Name: Intracelular Coloração e Citometria de Fluxo para identificar linfócitos subconjuntos dentro Murino Aorta, rim e linfonodos em um modelo de hipertensão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprenda a identificar subconjuntos de linfócitos T em aorta, rim e linfonodos murinos usando coloração intracelular e citometria de fluxo. Este método permite quantificar células imunes em modelos de hipertensão induzida por angiotensina II.

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Este trabalho foi apoiado por uma concessão do American Heart Association Fellowship (16POST29950007) para FL, uma bolsa de formação dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH T32 HL069765) para BLD, um Prêmio Associação Fellowship American Heart (14POST20420025) para MA Saleh, e um NIH prêmio K08 (HL121671) para MSM. MSM também é apoiado por uma bolsa de investigação Gilead Sciences, Inc.

Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Vanderbilt, aprovou os procedimentos aqui descritos. Os ratos são alojados e tratados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Academies Press. Revised 2010). 1. Isolamento da aorta Drenagem Linfática Nodes, rim e aorta de ratos <ol><li> Eutanásia dos ratinhos por inalação de CO2. Pulveriza-se a caixa com 70% de etanol e abrir cuidadosamente a pele e a parede do tórax com uma tesoura para expor o coração. </li><li> Para perfundir a vasculatura, executar uma pequena incisão no átrio direito e constante injectar, pelo menos, 10 ml de PBS frio (cerca de 1 ml / seg) na ponta do ventrículo esquerdo usando uma agulha G 21 ou 23. Perfundir até que todos os órgãos têm empalideceu. O coração empalidece em primeiro lugar. Descascamento do fígado indica que a perfusão foi bem realizada. </li><li> Usando pequenos pinça e tesouras finas, gentilmente cortar e retirar os intestinos,estômago, baço, pâncreas, fígado e para melhor visualizar a aorta. NOTA: Este passo tem de ser feito muito precisamente como lesão do tracto gastrointestinal pode provocar a contaminação. </li><li> Cortar e remover cada pulmão com uma tesoura. Lavar a cavidade torácica com salina tamponada com fosfato (PBS) utilizando uma seringa sem agulha. Retire o excesso de sangue e líquido com gaze estéril. </li><li> Retire os aorta abdominal linfonodos drenam usando uma pinça de dissecação finas. Certifique-se de não romper a cápsula. Remover a gordura restante sobre a superfície de cada nó de linfa com a pinça de dissecação. Cortar os dois rins com uma tesoura fina. </li><li> Dissecar toda a aorta (aorta torácica e abdominal) com finas tesouras, curvas. Comece a nível do coração e cuidadosamente dissecar longe do esófago e das vértebras para baixo para o nível da bifurcação ilíaca certificando-se de manter a gordura perivascular circundante ligada à aorta. NOTA: Além disso dissecção da aorta para remove estruturas circundantes pode ser feito sob um microscópio. Especificamente, remover ramos arteriais (artérias carótidas, artérias subclávia, celíaco, mesentérica, e artérias renais) e gânglios linfáticos. Do manter uma camada consistente de gordura perivascular ao redor de cada aorta uma vez que este é um local onde muitas células inflamatórias residem na configuração da hipertensão. Coloque cada tecido em tubos separados contendo frio PBS. </li></ol> 2. Produção de suspensões de células individuais a partir de cada tecido <ol><li> os rins NOTA: O rim pode ser dissociadas numa suspensão de células individuais através da combinação de dissociação mecânica além de digestão enzimática. <ol><li> Preparar a solução de digestão rim, adicionando colagenase D (2 mg / ml) e DNase I (100 ug / ml) para meio RPMI 1640 (suplementado com 5% de soro fetal de bovino (FBS)). Prepare 10 ml por amostra de rim. </li><li> Utilize uma pinça para transferir os dois rins para um tubo contendo 10 ml de dissociação de rim digerirsolução de iões. </li><li> Realizar a dissociação mecânica usando um dispositivo Dissociator semi-automática de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Após dissociação mecânica, retire o tubo do dispositivo e realizar a digestão enzimática. Incubar as amostras durante 20 min a 37 ° C sob rotação constante. Imediatamente parar a digestão enzimática por adição de