A Câmara customizáveis ​​para a migração celular de medição

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma maneira simples de estudar os efeitos dos agentes quimiotáticos e quimiopulsivos na migração celular. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos de interação celular, como os efeitos de diferentes fatores de crescimento na cicatrização de feridas. A principal vantagem dessa técnica é que ela é facilmente personalizável para diferentes aplicações e simples de usar para pesquisadores de todos os níveis de habilidade.

Demonstrando o procedimento estarão Aniqa Chowdhury, uma estudante de graduação, e Tyler Harvey, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para começar, crie um arquivo CAD com a forma desejada do microcanal. Ajuste a largura e o comprimento do canal para obter o gradiente necessário.

Aqui, quadrados de 2,254 centímetros são conectados por um canal de 0,127 centímetro de largura. Em seguida, obtenha um pedaço de acrílico com a espessura desejada para criar a profundidade adequada do microcanal. Uma largura de folha de acrílico de cerca de um décimo sexto de polegada é ideal, pois folhas mais grossas são difíceis de cortar e folhas muito finas podem quebrar ou deformar durante o processo.

Importe o arquivo CAD para um aparelho de corte a laser e coloque a peça de acrílico na superfície de corte. Em seguida, corte a câmara, de acordo com o protocolo do fabricante. Coloque o recorte de acrílico em forma de barra recém-cortado em uma pequena placa de Petri e cubra-o até que seja necessário.

Em um barco de pesagem, adicione dez partes de uma base de elastômero, com uma parte do agente de cura e mexa usando uma micropipeta por cinco minutos. Transfira a mistura para uma câmara de vácuo e puxe o aspirador por 30 minutos para remover quaisquer bolhas de ar presas no PDMS. Quando terminar, desligue o aspirador e remova o barco de pesagem.

Despeje o PDMS desgaseificado em cima de um recorte de acrílico em forma de barra em uma pequena placa de Petri. Certifique-se de que o PDMS cubra completamente o inserto. Deixe o PDMS curar por pelo menos 18 horas em temperatura ambiente, depois corte cuidadosamente o PDMS ao redor da peça de acrílico com um bisturi e remova a inserção.

Em um gabinete de cultura de células padrão, coloque a câmara de microcanais em uma placa de Petri, com o lado voltado para cima e cubra-a completamente com etanol 70%. Em seguida, feche o capô e acenda a luz ultravioleta. Exponha a câmara à luz ultravioleta por uma a duas horas.

Após a exposição, abra a capela de fluxo laminar e aguarde 15 minutos para que a capela de fluxo restabeleça o fluxo. Em seguida, remova o etanol 70% e lave as câmaras duas vezes com PBS estéril. Use um mililitro de PBS para cada lavagem.

Após a lavagem final, remova o PBS e deixe as câmaras secarem durante a noite com as tampas abertas. Colha o tipo de célula a ser testada e adicione 100 microlitros da suspensão celular a 400 microlitros de azul de 0,4% de tripano e misture delicadamente. Aplique 100 microlitros desta solução no hemocitômetro, preenchendo suavemente ambas as câmaras sob a lamínula de vidro.

Use um microscópio com objetiva de 10x para focar na grade do hemocitômetro. Em seguida, use um contador manual para contar as células vivas e não sustentadas em todos os quatro conjuntos de 16 quadrados no hemocitômetro. Divida o número total de células por quatro e multiplique esse número por 50.000 para obter o número de células por mililitro de suspensão celular.

Com base nesse cálculo, adicione 2500 células e 100 microlitros de meio a um poço em cada câmara. Deixe as células repousarem na câmara por 60 minutos e, em seguida, adicione mais meios. Para começar, adicione agarose à água e aqueça a solução no micro-ondas por um minuto ou até que a agarose esteja completamente dissolvida e a solução límpida.

Deixe a solução esfriar por 15 a 30 segundos antes de despejar em uma placa de Petri. Para remover quaisquer bolhas, coloque a placa de Petri em uma câmara de vácuo e deixe a agarose solidificar sob vácuo por 30 minutos. Depois de solidificado, corte um cubo de agarose de dois milímetros por dois milímetros por dois milímetros com um bisturi da placa de Petri.

Mergulhe completamente o cubo em uma solução contendo a concentração desejada do fator tático de quimioterapia e mergulhe o bloco de agarose durante a noite em temperatura ambiente. Em seguida, coloque o bloco de agarose contendo o fator tático de quimioterapia na extremidade da câmara do microcanal. Utilize um marcador, como microesferas de poliestireno ou um defeito microscópico na câmara.

Para identificar o local de partida relativo das células. Use o software de imagem para obter imagens com lapso de tempo da frente da célula em movimento a cada hora durante 12 horas. A série de imagens mostrada aqui documenta o movimento de uma frente celular através do canal em resposta a um gradiente de soro fetal bovino colocado na extremidade oposta do canal.

A distância de migração foi medida com base na distância da frente de crescimento de um defeito microscópico no dispositivo. A partir dessas medições, a velocidade média da frente celular foi de 13,4 micrômetros por hora. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em quatro horas, com mais 18 horas de tempo de espera para a cura do PDMS e mais 12 horas para a imagem de lapso de tempo.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores de diferentes níveis de habilidade, incluindo estudantes de graduação com pouca experiência em laboratório, para explorar facilmente a cicatrização de feridas e a migração celular in vitro. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de remover cuidadosamente a inserção de acrílico do molde PDMS para garantir a produção bem-sucedida de uma câmara de microcanal. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir uma câmara de microcanal simples para estudar a migração celular em resposta a diferentes pistas químicas.

Após este procedimento, outras pistas podem ser estudadas, como múltiplos gradientes químicos solúveis, substratos, fluidos puros e campos elétricos, a fim de estudar o efeito que eles têm na migração celular. Não se esqueça de que trabalhar com cortadores a laser pode ser extremamente perigoso e precauções como obter treinamento adequado e usar equipamentos de proteção individual devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.