Name: Visadas In Situ mutagénese de histona Genes em brotamento Yeast (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Aprenda a gerar mutações específicas em genes de histonas em locais cromossômicos endógenos de Saccharomyces cerevisiae. Este método permite investigar o papel de resíduos específicos em processos de cromatina como transcrição de DNA.

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Agradecemos a Reine Protacio pelos comentários úteis durante a preparação deste manuscrito. Expressamos nossa gratidão à National Science Foundation (subsídios nº 1243680 e 1613754) e ao Hendrix College Odyssey Program pelo apoio financeiro.

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O nível elevado de homologia de sequências entre os dois genes não alélicos que codificam para cada uma das quatro proteínas histona de núcleo em células haplóides de S. cerevisiae pode representar um desafio para os investigadores que desejam atingir especificamente um dos dois genes para a mutagénese. Anteriormente descreveu metodologias de mutagénese de levedura, incluindo a Delitto Perfetto, genómico de mutagénese específica do local (SSG), e métodos de substituição alelo baseada em PCR livre de cl...

Os quatro proteínas histonas centrais H2A, H2B, H3, H4 e desempenham papéis centrais na compactação, organização e função dos cromossomas eucarióticos. Dois conjuntos de cada uma destas histonas formar o octâmero da histona, um carretel molecular que dirige o invólucro de ~ 147 pares de bases de ADN em torno de si, resultando na formação de um nucleossoma 1. Nucleossomas são agentes activos numa variedade de processos à base de cromossomas, tais como a regulação da transcrição de genes e a formação de eucromatina e heterocromatina entre cromossomas, e, como tal, têm sido o foco de intensa investigação ao longo de várias décadas passadas. Um número de mecanismos têm sido descritos por nucleossomas que podem ser manipulados em formas que podem facilitar a execução dos processos específicos - estes mecanismos de modificação pós-tradução incluem os resíduos de histonas, remodelar nucleossoma dependente de ATP, e reorganização nucleossoma ATP-independentee montagem / desmontagem 2, 3. A levedura de germinação Saccharomyces cerevisiae é um organismo particularmente poderoso modelo para a compreensão da função da histona em eucariotas. Isto pode ser em grande parte atribuído ao elevado grau de conservação evolutiva das proteínas histona eukarya todo o domínio e a receptividade de levedura para uma variedade de genética e bioquímica experimental aproxima 4. abordagens Reverse-genéticos nas leveduras têm sido amplamente utilizada para estudar os efeitos de mutações específicas de histona sobre vários aspectos da biologia da cromatina. Para estes tipos de experiências é frequentemente preferível a utilização de células em que as histonas mutantes são expressos a partir de loci genómico nativo, como a expressão a partir de plasmídeos autónomos podem levar a níveis anormais intracelular de proteínas histona (devido a diferentes números de plasmídeos em células) e alteração concomitante da cromatina enam-, que em última instância pode confundir a interpretação dos resultados. Aqui, nós descrevemos uma técnica baseada em PCR que permite a mutagénese direccionada de genes de histonas nas suas localizações genómicas nativas, que não requerem um passo de clonagem e resulta na produção da mutação (ões) desejada, sem sequências de ADN exógeno que sobram no genoma. Esta técnica tira proveito do sistema de recombinação homóloga eficiente em levedura e tem várias características em comum com outras técnicas semelhantes desenvolvidas por outros grupos - mais notavelmente o Delitto Perfetto, genômica mutagénese específica (SSG), e alelo à base de PCR clonagem-livre métodos de reposição de 5, 6, 7. No entanto, a técnica que descrevem tem um aspecto que o torna particularmente adequado para a mutagénese de genes de histonas. Em células de levedura haplóides, cada um dos quatro histonas nucleares é codificada por dois não-Agenes llelic e altamente homólogas: por exemplo, histona H3 é codificado pelos genes HHT1 e HHT2, e as grelhas de leitura abertas (ORFs) dos dois genes são mais de 90% idênticos na sequência. Este elevado grau de homologia pode complicar experiências concebidas para visar especificamente um dos dois genes codificadores de histonas para mutagénese. Considerando que os métodos acima mencionados exigem frequentemente a utilização de, pelo menos, algumas sequências dentro da ORF do gene alvo para dirigir recombinação homóloga, a técnica aqui descrita faz uso das sequências que flanqueiam as ORFs dos genes de histonas (que partilhem menos homologia de sequência) para o passo de recombinação, aumentando assim a probabilidade de sucesso de mutagénese direccionamento ao local desejado. Além disso, as regiões homólogas que impulsionam a recombinação pode ser muito extensa, contribuindo para a eficiente recombinação homóloga alvo.