frio meio RPMI 1640 suplementado com 5% de FBS. </li><li> Transferir a solução pipetando para um tubo de 50 ml, após filtração através de um filtro de 40 um. Provocar o tecido restante para além pressionando com o êmbolo de uma seringa de 1 ml. Agregar as células (500 x g, 8 min, 4 ° C). </li><li> Ressuspender o sedimento em 3 ml de 36% de meio de centrifugação em gradiente de densidade. Transferir a suspensão para um tubo cónico de 15 ml. Com cuidado, adicionar 3 ml de 72% de meio de centrifugação de gradiente de densidade por baixo da suspensão de células de 3 ml de 36%, sem qualquer interrupção. Centrífuga (1000 xg sem travão, 20 min, 4 ° C). &lt;/ Li&gt; <li> As células do sistema imunológico será localizada na interface. Retirar a camada amarelada de nível superior que contém os restos celulares e, em seguida, levar o volume até 15 ml usando frio PBS. Agite bem ao colapso do gradiente. Rodar as células (300 x g, 8 minutos, 4 ° C) e ressuspender o sedimento em 3 ml de meio RPMI com 5% de FBS. Contar o número de células vivas em um hemocitómetro utilizando exclusão com azul de tripano. </li></ol></li><li> a aorta <ol><li> Preparar a solução de digestão aorta através da adição de colagenase A (1 mg / ml), colagenase B (1 mg / ml) e DNase I (100 ug / ml) para meio RPMI 1640 (suplementado com 5% de FBS). </li><li> Utilizando finos fórceps, transferir a aorta para um tubo de 2 ml contendo 1 ml de solução de digestão aorta. Picar toda a aorta em pequenos pedaços com tesouras finas em solução de digestão de 1 ml. Manter em gelo. Incubar as amostras durante 30 min a 37 ° C sob rotação constante. </li><li> Transferir a solução para um prato de cultura de tecido e interromper a enzymaTic digestão através da adição de 5 vezes o volume de RPMI frio com 5% de FBS. </li><li> Transferir a solução pipetando para um tubo de 50 ml, após filtração através de um filtro de 40 um. Provocar o tecido restante à parte, a uma suspensão de célula única, pressionando com o êmbolo de uma seringa de 1 ml. Lave o filtro e agregar as células (300 x g, 8 minutos, 4 ºC). </li><li> Lava-se a pelete por adição de 10 ml de RPMI com 5% de FBS. Rodar as células (300 x g, 8 minutos, 4 ° C) e ressuspender o sedimento em 3 ml de meio RPMI com 5% de FBS. Contar o número de células vivas em um hemocitómetro utilizando exclusão com azul de tripano. </li></ol></li><li> Os linfonodos da aorta drenagem <ol><li> Coloque um filtro de 40 um num prato de cultura de tecidos (60 mm x 15 mm). Coloque os gânglios linfáticos na peneira e provocá-los à parte, a uma suspensão única célula, pressionando com o êmbolo de uma seringa de 1 ml. Lavar o filtro com 2 ml de RPMI com 5% de FBS. Recolher as células do prato. </li><li> Transferiras células em um tubo falcon 15 ml e sedimentar as células (300 x g, 8 minutos, 4 ºC). Ressuspender o sedimento em 500 ul de meio RPMI com 5% de FBS. Contar o número de células vivas em um hemocitómetro utilizando exclusão com azul de tripano. </li></ol></li></ol> 3. Ex Vivo Estimulação para Detecção de citocinas por citometria de fluxo <ol><li> Prepara-se o meio de cultura celular: RPMI com FBS a 5%, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 50 uM β-mercaptoetanol e 1% de penicilina / estreptomicina. </li><li> Centrifugar cada suspensão de células obtida a partir dos nós renais, da aorta e da linfa (300 x g, 8 minutos, 4 ºC). Ressuspender cada pellet com o meio de cultura celular a uma concentração de 1 x 10 6 culas por ml. </li><li> Estimular as células pela adição de 2 ul do cocktail de activação das células (contendo de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), ionomicina o ionóforo de cálcio, e o inibidor de Golgi Brefeldina A) por cada 1 ml de cultura de células. NOTA: A concentração finalS de cada um dos componentes são os seguintes: 81 nM de PMA, 1,33? M de ionomicina e 5 ug / ml de brefeldina A. O tratamento com PMA e ionomicina activa as células a produzir citocinas. As citocinas são proteínas secretadas que devem ser presos nas células a ser detectado. Brefeldina A faz com que a acumulação de proteínas secretadas normalmente no aparelho de Golgi e do retículo endoplasmático. Assim, a técnica aqui descrita reforça a detectabilidade de linfócitos produtoras de citocinas por