas9

Um protocolo é apresentado para preparar polivinil álcool-co-itacónico ácido hidrogel com rigidez diferentes, que foram enxertados com e sem oligopeptídeos, para investigar o efeito da rigidez dos biomateriais na diferenciação e proliferação de células-tronco. A rigidez do hidrogel era controlada pelo tempo de reticulação.

Cultura de células-tronco pluripotentes humanas em polivinil álcool-Co-itacónico ácido hidrogel com rigidez diferentes condições Xeno-livre

Apresentamos aqui um protocolo para a diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas humanas em cada derivado do somite (Miótomo, sclerotome, dermátomo e syndetome) em condições quimicamente definidas, que tem aplicações em modelagem de doenças futuras e terapias baseadas em células em cirurgia ortopédica.

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

O objetivo do protocolo é comparar diferentes condições de revestimento de matriz extracelular (ECM) para avaliar como o revestimento diferencial afeta a taxa de crescimento de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Em particular, pretendemos estabelecer condições para obter o crescimento ideal das culturas de iPSC.

Medindo a confluência de iPSCs usando um sistema automatizado de imagem.

Aqui descrevemos um protocolo que facilita a diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em astrócitos funcionais específicos do prosencéfalo. Isso permite investigações sobre o papel das células gliais na patogênese de distúrbios do neurodesenvolvimento, como a Síndrome do X Frágil, e modelagem de outros distúrbios cerebrais.

Geração e caracterização de astrócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos sem ribonucleoproteína mensageira X frágil

Aprenda a propagar células-tronco pluripotentes induzidas humanas em pequena escala para caracterização imunocitoquímica de rotina. Este método econômico permite cultivo eficiente em lâminas de câmara para detecção de antigos de pluripotência.

Propagação em pequena escala de iPSCs humano em condições sem soro para a caracterização imunocitoquímica de rotina

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