Name: Diferenciação eficiente dos Pluripotent Stem Cells para NKX6-1 + Progenitores pancreáticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprenda a diferenciar células-tronco pluripotentes humanas em progenitores pancreáticos NKX6-1+ através de um protocolo de quatro estágios. Este método gera altas porcentagens de células progenitoras para estudo do desenvolvimento pancreático e pesquisa sobre diabetes.

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Este manuscrito foi apoiado pelo financiamento do Toronto General e Fundação Ocidental e o Prêmio de Pós-Graduação Banting e Melhor Diabetes Centre-University Health Network.

1. Preparação de Soluções e mídia Nota: Preparar todos os meios para cultura de células em um ambiente estéril. Meios tem de ser feito e usado imediatamente. Reagente detalhes são fornecidos na Tabela Materiais. <ol><li> mídia diferenciação <ol><li> Prepare Dia 0 Diferenciação Meio: Meio RPMI com 1% de glutamina, 2 uM CHIR 99021, 100 ng / ml de Activina A, 10 4 H MTG. </li><li> Prepare Dia 1-2 Diferenciação Meio: Meio RPMI com 1% de glutamina, 100 ng / ml de Activina A, 10 4 H MTG, 5 ng / ml de bFGF, Ácido 50 ^ g / ml ascórbico. </li><li> Prepare Dia 3-5 Diferenciação de mídia: Meio RPMI com 1% de glutamina, 1% de B27, 10 4 M MTG, 0,75 mM Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10. </li><li> Prepare Dia 07/06 Diferenciação Meios: DMEM com 1% de glutamina, 1% de B27, 50 ug / ml de ácido ascórbico, 50 ng / ml FGF10, 0,25 uM sant-1, 2 uM de ácido retinóico, 50 ng / ml NOGGIN. NOTA: retinóicoÁcido deve ser adicionado ao meio passado e mídia deve ser protegido da luz para evitar a degradação oxidativa 15. </li><li> Prepare Dia 12/08 Diferenciação Meios: DMEM com 1% de glutamina, 1% de B27, 50 ug / ml de ácido ascórbico, 50 ng / ml NOGGIN, 100 ng / ml de hEGF, nicotinamida a 10 mM. </li></ol></li><li> Preparar tampão de FACS: 10% de FBS em PBS, menos de cálcio e de magnésio. </li></ol> Diferenciação 2. HESC NOTA: HESC são descongeladas, passadas e expandido em ratos irradiados fibroblastos embrionários na presença de uma mídia baseada em KOSR suplementado com bFGF 16. HESCs estão prontos para a diferenciação quando as células atingem 80-95% de confluência. Neste momento, as colónias devem ser grandes com fronteiras definidas e um &#39;abobadado&#39; estrutura (Figura 1A). Toda a cultura de células é realizada no de fundo plano, de cultura de tecidos tratados placas revestidas com gelatina a 0,1%. Tipicamente, as células são cultivadas em 6 ouplacas de 12 poços, em volumes de mídia de 2 ml ou 1 ml, respectivamente. <ol><li> No dia 0, começam a diferenciação através da substituição de meios de comunicação baseada em KOSR de Dia 0 Diferenciação de mídia. </li><li> Nos dias 1 e 2, agitar suavemente a placa para remover as células mortas da camada simples antes de aspirar. Substituir com o Dia 1-2 Diferenciação de mídia. </li><li> No dia 3, as células de colheita para citometria de fluxo. Se as células expressam mais de 90% CXCR4 + / CD117 +, avance para o passo 2.4. </li><li> Nos dias 3 e 5, agitar suavemente a placa para remover as células mortas da camada simples de antes da aspiração. Substituir com o Dia 3-5 Diferenciação de mídia. </li><li> Nos dias 6 e 7, substitua com o Dia 6-7 Diferenciação de mídia. </li><li> Nos dias 8, 10 e 12, substitua com o Dia 12/08 Diferenciação de mídia. </li><li> No dia 13, as células de colheita para citometria de fluxo para determinar Pdx1 e expressão NKX6-1. </li></ol> 3. Células de colheita para Análise de Citometria de Fluxo <ol><li> Dissociar as células com1x solução de tripsina comercial de acordo com o protocolo do fabricante e incubar a 37 ° C durante 3 min. </li><li> Remoção da solução de tripsina comercial e ressuspender as células individuais em 1000 ul de tampão de FACS com 30 ul de DNase I. </li><li> células de filtro, utilizando um filtro de células de malha de nylon de 35 mm e transferir para um tubo de microcentrífuga. </li><li> células centrifugar a 455 xg por 5 min. Preparar células para qualquer coloração vivas ou fixadas. </li></ol> 4. Coloração para citometria de fluxo <ol><li> Fluxo de preparação para a coloração ao vivo no dia 3 <ol><li> Ressuspender as células em 1.000 mL FACS buffer. Transferir 200 ul (cerca de 1-3 x 10 5 células) em duas cavidades de uma placa de 96 poços (para ambas as amostras não coradas e manchados). </li><li> Centrifugar a placa a 931 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante invertendo a placa. </li><li> Mancha com anticorpos primários conjugados, CXCR4: APC e CD117: PE (ver MATERIAIS Tabela) para 30 min à temperatura ambiente protegida da luz. </li><li> Centrifugar a placa a 931 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante invertendo a placa. </li><li> Suspenda as amostras em 100 mL FACS buffer. </li><li> Centrifugar a placa a 931 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante invertendo a placa. </li><li> Ressuspender cada amostra e de transferência, num volume total de 300-500 ul de tampão de FACS a 1 ml micro tubos de ensaio ou tubos de 5 ml de fundo redondo. </li><li> As amostras são executados no citômetro de fluxo 17. Se as amostras não pode ser executado imediatamente, armazenar a 4 ° C protegido da luz. </li></ol></li><li> Fluxo de preparação para a coloração fixo no dia 13 <ol><li> Ressuspender o sedimento de células em solução de fixação / permeabilização comercial durante 24 horas a 4 ° C. </li><li> Centrifugar a amostra a 455 xg durante 5 min. Ressuspender