<table><tbody><tr><td>1 kb DNA Ladder (padrões de DNA)</td> <td>New England BioLabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5093-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Bórico</td><td>Sigma</td><td>B0394-500G</td><td></td></tr><tr><td>mistura dNTP (10 mM cada)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>Solução EDTA (0.5 M, pH 8.0)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (200 Provas)</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-824</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético sal dissódico di-hidratado (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E4884-500G</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de lítio di-hidratado</td><td>Sigma</td><td>L6883-250G</td><td></td></tr><tr><td>MyCycler Termociclador</td><td>BioRad</td><td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>Poli(etilenoglicol) (PEG)</td><td>Sigma</td><td>P3640-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR HS DNA Polymerase (DNA polimerase de alta fidelidade)&nbsp; e 5x buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-443-960</td><td></td></tr><tr><td>Solução de DNA de esperma de salmão</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Sigma 7-9 (base Tris, forma de pó)</td> <td>Sigma</td><td>T1378-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio trihidratado</td><td>Sigma</td><td>236500-500G</td><td></td></tr><tr><td>Supra Sieve GPG Agarose (agarose de baixa temperatura)</td> <td>AmericanBio</td><td>AB00985-00100</td><td></td></tr><tr><td>Taq Polimerase e 10x Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>M0273X</td><td></td></tr><tr><td>Palitos de dente</td><td>Fisher Scientific</td><td>S67859</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td><td>AmericanBio</td><td>AB14043-01000</td><td></td></tr><tr><td>a-D(+)-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC170080025</td><td>para meios de levedura</td></tr><tr><td></td><td>Agar Fisher Scientific</td><td>DF0140-01-0</td><td>para meios de levedura</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-07-2</td><td>para YPD meio</td></tr><tr><td>Extrato de Levedura</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0127-17-9</td><td>para meio YPD</td></tr><tr><td>4-aminobenzoico ácido</td><td>Sigma</td><td>A9878-100G</td><td>para meio de abandono mínimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A8626-100G</td><td>para meio de dropout mínimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloridrato de glicina</td><td>Sigma</td><td>G2879-100G</td><td>para meio de dropout mínimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Alanina</td><td>Sigma</td><td>A7627-100G</td><td>para meio de abandono mínimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloridrato de L-Arginina</td><td>Sigma</td><td>A5131-100G</td><td>para meio de queda mínima completa&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Asparagina monohidratada</td><td>Sigma</td><td>A8381-100G</td><td>para meio de queda mínima completa&nbsp;</td></tr><tr><td>Sal de sódio de ácido L-aspártico monohidratado</td><td>Sigma</td><td>A6683-100G</td><td>para meio de queda mínima completa&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloridrato de L-cisteína monohidratado</td><td>Sigma</td><td>C7880-100G</td><td>para meio de queda mínima completa&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloridrato de ácido L-glutâmico</td><td>Sigma</td><td>G2128-100G</td><td>para meio de dropout mínimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma</td><td>G3126-100G</td><td>para meio de abandono mínimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloridrato de L-Histidina monohidratado</td><td>Sigma</td><td>H8125-100G</td><td>para meio de dropout mínimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Isoleucina</td><td>Sigma</td><td>I2752-100G</td><td>para meio de abandono mínimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>Sigma</td><td>L8000-100G</td><td>para meio de abandono mínimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloridrato de L-lisina</td><td>Sigma</td><td>L5626-100G</td><td>para meio de queda mínima completa&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Sigma</td><td>M9625-100G</td><td>para meio de abandono mínimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Fenilalanina</td><td>Sigma</td><td>P2126-100G</td><td>para meio de abandono mínimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma</td><td>P0380-100G</td><td>para meio de abandono mínimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Serine</td><td></td><td>Sigma S4500-100G</td><td>para um meio de dropout mínimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Treonina</td><td>Sigma</td><td>T8625-100G</td><td>para meio de abandono mínimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Triptofano</td><td>Sigma</td><td>T0254-100G</td><td>para meio de abandono mínimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Tirosina</td><td>Sigma</td><td>T3754-100G</td><td>para meio de abandono mínimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Valina</td><td>Sigma</td><td>V0500-100G</td><td>para meio de abandono mínimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>myo-Inositol</td><td>Sigma</td><td>I5125-100G</td><td>para meio de queda mínima completa&nbsp;</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>para meio de abandono mínimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>Sulfato de Amônio</td><td>Fisher Scientific</td><td>A702-500</td><td>para meio de abandono mínimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>Base de Nitrogênio de Levedura</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0919-07-3</td><td>para meio de dropout mínimo completo&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido 5-fluoroorótico (5-FOA)</td><td>AmericanBio</td><td>AB04067-00005</td><td>para&nbsp; meio 5-FOA</td></tr></tbody></table>