citometria de fluxo. </li><li> Placa de 1 a 2 milhões de células em um de 12 poços (aorta ou rins) ou de 24 poços (linfonodo) placas de baixa aderência. Colocar a placa num incubador humidificado de CO2 a 37 ° C durante 3 h. NOTA: O número de células plaqueadas pode ser inferior em nódulos linfáticos de ratinhos de controlo. Além disso, o tempo de estimulação tem de ser determinado empiricamente para cada população de células e produção de citocinas em estudo. No caso de células T isoladas de nódulos da aorta, rim ou linfáticos, recomendamos estimulante durante 3 a 4 horas. A maior estimulação wdoente não aumentar a secreção de citocinas e vai induzir uma regulação negativa mais de vários marcadores de superfície de células T tais como CD3, CD4 e CD8. (Note-se que mesmo uma estimulação de 3-4 h irá induzir alguma regulação baixa destes marcadores.) </li></ol> Coloração 4. Superfície <ol><li> Transferir as células para um tubo de poliestireno de FACS e de centrifugação (300 x g, 8 minutos, 4 ° C). Lavar as células duas vezes com tampão de SCAF (Ca 2+ e Mg + livre de PBS contendo 4% de FBS e 2 mM de EDTA) e a suspensão de células dividir igualmente em diferentes tubos de FACS com base no número de painéis de anticorpos desejados e o número de tubos de controlo necessários ( ver abaixo). </li><li> Para efetuar a compensação para cada painel, preparar tubos de controlo não coradas e tubos manchadas individuais para cada tipo de tecido e painel de anticorpos. Além disso, preparar tubos de fluorescência menos um controlo (FMO) para cada painel de anticorpos por adição de todos menos um dos anticorpos. </li><li> Ajustar o volume de cada tubo a 2 ml com FACSAmortecedor. Centrifugar a suspensão de células (300 x g, 8 minutos, 4 ° C), remover o sobrenadante e receptores Fc bloco através da incubação das células com 0,5 ug de anticorpos anti-CD16 / CD32 por milhão de células durante 10 min em gelo. NOTA: CD16 é baixa afinidade do receptor IgG Fc III (FcR III) e CD32 é FcR II. CD16 / CD32 são expressos em granulócitos, mastócitos, monócitos / macrófagos, células assassinas naturais, células B, células dendríticas e algumas células maduras T activadas. </li><li> Realizar a coloração de viabilidade: Lavam-se as células com PBS 1x, de centrifugação (300 x g, 8 minutos, 4 ° C) e ressuspender em 1000 ul de 1x PBS. Adicionar 1 ml de um corante (mancha de viabilidade) amino-reactivo célula-impermeabilizante. Incubar durante 15 min a 4 ° C protegidos da luz. </li><li> Durante a incubação, preparar o cocktail de anticorpos (por coloração da superfície) num volume apropriado de tampão de FACS. Lavar as células duas vezes com 1-2 ml de tampão de FACS, de centrifugação (300 x g, 8 minutos, 4 ° C) e ressuspender cada sedimento com 100 ulda mistura de anticorpo. Incubar durante 30 min a 4 ° C protegidos da luz. NOTA: Para cada anticorpo citometria de fluxo, que é útil para determinar a quantidade óptima de anticorpo necessário, efectuando uma curva de titulação da dose. </li><li> Lavar as células duas vezes com 2 ml de tampão de FACS e sedimentar as células (300 x g, 8 minutos, 4 ° C). </li></ol> 5. Fixação, permeabilização e intracelulares Coloração <ol><li> Realizar a coloração intracelular com um kit de fixação e permeabilização contendo tampões apropriados, seguindo as instruções do fabricante. Fix e permeabilizar as células por ressuspensão no tampão apropriado. Incubar as amostras durante 40 min a 4 ° C protegidos da luz. </li><li> Adicionar 1 ml de 1x permeabilização e de tampão de lavagem directamente para as células fixadas e permeabilizadas. Centrífuga (500 x g, 8 minutos, 4 ° C) e remover o sobrenadante. Ressuspender o sedimento com 2 ml de 1x tampão de lavagem. </li><li> Preparar as misturas de ANTIBodies (apenas para coloração intracelular) num volume apropriado de tampão de lavagem 1x (geralmente 100 uL por tubo). NOTA: Como descrito acima, a concentração óptima de anticorpo tem de ser determinado para cada anticorpo no painel. Por exemplo, para anticorpos para IL-17A ou IL-17F, usamos um factor de diluição de 1:30, mas para anticorpos anti-IFN-y e de T-bet, usamos um factor de diluição de 1: 100. </li><li> Centrifugar as células (500 x g, 8 minutos, 4 ° C) e ressuspender cada sedimento com 100 ul