em 400 ul solução Perm / Wash. </li><li> Transferir 200 ul da amostra (cerca de 0,5-1 x 10 6 células) para twO poços de uma placa de 96 poços (para controlo de IgG e Pdx1 / NKX6-1 coloração). Centrifugar a 931 g durante 2 min. </li><li> Ressuspender as peletes de células em 100 ul de solução de Perm / Wash contendo anti-Pdx1 e anticorpos de controlo de isotipo ou primário anti-NKX6-1 (ver Materiais Tabela). Incubar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Centrifugar a placa a 931 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante invertendo a placa. Suspenda as amostras em 100 ul solução Perm / Wash. </li><li> Centrifugar a placa a 931 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante invertendo a placa. </li><li> Ressuspender as amostras em 100 ul Perm / Wash contendo anticorpos secundários à temperatura ambiente durante 1 hora ao abrigo da luz. </li><li> Centrifugar a placa a 931 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante invertendo a placa. </li><li> Suspenda as amostras em 100 ul Perm Solution / Wash. </li><li> Centrifugar a placa a 931 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante invertendo a placa. </li><li> Repcomer passo 4.2.9 e 4.2.10. </li><li> Ressuspender cada amostra e de transferência, num volume total de 300-500 ul de tampão de FACS a 1 ml micro tubos de ensaio ou tubos de 5 ml de fundo redondo. </li><li> As amostras são executados no citômetro de fluxo 17. Se as amostras não pode ser executado imediatamente, armazenar a 4 ° C protegido da luz. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Canadian Diabetes Association. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes">http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes</a> (2016).</li>
<li>Cogger, K., Nostro, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+cell+replacement+therapies+for+the+treatment+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes.</a> Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+NKX6-1%2B+pancreatic+progenitors+from+multiple+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines.</a> Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).</li>
<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Functional+Human+Pancreatic+beta+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. , (2014).</li>
<li>Kroon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+endoderm+derived+from+human+embryonic+stem+cells+generates+glucose-responsive+insulin-secreting+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo.</a> Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+functional+islets+capable+of+treating+pre-existing+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice.</a> Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li>
<li>Gouon-Evans, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-4+is+required+for+hepatic+specification+of+mouse+embryonic+stem+cell-derived+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm.</a> Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).</li>
<li>Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-promoter-factor+1+is+required+for+pancreas+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice.</a> Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).</li>
<li>Pan, F. C., Wright, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+organogenesis%3A+from+bud+to+plexus+to+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland.</a> Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).</li>
<li>Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nkx6+transcription+factors+and+Ptf1a+function+as+antagonistic+lineage+determinants+in+multipotent+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors.</a> Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multipotent+progenitor+domain+guides+pancreatic+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis.</a> Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).</li>
<li>Sander, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+Nkx6.1+lies+downstream+of+Nkx2.2+in+the+major+pathway+of+beta-cell+formation+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas.</a> Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).</li>
<li>Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+stability+in+stem+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid stability in stem cell cultures.</a> Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).</li>
<li>Korytnikov, R., Nostro, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+polyhormonal+and+multipotent+pancreatic+progenitor+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells.</a> Methods. , 56-64 (2016).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+signaling+through+TGFbeta+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Development. 138 (5), 861-871 (2011).</li>
<li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+system+for+production+of+functional+pancreatic+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 7 (5), e37004(2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Gerando sucesso NKX6-1 + progenitoras pancreáticas de hPSCs in vitro baseia-se no uso de culturas de alta qualidade de hPSCs e diferenciação dirigida envolvendo a regulação precisa de vias de sinalização específicas que regem as principais fases de desenvolvimento durante o desenvolvimento pancreático. Embora este protocolo pode ser utilizado para induzir a expressão robusta de NKX6-1 através de uma variedade de linhas HPSC como previamente mostrado 3, para assegurar a geração...