visadas<em&gt; in situ</em&gt; mutagénese de histona genes em brotamento yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Descrevemos um sistema baseado em PCR e recombinação homóloga para gerar mutações direcionadas em genes de histonas em células de levedura em brotamento. Os alelos mutantes resultantes residem em seus sítios genômicos endógenos e nenhuma sequência de DNA exógena é deixada no genoma após o procedimento. Uma vez que em células de levedura haplóides cada uma das quatro proteínas histonas principais é codificada por dois genes não alélicos com quadros de leitura abertos (ORFs) altamente homólogos, direcionar a mutagênese especificamente para um dos dois genes que codificam uma proteína histona específica pode ser problemático. A estratégia que descrevemos aqui contorna esse problema utilizando sequências fora, e não dentro, da ORF dos genes-alvo para a etapa de recombinação homóloga. Outra característica desse sistema é que as regiões do DNA que conduzem as etapas de recombinação homóloga podem ser muito extensas, aumentando assim a probabilidade de eventos de integração bem-sucedidos. Essas características tornam essa estratégia particularmente adequada para a mutagênese do gene das histonas, mas também pode ser adaptada para a mutagênese de outros genes no genoma da levedura.

Descrevemos a geração de um alelo hht2 expressando uma proteína mutante da histona H3 abrigando uma substituição na posição 53 a partir de uma arginina para um ácido glutâmico (H3-R53E mutante) como um exemplo representativo do alvo na estratégia de mutagénese in situ. Geramos uma estirpe em que toda a ORF de HHT2 é substituído pelo gene URA3 (veja o passo 1 do protocolo). ...

Uma estratégia para gerar mutações em genes de histonas em sua localização endógena em Saccharomyces cerevisiae é apresentada.

Visadas<em&gt; In Situ</em&gt; mutagénese de histona Genes em brotamento Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar mutações específicas em genes de histonas nas suas localizações cromossômicas endógenas em células de levedura brotante. Este método pode ser utilizado para determinar a contribuição de resíduos específicos de histonas em uma variedade de processos que utilizam a cromatina como substrato, como a transcrição do DNA, em todas as combinações. A principal vantagem desta técnica é que genes específicos de histonas podem ser direcionados para mutagênese, apesar de, na levedura, cada proteína de histona ser codificada por dois genes não alélicos altamente homólogos.Após gerar uma linhagem de levedura com o gene da histona alvo inativado e substituído por URA3, gere produtos de PCR para dois fragmentos parcialmente sobrepostos do gene da histona alvo preparando a seguinte reação para a primeira metade do gene. Para a segunda metade do gene, prepare uma reação de PCR semelhante utilizando primers diferentes. Coloque as reações em um termociclador e configure o seguinte programa.Execute de 20 a 50 microlitros das reações de PCR em um gel de agarose de ponto de fusão baixa a 0,9% em tampão TBE. Em seguida, utilize uma lâmina de barbear limpa para co

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Estudos de genética em leveduras podem ser empregadas para investigar as funções de celular e molecular dos genes humanos no metabolismo do DNA celular. Métodos são descritos para a caracterização genética do ser...

Estudos genéticos de proteínas de reparo do DNA Humano Utilizando Levedura como um sistema modelo

O ensaio de translocação HO-estimulado monitores vertente única de recozimento após a criação do DNA dupla fita-breaks em loci múltiplos em...