da mistura de anticorpo. Incubar durante 40 min a 4 ° C protegidos da luz. </li><li> Lavar as células duas vezes com 2 ml de tampão de lavagem 1x e sedimentar as células (500 x g, 8 minutos, 4 ° C). Ressuspender o sedimento com 300 ul de 1x tampão de lavagem e analisar num citómetro de fluxo com filtros adequados. </li><li> Para a quantificação do número total de células por amostra de tecido, utilizar pérolas de contagem. Antes da aquisição, adicione o volume / número recomendado de contagem contas para cada tubo. </li></ol> 6. Remuneração, Gating, Normalização e Dicas <ol><li> Remuneração e gating <ol><li> Executar tubos de controlo coradas não coradas e individuais de compensação para ajustar a sobreposição espectral. NOTA: O uso de esferas de compensação ao invés de controles de compensação baseados em células é necessária nos casos em que o antigénio de interesse ou população de células em uma amostra está presente em níveis tão baixos que a compensação usando células será difícil. Também digno de nota, ao usar corantes em tandem, é aconselhável preparar compensações para cada experimento desde corantes em tandem variam muito-se muito e com cada dia. </li><li> Execute fluorescência menos um controles (QOM) para todos os fluoróforos no painel quando se inicia um novo experimento multicolor. NOTA: Os controles FMO são amostras que contêm todos os anticorpos no painel com exceção de um. Estes controles permitem a discriminação precisa da positiva contra sinais negativos para o anticorpo omitiu Adjus adequadamentet dos portões. Estes controlos são particularmente importantes quando os níveis de expressão seja baixo ou quando a separação da população alvo é pobre (por exemplo, quando o alvo é uma citocina ou factor de transcrição). Apesar de não ser sempre necessário, em alguns casos, os controlos de isotipo podem ser preferidos em lugar de FMO controla uma vez que proporcionam compensação apropriada para o isotipo do anticorpo e conjugado de fluoróforo sem a especificidade do antigénio. </li><li> Configurar o portão principal: ajuste Atacante Área Scatter (FSC-A) e Side Area Scatter (SSC-A) tensão, a fim de detectar a população de leucócitos. </li><li> Excluir as células mortas. NOTA: A mancha de viabilidade reage com aminas livres presentes em ambas a superfície e o interior das células. Em contraste com células vivas, células mortas (com membranas comprometidas) permitir que o corante entrar no citoplasma, aumentando a quantidade de marcação de proteínas. Assim, as células mortas será mais brilhante do que as células vivas, permitindo a discriminação fácil. Porta nas vivocélulas. NOTA: A viabilidade das suspensões de células a partir da aorta e do rim pode ser menor do que a viabilidade das suspensões de células dos nódulos linfáticos, devido à etapa de digestão adicional. </li><li> Lote Área Scatter (FSC-A) [eixo y] e Forward Scatter Altura (FSC-H) [eixo x]. Singlets aparecer como uma diagonal sobre este gráfico de pontos. Portão nesta diagonal para excluir dupletos. Em seguida, traçar SSC-A [eixo y] e CD45 [eixo-x]. </li><li> A população CD45 + de leucócitos pode ser facilmente identificado. Portão sobre esta população. populações subsequentes pode ser identificada a partir desta população. </li></ol></li><li> A normalização da contagem de células <ol><li> colares de contas têm características que resultam em baixo SSC FSC e alta. Por exemplo, se 50.000 grânulos são adicionados a 300 ul da suspensão de células individuais, a equação para o cálculo do número absoluto de qualquer tipo de célula dar por tubo é como se segue: Número de células ptubo er = (50.000 / número de contas contados pelo citômetro de fluxo) x número de células contadas. Usando este cálculo, pode ser determinado o número absoluto de um determinado tipo de célula por tubo. Com base em quantas tubos foram gerados a partir de cada órgão, pode ser calculado o número de células por órgão. NOTA: Mantenha todas as células e reagentes a 4 ° C durante o protocolo. Evite vórtice vigoroso, pois pode danificar as células. Use forças mínimas para sedimentar as células. Evite fazer bolhas no tubo FACS, uma vez que podem precipitar a morte celular. Não deixe que as pastilhas de secar a qualquer momento. </li></ol></li></ol>