A prevalência de diabetes está a aumentar e de acordo com a Canadian Diabetes Association, estima-se que mais de 11 milhões de pessoas no Canadá são diabéticos ou pré-diabéticos, com 5-10% destes indivíduos com diabetes tipo 1 (DM1) 1. DM1 é uma doença auto-imune que é causada pela destruição das células beta produtoras de insulina que estão localizados dentro das ilhotas de Langerhans. Atualmente, as pessoas que vivem com DM1 necessitam de fontes exógenas de insulina 2. Apesar dos avanços na terapia com insulina, os pacientes DM1 continuar a ter um tempo difícil regular os seus níveis de glicose no sangue e continuam a sofrer tanto hipo e hiperglicemia. Uma forma promissora de tratamento para restabelecer a normoglicemia em DM1 é a utilização de células estaminais embrionárias humanas (hESCs), que poderiam ser utilizados para gerar um fornecimento ilimitado de células beta produtoras de insulina tanto in vivo como in vitro 3, <s-se class = &quot;xref&quot;&gt; 4, 5, 6, 7. Diferenciando hESCs a p-como células poderia tornar possível o estudo de diabetes in vitro, permitindo a identificação de novos alvos terapêuticos para a diabetes tipo 2 e proporcionar células para transplante em pacientes com DM1. A tentativa mais bem sucedida na geração de células produtoras de insulina a partir de hESCs in vitro é de recapitular os eventos embrionárias que ocorrem durante o desenvolvimento pancreático 4, 5. Isso envolve a manipulação de vias de sinalização distintas para modelar com precisão as principais fases do pâncreas em desenvolvimento. Desenvolvimento pancreático começa com a indução da endoderme definitivo, que se caracteriza pela expressão de CXCR4 e CD117 (c-kit) 8, 9. regulação precisa da definitive organização endoderme é necessário para a formação do tubo digestivo, a qual é então submetida a anterior para posterior padronização e ventral-dorsal. A dorsal e ventral do pâncreas gomos emergir a partir da região do intestino anterior posterior, que expressa o gene homeobox pancreático e duodenal (Pdx1), que é necessária para o desenvolvimento pancreático 10. O dorsal e ventral gomos fundem para formar o pâncreas, que depois sofre uma extensa remodelação epitelial e expansão 11. Compromisso com o sistema endócrino e exócrino linhagem é acompanhada pela geração de células progenitoras multipotentes (PPM) que expressam, entre outros, os factores de transcrição Pdx1, Nkx6.1 e Ptf1a 12, 13. PPM que se tornarão células endócrinas e ductal continuam a expressar Nkx6-1 enquanto diminui a expressão Ptf1a. Contrariamente a isto, as células de linhagem exócrinas perderá expressioN de Nkx6-1 e manter a expressão Ptf1a 12. O factor de transcrição Nkx6-1 tem um papel chave no desenvolvimento pancreático, particularmente durante a diferenciação de células progenitoras endócrinas para células p. Como descrito anteriormente, a exclusão de Nkx6-1 resulta na formação diminuída de células beta do pâncreas 14 durante o desenvolvimento. Portanto, a geração de células p produtoras de insulina, tanto in vitro e in vivo requer a indução eficiente de Nkx6-1. Recentemente, desenvolveu um protocolo para gerar eficiência Pdx1 + / NKX6-1 + progenitoras pancreáticas de hPSCs. Estes progenitores pancreáticas HPSC derivados de gerar células beta maduras em cima do transplante em ratinhos imunodeficientes 3. O protocolo de diferenciação pode ser dividida em quatro etapas características de: 1) indução endoderme definitiva, 2) padronização foregut posterior, 3) especificação de pâncreas e 4) a indução NKX6-1. Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada de cada passo da diferenciação dirigida.

