Visadas In Situ mutagénese de histona Genes em brotamento Yeast

O objetivo geral deste procedimento é gerar mutações específicas em genes de histonas em suas localizações cromossômicas endógenas em células de levedura em brotamento. Este método pode ser usado para determinar a contribuição de resíduos específicos de histonas em uma variedade de processos que usam a cromatina como substrato, como a transcrição de DNA, a cada combinação. A principal vantagem dessa técnica é que genes específicos de histonas podem ser direcionados para mutagênese, apesar do fato de que, na levedura, cada proteína histona é codificada por dois genes não alélicos altamente homólogos.

Depois de gerar uma cepa de levedura com o gene da histona alvo nocauteado e substituído por URA3, gere produtos de PCR para dois fragmentos parcialmente sobrepostos do gene da histona alvo, configurando a seguinte reação para a primeira metade do gene. Para a segunda metade do gene, configure uma reação de PCR semelhante usando diferentes primers. Coloque as reações em um termociclador e configure o seguinte programa.

Execute 20 a 50 microlitros das reações de PCR em um gel de agarose de baixo ponto de fusão a 0,9% em tampão TBE. Em seguida, use uma lâmina de barbear limpa para cortar os produtos de PCR do gel e transfira cada seção para um tubo de 1,5 mililitro. Armazene os pedaços de agarose a 20 graus Celsius até a hora de usar.

Para preparar o DNA molde para as reações de PCR para gerar produtos de PCR em tamanho real, derreta as seções de agarose em um bloco de calor a 65 graus Celsius por cinco minutos. Vórtice os tubos a cada um ou dois minutos para ajudar no derretimento. Transfira uma quantidade definida de agarose derretida de cada amostra para um único tubo de microcentrífuga e misture o tubo por vórtice.

Use isso como modelo para PCR de fusão e armazene a 20 graus Celsius até o uso. Para amplificar uma grande quantidade de produto de PCR de tamanho normal, configure seis reações de PCR, cada uma com os seguintes reagentes. Coloque os tubos no termociclador e execute as reações com as seguintes configurações.

Concentre os produtos de PCR por precipitação e use-os para cotransformação com o plasmídeo de backbone de acordo com o protocolo de texto. Para rastrear a perda do gene URA3 como resultado da integração do produto de PCR, replicar as células da placa das placas 1 a 20 removendo a tampa da placa e pressionando a placa contendo colônias em veludo estéril. Transfira as células do veludo para uma placa de 5-FOA pressionando a placa no veludo.

Incube as placas a 30 graus Celsius por dois dias. Em seguida, inspecione cuidadosamente as placas quanto ao crescimento. Depois de listrar e incubar colônias candidatas em placas YPD de acordo com o protocolo de texto, replicar cada placa de purificação YPD para uma placa YPD nova, para uma placa de dropout sem uracila para verificar a perda do gene URA3 e uma segunda placa de dropout para monitorar a presença ou ausência do plasmídeo de backbone.

Após a incubação, identifique uma colônia de cada amostra candidata que está crescendo na placa YPD, mas não crescendo em nenhuma das placas de dropout. Recoloque essas colônias em placas YPD frescas. Como dizer para a integração adequada do alelo mutante usando PCR de acordo com o protocolo de texto.

Esta figura mostra os resultados da PCR para gerar dois fragmentos de HHT2 parcialmente sobrepostos com as mutações desejadas que, em última análise, resultam em uma alteração do códon AGA para GAA produzindo uma mutação R53E. O resultado de uma reação de PCR de fusão que gerou os produtos de PCR em tamanho real é ilustrado aqui. Os produtos de PCR de tamanho normal continham 195 e 220 regiões de pares de bases homólogas às regiões a montante e a jusante do quadro de leitura aberto HHT2, respectivamente, para conduzir a recombinação homóloga.

Neste exemplo de transformação, os produtos de PCR em tamanho real foram cotransformados com o plasmídeo marcado com HIS-3 e os transformantes foram selecionados em placas sem histidina. As colônias positivas HIS foram então rastreadas para resistência a 5-FOA. Exemplos de candidatos, bem como amostras que provavelmente não representam os eventos de integração desejados, são mostrados.

12 amostras candidatas foram identificadas e submetidas à análise de PCR para substituição do gene URA3 por produtos de PCR mutantes. Quatro candidatos apresentaram integração de um produto de PCR no local correto. Um desses candidatos é mostrado na pista quatro.

Como a mutação AG2GA gera um novo sítio de restrição de EcoR1, a digestão com EcoR1 foi realizada em uma das amostras de PCR de integração bem-sucedidas para demonstrar que a sequência mutante havia de fato sido incorporada ao genoma. Uma vez que todos os reagentes estejam disponíveis, deve ser possível obter células de levedura que abrigam as mutações de histonas desejadas no período de tempo ou 15 a 20 dias. Uma vez que a mutação desejada tenha sido gerada na cepa hospedeira, as células que expressam a proteína histona alvo apenas do gene mutagenizado podem ser obtidas por meio de cruzamentos genéticos apropriados.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os perímetros das reações de PCR podem precisar ser ajustados com base na natureza dos primers específicos usados nos experimentos e nos tamanhos esperados dos produtos de PCR. Embora este procedimento seja adequado para a mutagênese do gene das histonas, pois permite o direcionamento de um gene específico da histona, apesar da presença de um segundo gene altamente homólogo e não alélico, ele também pode ser usado para gerar mutações em outros locais genômicos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar mutações de histonas NC2 direcionadas em leveduras em brotamento usando uma combinação de abordagens de PCR e técnicas de genética de leveduras.

Não se esqueça de que a exposição à luz ultravioleta pode ser extremamente perigosa, e óculos, escudos e roupas de proteção devem sempre ser usados ao trabalhar com um transiluminador UV. Use também luvas, óculos de proteção e roupas de proteção durante a maioria das etapas do procedimento.