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MSM é apoiado por uma bolsa da Gilead Sciences cardiovasculares.

O protocolo aqui descrito foi otimizado para identificar adequadamente subconjuntos de células T presentes nos rins murinos, aorta e linfonodos. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para examinar outros subconjuntos de células imunes, como linfócitos B e células imunes inatas, e pode ser modificado para incluir outros tipos de tecido. A etapa de digestão é crítica e deve ser modificada e otimizada para cada tecido9. Uma etapa de digestão prolongada ou o uso de uma enzima inadequada pode afetar a estabil...

Evidências recentes demonstram que o sistema imunitário adaptativo, em particular linfócitos T, desempenham um papel crítico no desenvolvimento de várias doenças cardiovasculares 1,2,3,4,5. Por exemplo, no modelo de hipertensão induzida por angiotensina II, uma acumulação de células T nos vasos e nos rins de ratinhos foi descrito 6. A acumulação vascular é predominantemente na adventícia ea gordura perivascular. No rim, as células T acumular tanto na medula e no córtex renal. Dependendo de qual subconjunto está envolvida, estas células T dar origem a diferentes citocinas que podem afectar a função renal e vascular e conduzem ao desenvolvimento da patologia (revisto por McMaster e col. 6). Linfócitos auxiliares T CD4 + pode ser dividido em vários sub-grupos: as células T auxiliares 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, Th22, células T reguladoras (Treg), e T auxiliares folicular (TFH) com base nas suas funções e cito assinaturakines 7. Da mesma forma, as células T CD8 + citotóxicas podem ser classificados como Tc1, Tc2, Tc17 ou TC9 8. Existem também células T negativos duplos (isto é, células que não expressam o CD4 ou marcadores de células T CD8 +). Um subconjunto destas células possuem um receptor alternativo gama delta de células T (em vez de os receptores alfa e beta clássicos) e, portanto, são referidas como células T gama delta. A análise de múltiplos parâmetros por citometria de fluxo de marcadores de superfície, citocina e factor de transcrição constitui a melhor abordagem para identificar essas células. Embora este método é amplamente utilizado no campo da imunologia, que é menos bem descritas em órgãos sólidos e na configuração de doenças cardiovasculares. Historicamente, a identificação de linfócitos nos tecidos foi limitado a imuno-histoquímica ou abordagens de RT-PCR. Apesar de imuno-histoquímica e imunofluorescência são poderosos métodos para determinar a distribuição nos tecidos de um antigénio de interest, eles são inadequados para identificar os subconjuntos fenotipicamente envolvidos. Além disso, enquanto que a análise de RT-PCR é útil para detectar a expressão de ARNm de antigénios, citoquinas ou factores de transcrição, que não permite a detecção de proteínas múltiplas simultaneamente ao nível de células individuais. O advento de citometria de fluxo, especialmente quando combinado com a coloração intracelular para detectar citoquinas e factores de transcrição, fornece investigadores com uma técnica poderosa que permite a identificação e quantificação ao nível da célula individual de subconjuntos de células imunitárias em órgãos sólidos. Temos optimizado um ensaio de coloração intracelular para identificar por citometria de fluxo as principais subpopulações de células T presentes no interior do rim murino, da aorta e da aorta nódulos linfáticos de drenagem num modelo de hipertensão induzida por angiotensina II. A optimização de cada passo: digestão do tecido, a activação ex vivo, a permeabilização, e a superfície e os resultados da coloração intracelular em uma altamente reproduzível ensaio que pode ser aplicado a outros modelos de doenças cardiovasculares e renais.

<table><tbody><tr><td>Colagenase D</td><td>ROCHE</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase A</td><td>ROCHE</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase B</td><td>ROCHE</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>ROCHE</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>1x Tampão de lise de glóbulos vermelhos</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1614 1x</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>DPBS sem cálcio e magnésio</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5445-02</td><td>Para centrifugação com gradiente de densidade</td></tr><tr><td>GentleMACS&trade; Tubo C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo dissociador GentleMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>Use o programa SPLEEN_04</td></tr><tr><td>Coquetel de ativação celular (com Brefeldin A)</td> <td>Biolegend</td><td>423303</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD16/32</td><td>eBioscience</td><td>14-0161-81</td><td>diluído 1:100</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD kit de coloração de células mortas violeta fixável</td><td>Life Technologies</td>Conjunto de buffer de fator de transcrição <td>L34955</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Pharmingen</td><td>562725</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>123 contagem eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>CD45 AmCyan (clone 30-F11)</td><td>BioLegend</td><td>103138</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2)</td><td>BioLegend</td><td>100218</td><td></td></tr><tr><td>IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1)</td><td>BioLegend</td><td>506910</td><td></td></tr><tr><td>IL-17F APC (clone 9D3.1C8)</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>517004</tr><tr><td>CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5)</td><td>BD Biosciences</td><td>560181</td><td></td></tr><tr><td>CD8 APC (clone 53-67)</td><td>eBioscience</td><td>17-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>T-bet PE-Cy7 (clone 4B10)</td><td>BioLegend</td><td>644823</td><td></td></tr><tr><td>IFN&gamma; FITC (clone XMG1.2)</td><td>BD Biosciences</td><td>557724</td><td></td></tr></tbody></table>

intracelular coloração e citometria de fluxo para identificar linfócitos subconjuntos dentro murino aorta, rim e linfonodos em um modelo de hipertensão

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

Sabe-se hoje que os linfócitos T desempenham um papel crítico no desenvolvimento de várias doençascardiovasculares1,2,3,4,5. Por exemplo, estudos de nosso grupo mostraram que a hipertensão está associada a um acúmulo excessivo de células T nos vasos e rins durante o desenvolvimento da hipertensão experimental6. Uma vez nesses tecidos, as células T produzem várias citocinas que afetam a função vascular e renal, levando à vasoconstrição e retenção de sódio e água1,2. Para entender completamente como as células T causam doenças cardiovasculares e renais, é importante ser capaz de identificar e quantificar os subconjuntos específicos de células T presentes nesses tecidos. Os subconjuntos de células T são definidos por uma combinação de marcadores de superfície, as citocinas que secretam e os fatores de transcrição que expressam. A complexidade da população de células T torna a citometria de fluxo e a coloração intracelular uma técnica inestimável para dissecar os fenótipos dos linfócitos presentes nos tecidos. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para identificar os marcadores de superfície e intracelulares (citocinas e fatores de transcrição) em células T isoladas de rins murinos, aorta e linfonodos de drenagem aórtica em um modelo de hipertensão induzida por angiotensina II. As seguintes etapas são descritas em detalhes: isolamento dos tecidos, geração das suspensões unicelulares, estimulação ex vivo, fixação, permeabilização e coloração. Além disso, vários princípios fundamentais das análises de citometria de fluxo, incluindo a escolha dos controles adequados e estratégias de gating apropriadas, são discutidos.