<table><tbody><tr><td><forte>Meios e citocinas</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Tioglicerol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D</td><td>338-AC/CF&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de Ácido Ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Life Technologies</td><td></td><td>12587-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Buffer</td><td>BD Bioscience</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>BD Perm/Wash buffer, 1x</td><td>BD Bioscience</td><td>554723</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>CHIR990210</td><td>Tocris</td><td>4423a</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco» s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>VWR</td><td>80510-412&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorfina</td><td>Sigma</td><td>P5499</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R & D</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td> <td>Wisent</td><td>88150</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R & D</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de pele suína</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma</td><td>NO636</td><td></td></tr><tr><td>NOGGIN</td><td>R& D</td><td>3344-NG</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Ácido retinóico</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>SANT-1</td><td>Tocris</td><td>1974</td><td></td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Express (1x), vermelho de fenol</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Anticorpos para citometria de fluxo (diluições de trabalho)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD117 PE (1:100)</td><td>Life Technologies</td><td>CD11705</td><td></td></tr><tr><td>CXCR4 APC (1:50)</td><td>BD&nbsp; Bioscience</td><td>551966</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), conjugado Alexa Fluor 647 (1:400)</td><td>Life Technologies</td><td>A-31571</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>705-546-147</td><td></td></tr><tr><td>Controle de Isotipo Mouse IgG&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.&nbsp;</td><td>015-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Controle de Isotipo Cabra IgG R</td><td>& D&nbsp; &nbsp;</td><td>AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>NKX6-1 (1:2.000)</td><td>DSHB</td><td>F55A10</td><td></td></tr><tr><td>PDX1 (1:100)</td><td>R& D</td><td>AF2419</td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciação eficiente dos pluripotent stem cells para nkx6-1<sup&gt; +</sup&gt; progenitores pancreáticas