Quantificação e análise da formação de HO-endonuclease Stimulated translocações cromossômicas por Strand Único Annealing em Saccharomyces cerevisiae</em

Fonte: Bennett, S. A., et al., Caracterizando alterações de modificação pós-tradução de histonas em modelos de proteinopatia neurodegenerativa de levedura. J. Vis. Exp. (2019). Este vídeo demonstra o procedimento de avaliação de modificações de histonas em células de levedura que superexpressam proteínas neurodegenerativas. As etapas incluem lise celular, centrifugação, eletroforese, transferência de membrana e detecção baseada em anticorpos de histonas modificadas.

Detecção de modificações de histonas em células de levedura com superexpressão de proteínas neurodegenerativas

Geneticamente codificado histona-miniSOG induz mutações hereditárias do genoma de uma forma dependente da luz azul. Este método de mutagénese é simples, rápido, livre de produtos químicos tóxicos, e bem adequada para triagem genética para a frente e integração do transgene.

A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em<em&gt; C. elegans</em

Aqui, descrevemos um protocolo para a imunoprecipitação da cromatina de histonas modificadas de brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA é usado posteriormente para PCR quantitativo para interrogar a abundância e a localização de modificações borne-translational do histone durante todo o genoma.

Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP) de Modificações de Histonas de Saccharomyces cerevisiae

Este artigo descreve uma metodologia detalhada para o mutagenesis aleatório de um gene alvo no fermento de fissão. Como exemplo, temos como alvo rpt4 +, que codifica uma subunidade do proteossomo 19S e tela para as mutações que desestabilizam a heterocromatina.

Gene-alvo Mutagenesis aleatório para selecionar heterocromatina-desestabilizando Proteassoma mutantes no fermento de fissão

Ribonucleotídeos estão entre os mais abundantes nucleotídeos não-canônicos incorporados do genoma durante a replicação do DNA nuclear eucariótica. Se não forem devidamente removidos, ribonucleotídeos podem causar mutagênese e dano do ADN. Aqui, apresentamos duas abordagens experimentais que são usadas para avaliar a abundância de incorporação de ribonucleotídeo DNA e seus efeitos mutagénicos.

Estudando ribonucleótido incorporação: Deteção de vertente específica de ribonucleotídeos no genoma da levedura e mutagênese induzida pela ribonucleotídeo de medição

Aqui apresentamos quatro protocolos para construir e explorar cepas de levedura Saccharomyces cerevisiae reporter para estudar o potencial de transativação do p53 humano, impactos de suas várias mutações associadas ao câncer, proteínas interagindo coexpressas e os efeitos de moléculas pequenas específicas.

Fermento como um chassi para desenvolver ensaios funcionais para estudar p53 humano

Apresentamos um protocolo de tela simples supressor em fissão fermento. Este método é eficiente, livre de mutagênico e seletiva para as mutações que ocorrem frequentemente em um único locus genômico.  O protocolo é apropriado para isolar supressores que aliviar defeitos de crescimento em cultura líquida que são causados por uma mutação ou uma droga.

Uma tela de supressor de Deep-sequenciamento-assistida, espontânea na fissão levedura Schizosaccharomyces pombe

A microscopia de lapso de tempo é uma ferramenta valiosa para estudar a meiose em leveduras em brotamento. Este protocolo descreve um método que combina sincronização do ciclo celular, microscopia de lapso de tempo e depleção condicional de uma proteína-alvo para demonstrar como estudar a função de uma proteína específica durante a segregação cromossômica meiótica.

Uso de microscopia Time-Lapse e Depleção Nuclear Específica de Estágio de Proteínas para Estudo da Meiose em S. cerevisiae

O enriquecimento e sequenciamento do DNA nascente associado a proteínas (eSPAN) foi desenvolvido para detectar a abundância relativa de uma proteína associada à cromatina em duas fitas replicantes de DNA, revelando assim insights moleculares sobre a replicação da cromatina e seus processos acoplados. Este protocolo descreve procedimentos de eSPAN em células-tronco embrionárias (ES) de levedura e camundongo.

Análise específica de fitas de proteínas em fitas de DNA replicantes por enriquecimento e sequenciamento do método de DNA nascente associado a proteínas

Aprenda a gerar mutações específicas em genes de histonas em locais cromossômicos endógenos de Saccharomyces cerevisiae. Este método permite investigar o papel de resíduos específicos em processos de cromatina como transcrição de DNA.

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