O protocolo descrito permite a identificação de marcadores de superfície e intracelulares em células T isoladas a partir de rim de murino, da aorta e da aorta nódulos linfáticos de drenagem num modelo de hipertensão induzida por angiotensina II. Os resultados representativos são apresentados abaixo. A Figura 1 mostra a estratégia de propagação usados para identificar a população de células T numa única suspens...

Este artigo fornece metodologia detalhada para identificar e quantificar os subconjuntos de linfócitos T funcionais presentes dentro de rim murino, aorta e linfonodos por coloração intracelular e citometria de fluxo. O modelo de hipertensão induzida por angiotensina II foi escolhido para explicar, passo-a-passo, os procedimentos e os princípios fundamentais da citometria de fluxo e coloração intracelular.

Intracelular Coloração e Citometria de Fluxo para identificar linfócitos subconjuntos dentro Murino Aorta, rim e linfonodos em um modelo de hipertensão

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

O objetivo geral deste protocolo é obter suspensões de células isoladas da aorta murina, rim e linfonodos para quantificar e caracterizar células imunes em um modelo de hipertensão induzida por angiotensina II. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de doenças cardiovasculares, como quais dois subconjuntos de linfócitos promovem o desenvolvimento da hipertensão. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a identificação e quantificação de subconjuntos de células imunes em órgãos sólidos no nível de célula única.Antes de iniciar o procedimento, desinfete o tórax do camundongo com etanol 70%. Em seguida, use uma tesoura para abrir cuidadosamente a pele e a parede torácica, expondo o coração. Para perfundir a vasculatura, faça uma pequena incisão no átrio direito e injete, de forma constante, pelo menos 10 mililitros de PBS frio no ápice do ventrículo esquerdo, a uma taxa de aproximadamente um mililitro por segundo.Quando todos os órgãos estiverem esbranquiçados, utilize pinças finas de dissecação para remover os linfonodos linfáticos aórticos abdominais, tomando cuidado para não romper as cápsulas. Sob um microscópio estereoscópico, remova os dois rins com tesoura fina. Em seguida, use tesoura curva fina para dissecar toda a aorta torácica e abdominal, começando no coração e terminando na bifurcação ilíaca, tomando cuidado para manter a gordura perivascular ao redor aderida à aorta.Em seguida, transfira os rins para um tubo de dissociação contendo 10 mililitros de solução de digestão renal e use um dissociador semi-automático para desagregar mecanicamente o tecido renal de acordo com as instruções do fabricante. Ao final da dissociação, incube as amostras a 37 graus Celsius sob rotação contínua. Após 20 minutos, interrompa imediatamente a digestão enzimática com meio RPMI 1640 frio suplementado com 5% de FBS e filtre a suspensão tecidual resultante através de uma peneira de 40 micrômetros para um tubo cônico de 50 mililitros.Use o êmbolo de uma seringa de um mililitro para separar o tecido remanescente. Em seguida, pelote as células por centrifugação. Re-suspenda o pellet em três mililitros de meio de gradiente de densidade a 36% e transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros.Cubra suavemente as células com três mililitros de meio de gradiente de densidade a 72%, tomando cuidado para não perturbar as camadas, e separe as células por centrifugação. As células imunes estarão localizadas na interface. Remova a camada superior esverdeada que contém detritos celulares e, em seguida, complete o volume até 15 mililitros utilizando PBS frio.Agite bem para romper o gradiente e, em seguida, lave as células por centrifugação. Para isolar as células imunes da aorta, transfira a aorta para um tubo de dois mililitros contendo um mililitro de solução de digestão de aorta recém-preparada em gelo e use tesoura fina para picar toda a aorta em pedaços pequenos. Incube então os fragmentos a 37 graus Celsius por 30 minutos com rotação contínua.No final da digestão, adicione RPMI frio suplementado com 5% de FBS em um volume cinco vezes maior que o da solução de digestão e filtre a suspensão tecidual resultante através de uma peneira de 40 micrômetros. Em seguida, colete a suspensão de células únicas por centrifugação e reconstitua o pellet em RPMI fresco com FBS. Para obter uma suspensão de células únicas dos linfonodos drenantes da aorta, transfira os linfonodos para uma peneira de 40 micrômetros em uma placa de cultura de tecidos de 60 por 15 milímetros e utilize o êmbolo de uma seringa de um mililitro para desagregar o tecido.Em seguida, lave o filtro com dois mililitros de RPMI mais FBS e transfira as células liberadas para um tubo cônico de 15 mililitros. Para estimular as