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

As células estaminais pluripotentes têm a capacidade de auto-renovação e diferenciação de várias linhagens, o que os torna numa fonte atraente para a geração de células progenitoras pancreáticas que pode ser usado para o estudo e tratamento futuro da diabetes. Este artigo descreve um protocolo de diferenciação de quatro estágios concebido para gerar células progenitoras pancreáticas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs). Este protocolo pode ser aplicado a um certo número de linhas de células pluripotentes estaminais humanas (HPSC). A abordagem adoptada para gerar células progenitoras pancreáticas é diferenciar hESCs para modelar com precisão as principais fases do desenvolvimento pancreático. Isto começa com a indução da endoderme definitiva, o que é conseguido através da cultura das células na presença de Activina A, Factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) e CHIR990210. Maior diferenciação e padronização com Fator de Crescimento 10 (FGF10) e Dorsomorphin gera células que se assemelham a foregut posterior. A adição de RetinÓico, NOGGIN, SANT-1 e FGF10 diferencia células foregut posterior em células característicos da endoderme pancreático. Finalmente, a combinação do factor de crescimento epidérmico (EGF), a nicotinamida e NOGGIN conduz à geração eficiente de Pdx1 + / + NKX6-1 células. A citometria de fluxo é realizada para confirmar a expressão de marcadores específicos em estágios fundamentais do desenvolvimento pancreático. Os NKX6-1 + / + progenitores pancreáticas Pdx1 no final do estágio 4 são capazes de gerar células beta maduras após transplante em ratinhos imunodeficientes e pode ser ainda mais diferenciado para gerar células produtoras de insulina in vitro. Assim, a geração eficiente de Pdx1 + / NKX6-1 + progenitoras pancreáticas, como demonstrado neste protocolo, é de grande importância, pois proporciona uma plataforma para estudar o desenvolvimento pancreático humano in vitro e fornece uma fonte de células com o potencial de se diferenciar a células beta que poderia eVentually ser utilizado para o tratamento de diabetes.

Geração eficiente de células progenitoras pancreáticas baseia-se no crescimento e manutenção de células indiferenciadas, seguido pela adição precisa de moléculas sinalizadoras específicas durante o protocolo de diferenciação, tal como ilustrado no esquema na Figura 1A. No dia 0, as células indiferenciadas deve ser 80-95% confluentes e colónias devem ter bordas definidos (Figura 1A). Durante a Fase 1, a mídia provavelmente vai parecer nublados desde a mor...

Aqui nós descrevemos um protocolo de 4 estágios para diferenciar as células-tronco embrionárias humanas para NKX6-1 + progenitoras pancreáticas in vitro. Este protocolo pode ser aplicado a uma variedade de linhas de células estaminais pluripotentes humanas.

Diferenciação eficiente dos Pluripotent Stem Cells para NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Progenitores pancreáticas