células, primeiro ajuste cada suspensão celular a uma concentração de um vezes 10 à sexta células por mililitro no meio de cultura celular. Em seguida, adicione dois microlitros do coquetel de ativação celular a cada grupo de células para cada um mililitro de meio.Em seguida, transfira uma a duas vezes 10 à sexta células aórticas ou renais por poço para uma placa de 12 poços e uma a duas vezes 10 à sexta células de linfonodo por poço para uma placa de 24 poços. Coloque as placas em um incubador de dióxido de carbono umidificado a 37 graus Celsius por três horas. Em seguida, transfira as células para os tubos de FACS de poliestireno apropriados e correspondentes e peloteie as células por centrifugação.Após lavar as células duas vezes com tampão FACS fresco nas mesmas condições de centrifugação, realize bloqueio para ligação superficial inespecífica com FC block e lave as células em PBS. Re-suspenda os pellets em um mililitro de PBS fresco e marque as células com um microlitro de corante de viabilidade reativo a aminas e impermeável à membrana celular durante 15 minutos a quatro graus Celsius, protegido da luz. Ao final da incubação, lave as células mais duas vezes em um a dois mililitros de tampão FACS e re-suspenda os pellets em 100 microlitros do coquetel apropriado de anticorpos para marcação da superfície celular.Após 30 minutos a quatro graus Celsius e protegido da luz, lave as células mais duas vezes em dois mililitros de tampão FACS fresco e fixe e permeabilize as células com um kit de fixação e permeabilização de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, marque as células com o coquetel de anticorpos intracelulares de interesse e lave novamente as células em tampão FACS. Para a análise citométrica de fluxo da produção intracelular estimulada de citocinas, execute primeiro os tubos controle não marcados e marcados com um único corante para ajustar a sobreposição espectral, seguidos pelos controles de fluorescência-menos-um para cada fluoróforo no painel.Depois de definidos os parâmetros básicos de análise de fluorescência, utilize um gráfico de área de dispersão para frente versus dispersão lateral para definir o primeiro gate para a detecção da população de leucócitos, seguido por um novo gate para excluir as células mortas com base na ausência de expressão do corante de viabilidade. Represente graficamente a área de dispersão para frente em função da altura da dispersão para frente e estabeleça um gate para excluir os dupletes. Os leucócitos podem então ser identificados pela sua expressão de CD45.Para determinar a presença de linfócitos T produtores de IL-17A ou IL-17F nos rins ou na aorta de camundongos, pode-se preparar suspensões celulares únicas, conforme demonstrado anteriormente para a análise de controle por fluorescência-menos-um de cada citocina. Como esperado, um número muito pequeno de células é positivo para IL-17A ou IL-17F nos controles de fluorescência-menos-um, permitindo a discriminação precisa de sinais positivos versus negativos para ajustar adequadamente os gates na identificação de células positivas para IL-17A ou IL-17F nas amostras experimentais. A coloração intracelular representativa de linfócitos T isolados dos rins e da aorta de camundongos selvagens infundidos com veículo ou angiotensina II revela a presença de um subconjunto de linfócitos T que expressam IL-17A ou IL-17F em ambos os tecidos.Além disso, a coloração intracelular de linfócitos T provenientes dos linfonodos drenantes da aorta demonstra que os linfócitos T positivos para CD8 expressam interferon gama e T-bet após estimulação com angiotensina II. Após dominar esta técnica, ela pode ser realizada em seis a nove horas, dependendo do número de tecidos processados. Durante a realização deste procedimento, é importante trabalhar com rapidez e eficiência para minimizar a morte celular.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar uma suspensão de células individuais a partir do rim, aorta e linfonodos de camundongos, bem como caracterizar e quantificar subpopulações de células imunes provenientes desses órgãos. Esta técnica permite que as fisiologias cardiovascular e renal explorem alterações nas populações de células imunes que podem contribuir para a hipertensão e outras doenças pró-inflamatórias.

intracellular-staining-flow-cytometry-to-identify-lymphocyte-subsets

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este trabalho apresenta um método de citometria de fluxo baseado em investigar a composição imune de aortas. O documento também ilustra uma técnica adicional que permite examinar adventícia circundante e parede do vaso separadamente. Esse método abre possibilidades para realizar análises fenotípica de leucócitos aórtica e aplicar vários ensaios imunológicos para estudos de aterosclerose.