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar de forma eficiente progenitores pancreáticos que expressem NKX6.1 a partir de células-tronco pluripotentes humanas in vitro, diferenciando as células por meio de quatro estágios-chave do desenvolvimento pancreático. Ao diferenciar células-tronco pluripotentes humanas por meio de quatro estágios principais do desenvolvimento pancreático, este protocolo fornece um modelo para estudar o desenvolvimento do pâncreas humano in vitro. A principal vantagem desta técnica em relação aos protocolos existentes é a capacidade de gerar altas porcentagens de células progenitoras pancreáticas positivas para NKX6.1 utilizando diversas linhagens de células-tronco pluripotentes humanas.Considerando que os progenitores pancreáticos têm a capacidade de gerar células semelhantes a beta produtoras de insulina, esta técnica nos proporcionará a oportunidade de desenvolver células para o tratamento do diabetes, para a descoberta de fármacos e para a modelagem de doenças. No dia zero, inicie a diferenciação substituindo o meio com substituto sérico KnockOut pelo meio de diferenciação do dia zero. Em seguida, nos dias um e dois, agite suavemente a placa para remover quaisquer células mortas da monocamada antes de aspirar o meio.Posteriormente, substitua por meio de diferenciação do dia um ao dois. No terceiro dia, colete as células para citometria de fluxo. Se as células expressarem mais de 90% de CXCR4 e CD117, a eficiência foi atingida.Em seguida, agite suavemente a placa para remover quaisquer células mortas da monocamada antes da aspiração e substitua por meio de diferenciação do dia três ao cinco. É importante garantir a indução eficiente do endoderma definitivo até o dia três por citometria de fluxo. Se a porcentagem de células que expressam CXCR4 e CD117 for inferior a 90%, a diferenciação em progenitores pancreáticos provavelmente será comprometida.Nos dias seis e sete, substitua o meio por meio de diferenciação dos dias seis a sete. Nos dias oito, 10 e 12, substitua o meio por meio de diferenciação dos dias oito a 12. Em seguida, no dia 13, colete as células para citometria de fluxo a fim de determinar a expressão de PDX1 e NKX6.1.Para colher as células para análise por citometria de fluxo, dissocie as células com solução comercial de tripsina de acordo com o protocolo do fabricante e incube as células a 37 graus Celsius por três minutos. Após três minutos, remova a solução de tripsina e re-suspenda as células individuais em 1.000 microlitros de tampão fax com 30 microlitros de DNA One. Em seguida, filtre as células utilizando um filtro celular de malha de náilon de 35 micrômetros e transfira-as para um tubo de microcentrífuga.Centrifugue as células a 455 vezes g por cinco minutos antes de preparar as células para coloração viva ou fixada. Agora, re-suspenda as células em 1.000 microlitros de buffer fax. Transfira 200 microlitros para dois poços de uma placa de 96 poços para as amostras não coradas e coradas.Em seguida, centrifugue a placa a 931 vezes g por dois minutos, depois remova o sobrenadante invertendo a placa, marque as células com anticorpo conjugado primário em um volume final de 100 microlitros por 30 minutos à temperatura ambiente e proteja-as da luz. Posteriormente, centrifugue a placa a 931 vezes g por dois minutos, após dois minutos remova o sobrenadante invertendo a placa. A seguir, re-suspenda as amostras em 100 microlitros de buffer fax.Em seguida, centrifugue a placa a 931 ×g durante dois minutos. E remova o sobrenadante invertendo a placa. A seguir, re-suspenda as amostras em 300 a 500 microlitros de tampão fax, transfira-as para tubos microtest de um mililitro ou para tubos redondos de fundo de cinco mililitros e analise as amostras em citômetro de fluxo.Se as amostras não puderem ser analisadas imediatamente, armazene-as a quatro graus Celsius e proteja-as da luz. Neste procedimento, re-suspenda o pellet celular em solução comercial de fixação e permeabilização por 24 horas a quatro graus Celsius. Após 24 horas, centrifugue a amostra a 455 ×g durante cinco minutos, em seguida re-suspenda-a em 400 microlitros de solução comercial de permeabilização.Em seguida, transfira 200 microlitros da amostra para duas poças de uma placa de 96 poços para controle de IGG e coloração de PDX1 e NKX6.1, centrifugue a placa a 931 ×g por dois minutos. Em seguida, re-suspenda os pellets celulares em 100 microlitros de solução comercial de permeabilização e lavagem contendo os anticorpos primários anti-PDX1 e anti-NKX6.1 ou anticorpos de controle isotópico. Incube durante a noite a quatro graus Celsius.No dia seguinte, centrifugue a placa a 931 vezes g durante dois minutos, remova o sobrenatante invertendo a placa e re-suspenda as amostras em 100 microlitros da solução comercial de permeabilização e lavagem. Em seguida, centrifugue a placa a 931 vezes g durante dois minutos. Remova o sobrenatante invertendo a placa.Em seguida, re-suspenda as amostras em 100 microlitros de solução de permeabilização e lavagem contendo anticorpo secundário, por uma hora à temperatura ambiente, protegendo da luz. Após uma hora, centrifugue a placa a 931 × g durante dois minutos, remova o sobrenadante invertendo a placa, a seguir, re-suspenda as amostras em 100 microlitros de solução comercial de permeabilização e lavagem, centrifugue a placa a 931 × g durante dois minutos, remova o sobrenadante invertendo a placa. Em seguida, re-suspenda a amostra em 100 microlitros de solução comercial de permeabilização e lavagem e centrifugue a placa novamente a 931 × g durante dois minutos antes de remover o sobrenadante.Em seguida, re-suspenda as amostras em 300 a 500 microlitros de buffer de fax e transfira-as para tubos de ensaio separados de um mililitro ou tubos redondos de fundo de cinco mililitros para a realização de citometria de fluxo. É mostrado aqui um esquema da indução de progenitores pancreáticos a partir de células-tronco embrionárias humanas, indicando o dia da diferenciação, estágio de desenvolvimento, meio-base e as citocinas adicionadas em cada estágio. E aqui estão as imagens de contraste de fase nos estágios-chave da diferenciação pancreática.As células H1 foram diferenciadas de acordo com o protocolo de diferenciação em quatro estágios ilustrado. Com células-tronco embrionárias humanas indiferenciadas no dia zero, endoderme definitiva no estágio um, intestino posterior quatro no estágio dois, endoderme pancreática no estágio três e progenitores pancreáticos endodérmicos positivos para NKX6.1 no estágio quatro. Esta figura mostra os gráficos representativos de citometria de fluxo do dia três para a marcação com os anticorpos CXCR4 PE e CD117 APC.Aqui está a amostra não corada e aqui está a amostra corada. Esta figura mostra os gráficos representativos de citometria de fluxo do dia 13 para células progenitoras pancreáticas derivadas do estágio quatro que expressam NKX61 e PDX1. Este é o controle de IGG e esta é a amostra corada.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 13 dias. No entanto, isso pode variar dependendo da linhagem celular utilizada. Ao tentar este procedimento, é importante testar todos os agentes devido à variabilidade entre lotes.Após seguir o procedimento, as células progenitoras pancreáticas positivas para NKX6.1 podem ser ainda mais diferenciadas em células semelhantes a beta produtoras de insulina utilizando outros protocolos publicados. Isso fornece uma plataforma para estudar a maturação e o desenvolvimento de células beta in vitro. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como diferenciar eficientemente células-tronco pluripotentes humanas em progenitores pancreáticos, conduzindo as células por quatro estágios-chave do desenvolvimento.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo demonstra a geração de células progenitoras neurais a partir de células-tronco pluripotentes humanas não transgênicas e transgênicas (hPSCs). As hPSCs são diferenciadas em células progenitoras neurais usando um meio de diferenciação neuronal. Enquanto a diferenciação é induzida em células não transgênicas usando pequenas moléculas, as hPSCs transgênicas são diferenciadas pela adição de um antibiótico que induz o promotor de um fator de transcrição específico de diferenciação neuronal.