Análise por Citometria de fluxo das células imunológicas Dentro aortas murino

Descrevemos procedimentos para quantificar e caracterizar lesões ateroscleróticas em modelos de camundongos usando secção de precisão do seio aórtico e da aorta ascendente combinada com análise histoquímica e imuno-histoquímica.

Análise quantitativa e caracterização das lesões ateroscleróticas no seio aórtico murino

A função das células vasculares depende da atividade dos mensageiros intracelulares.  Descrito aqui é um método de imagem ex vivo de dois fótons que permite a medição dos níveis intracelulares de cálcio e óxido nítrico em resposta a estímulos fisiológicos e farmacológicos em células endoteliais e musculares lisas individuais de uma aorta isolada.

Dois fótons de imagem de cálcio intracelular<sup&gt; 2+</sup&gt; Manuseio e produção de óxido nítrico no endotélio e músculo liso células de uma aorta de rato isolada

Os monócitos são importantes mediadores de arteriogenesis no contexto da doença arterial periférica. Usando uma membrana basal, como matriz e microscopia intravital, este protocolo investiga monócito homing e relacionados ao tumor angiogênese após injeção de monócitos no modelo murino de ligadura de artéria femoral.

Microscopia intravital de monócitos Homing e angiogênese relacionados ao Tumor em um modelo murino de Doença Arterial periférica

Este manuscrito descreve o uso de camundongos transgênicos repórter e vias de administração diferentes de corantes fluorescentes em angiotensina II induzida por hipertensão usando microscopia intravital de vídeo dos vasos sanguíneos para avaliar a ativação de células do sistema imunológico e suas capacidade de rolar e aderir ao endotélio.

Visualizando leucócitos rolamento e adesão em angiotensina II-infundido ratos: técnicas e armadilhas

O objetivo do presente protocolo é identificar populações de células endoteliais linfáticas dentro do fígado usando marcadores descritos. Nós utilizamos colagenase IV e DNase e um suave de picagem de tecido, combinado com citometria de fluxo, para identificar uma população distinta de células endoteliais linfáticas.

Digestão do fígado murino para um fluxo Cytometric análise de células endoteliais linfáticas

Propomos um protocolo padronizado para caracterizar a composição celular do tarde-estágio lesões ateroscleróticas murino, incluindo métodos sistemáticos de dissecação animal, incorporação de tecido, corte, coloração e análise das artérias Braquiocefálica de ratos de rastreamento do linhagem de células de músculo liso atheroprone.

Análise quantitativa da composição celular em lesões ateroscleróticas avançadas de ratos de rastreamento de linhagem celular músculo liso

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado e reprodutível de citometria de fluxo para identificar subconjuntos de monócito/macrófago e células T usando ensaios de coloração extra e intracelular dentro do baço de murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial, utilizando um modelo cirúrgico estabelecido de osteoartrite de murina.

Análise de Citometria de Fluxo de Subconjuntos de Células Imunes dentro do Baço de Murina, Medula Óssea, Linfonodos e Tecido Sinovial em um Modelo de Osteoartrite

Após a infecção viral, o rim abriga um número relativamente grande de células CD8+ T e oferece uma oportunidade de estudar células TRM não mucosas. Aqui, descrevemos um protocolo para isolar linfócitos renais de camundongos para análise de citometria de fluxo.

Isolamento das células CD8+ T residentes em rim do rato para análise de citometria de fluxo

O recrutamento de leucócitos e plaquetas constitui um componente essencial necessário para o crescimento efetivo das artérias colaterais durante a arteriogênese. A microscopia multifóton é uma ferramenta eficiente para rastrear a dinâmica celular com alta resolução espaço-temporal in vivo e menor fototoxicidade para estudar o recrutamento e extravasamento de leucócitos durante a arteriogênese.

Imagem Intravital Multifóton para Monitoramento do Recrutamento de Leucócitos durante a Arteriogênese em Modelo de Membro Posterior Murino

Aqui, apresentamos protocolos otimizados de limpeza de tecido para obter imagens da aorta murina em três dimensões (3D). Delineamos procedimentos de última geração para imunocoloração, limpeza óptica e imagem com a intenção de definir a proximidade anatômica do sistema nervoso periférico com placas ateroscleróticas e a adventícia na aterosclerose.

Imagem tridimensional de tecidos aórticos na aterosclerose

Aprenda a identificar subconjuntos de linfócitos T em aorta, rim e linfonodos murinos usando coloração intracelular e citometria de fluxo. Este método permite quantificar células imunes em modelos de hipertensão induzida por angiotensina II.

Intracelular Coloração e Citometria de Fluxo para identificar linfócitos subconjuntos dentro Murino Aorta, rim e linfonodos em um modelo de hipertensão (Vídeo) | JoVE Journal

Intracelular Coloração e Citometria de Fluxo para identificar linfócitos subconjuntos dentro Murino Aorta, rim e linfonodos em um modelo de hipertensão

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