Diferenciando Células-Tronco Pluripotentes Humanas Não Transgênicas e Transgênicas em Células Progenitoras Neurais

Aqui, descrevemos um método para a purificação de células-tronco embrionárias humanas diferenciadas que estão comprometidos para a endoderme definitiva para a melhoria das aplicações a jusante e outras diferenciações.

Um método rápido e eficiente para a purificação de células da endoderme Gerado de células estaminais embrionárias humanas

Protocolos para gerar linhagens mutantes HPSC usando a plataforma iCRISPR e diferenciar hPSCs em células ß-like glicose-responsivos são descritos. Combinando tecnologia de edição de genoma com a diferenciação HPSC-dirigida fornece uma plataforma poderosa para a análise sistemática do papel das determinantes da linhagem no desenvolvimento humano e progressão da doença.

Genoma Edição e Directed Diferenciação de hPSCs para interrogar Determinantes Lineage no desenvolvimento pancreático humano

Este protocolo descreve um método para gerar progenitores interneurônio cortical e pós mitóticas interneurônio precursores de células-tronco embrionárias rato usando um método modificado de corpo-a-monocamada do embryoid. Estes precursores/progenitores pode ser usado em vitro fluorescente classificada e transplantado para o neocórtex neonatal para estudar a determinação do destino ou usado em aplicações terapêuticas.

Diferenciação de células estaminais embrionárias de rato em Cortical interneurônio precursores

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para diferenciar as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em proteína de pâncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) células para a geração de linhagens pancreáticas baseiam no crescimento não-colônia tipo monocamada de dissociou células únicas. Este método é adequado para produzir células hPSC-derivado homogêneas, a manipulação genética e rastreio.

Eficiente geração de pâncreas/duodeno Homeobox proteína 1+ Posterior Foregut/pancreático progenitores de hPSCs em culturas de adesão

Este protocolo detalha um monolayer, método soro-livre para gerar eficientemente Hepatocyte-como pilhas das pilhas de haste pluripotentes humanas (hPSCs) em 18 dias. Isto implica seis etapas como hPSCs se diferenciam seqüencialmente em tipos de células intermediárias, como a raia primitiva, endoderma definitivo, foregut posterior e progenitores de broto hepático antes de formar células como hepatócitos.

Diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas em células hepáticas

Neste protocolo, descrevemos uma estratégia de diferenciação estável e altamente eficiente para a geração de neurônios simpáticos pós-ganglionários a partir de células-tronco pluripotentes humanas. Este modelo disponibilizará neurônios para o uso de estudos de múltiplos distúrbios autônomos.

Diferenciação eficiente de neurônios simpáticos pós-ganglionários usando células-tronco pluripotentes humanas em condições de cultura sem alimentadores e quimicamente definidas

O objetivo deste artigo é fornecer uma abordagem padronizada para induzir a diferenciação de progenitor hepático humano das células-tronco pluripotentes. O desenvolvimento deste procedimento com formulações de mídia prontas para uso oferece ao usuário um sistema fácil de gerar células hepáticas humanas para pesquisa biomédica e tradução.

Especificação progenitora hepática de células-tronco pluripotentes usando um sistema de diferenciação definido

O presente protocolo descreve um método aprimorado para aumentar a co-expressão dos fatores de transcrição PDX1 e NKX6.1 em progenitores pancreáticos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em monocamadas planares. Isto é conseguido reabastecendo a matriz fresca, manipulando a densidade celular e dissociando as células endodérmicas.

Diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em precursores de células beta pancreáticas em um sistema de cultura 2D

A diferenciação de células-tronco em ilhotas fornece uma solução alternativa ao tratamento convencional do diabetes e à modelagem da doença. Descrevemos um protocolo detalhado de cultura de células-tronco que combina um kit de diferenciação comercial com um método previamente validado para auxiliar na produção de ilhotas derivadas de células-tronco secretoras de insulina em um prato.

Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Humanas em Aglomerados de Ilhotas Produtoras de Insulina

Este artigo apresenta um protocolo para diferenciação dirigida e análise funcional de células semelhantes a células β. Descrevemos as condições e passagens ideais de cultura para células-tronco pluripotentes humanas antes de gerar células pancreáticas produtoras de insulina. A diferenciação em seis estágios progride desde a formação definitiva da endoderme até células funcionais semelhantes às células β que secretam insulina em resposta à glicose.

Protocolo Otimizado para Geração de Células Funcionais Secretoras de Insulina Pancreáticas a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Aprenda a diferenciar células-tronco pluripotentes humanas em progenitores pancreáticos NKX6-1+ através de um protocolo de quatro estágios. Este método gera altas porcentagens de células progenitoras para estudo do desenvolvimento pancreático e pesquisa sobre diabetes.

Diferenciação eficiente dos Pluripotent Stem Cells para NKX6-1

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