Intracelular Coloração e Citometria de Fluxo para identificar linfócitos subconjuntos dentro Murino Aorta, rim e linfonodos em um modelo de hipertensão

O objetivo geral deste protocolo é obter suspensões unicelulares da aorta murina, rim e linfonodos para quantificar e caracterizar células imunes em um modelo de hipertensão induzida por angiotensina II. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da doença cardiovascular, como quais dois subconjuntos de linfócitos promovem o desenvolvimento da hipertensão. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a identificação e quantificação de subconjuntos de células imunes em órgãos sólidos no nível de uma única célula.

Antes de iniciar o procedimento, desinfete o peito do camundongo com etanol 70%. Em seguida, use uma tesoura para abrir cuidadosamente a pele e a parede torácica para expor o coração. Para perfundir a vasculatura, faça uma pequena incisão no átrio direito e injete firmemente pelo menos 10 mililitros de PBS frio a uma taxa de aproximadamente um mililitro por segundo no ápice do ventrículo esquerdo.

Quando todos os órgãos estiverem empalidecidos, use uma pinça de dissecação fina para remover os linfonodos de drenagem da aorta abdominal, tomando cuidado para não romper as cápsulas. Sob um microscópio de dissecação, remova os dois rins com uma tesoura fina. Em seguida, use uma tesoura curva fina para dissecar toda a aorta torácica e abdominal, começando no coração e terminando na bifurcação ilíaca, tomando cuidado para manter a gordura perivascular circundante presa à aorta.

Em seguida, transfira os rins para um tubo de dissociação contendo 10 mililitros de solução de digestão renal e use um dissociador semiautomático para desagregar mecanicamente o tecido renal de acordo com as instruções do fabricante. No final da dissociação, incubar as amostras a 37 graus Celsius sob rotação contínua. Após 20 minutos, interrompa imediatamente a digestão enzimática com meio RPMI 1640 frio suplementado com 5% de FBS e filtre a pasta de tecido resultante através de um filtro de 40 mícrons em um tubo cônico de 50 mililitros.

Use o êmbolo de uma seringa de um mililitro para separar o tecido restante. Em seguida, pellet as células por centrifugação. Ressuspenda o pellet em três mililitros de meio gradiente de densidade de 36% e transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros.

Coloque suavemente três mililitros de meio gradiente de densidade de 72% sob as células, tomando cuidado para não perturbar as camadas, e separe as células por centrifugação. As células imunes estarão localizadas na interface. Remova a camada amarelada superior contendo detritos celulares e, em seguida, aumente o volume para 15 mililitros usando PBS frio.

Agite bem para quebrar o gradiente e, em seguida, lave as células por centrifugação. Para isolar as células imunes da aorta, transfira a aorta para um tubo de dois mililitros contendo um mililitro de solução de digestão da aorta recém-preparada no gelo e use uma tesoura fina para picar toda a aorta em pedaços finos. Em seguida, incube os fragmentos a 37 graus Celsius por 30 minutos de rotação contínua.

No final da digestão, adicione RPMI frio suplementado com 5% de FBS em cinco vezes o volume da solução de digestão e filtre a pasta de tecido resultante através de um filtro de 40 mícrons. Em seguida, colete a suspensão de célula única por centrifugação e ressuspenda o pellet em RPMI fresco com FBS. Para gerar uma suspensão unicelular a partir dos linfonodos de drenagem aórtica, transfira os gânglios linfáticos para um filtro de 40 mícrons em uma placa de cultura de tecidos de 60 por 15 milímetros e use um êmbolo de seringa de um mililitro para desagregar o tecido.

Em seguida, lave o filtro com dois mililitros de RPMI mais FBS e transfira as células liberadas para um tubo cônico de 15 mililitros. Para estimular as células, primeiro ajuste cada suspensão celular para uma concentração de uma vez 10 elevado à sexta células por mililitro no meio de cultura celular. Em seguida, adicione dois microlitros do coquetel de ativação celular a cada grupo de células para cada mililitro de meio.

Em seguida, transfira uma a duas vezes 10 para o sexto poço de células aórticas ou renais para uma placa de 12 poços e uma a duas vezes 10 para o sexto linfonodo por poço para uma placa de 24 poços. Coloque as placas em uma incubadora de dióxido de carbono umidificado a 37 graus Celsius por três horas. Em seguida, transfira as células para os tubos FACS de poliestireno correspondentes apropriados e peletize as células por centrifugação.

Depois de lavar as células duas vezes com tampão FACS fresco sob as mesmas condições de centrífuga, bloqueie e a ligação de superfície não específica com o bloco FC e lave as células em PBS. Ressuspenda os grânulos em um mililitro de PBS fresco e core as células com um microlitro de uma coloração de viabilidade reativa amina-impermeável às células por 15 minutos a quatro graus Celsius, protegida da luz. No final da incubação, lave as células mais duas vezes em um a dois mililitros de tampão FACS e ressuspenda os pellets em 100 microlitros do coquetel de anticorpos de coloração da superfície celular apropriado.

Após 30 minutos a quatro graus Celsius e protegidas da luz, lave as células mais duas vezes em dois mililitros de tampão FACS fresco e fixe e permeabilize as células com um kit de fixação e permeabilização de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, rotule as células com o coquetel de anticorpos intracelulares de interesse e lave as células no tampão FACS novamente. Para análise de citometria de fluxo da produção de citocinas intracelulares estimuladas, primeiro execute os tubos de controle não corados e corados com uma única coloração para ajustar a sobreposição espectral, seguidos pelos controles de fluorescência menos um para cada fluoróforo no painel.

Quando os parâmetros básicos de análise de fluorescência tiverem sido definidos, use um gráfico de área de dispersão frente a lado para definir a porta primária para a detecção da população de leucócitos, seguido de gating para excluir as células mortas de acordo com sua falta de expressão de mancha de viabilidade. Plote a área de dispersão direta em relação à altura e porta de dispersão direta para excluir os dublês. Os leucócitos podem então ser identificados por sua expressão de CD45.

Para determinar a presença de células T produtoras de IL-17A ou IL-17F com o rim ou aorta murina, suspensões de células únicas podem ser preparadas como demonstrado para análise de controle de fluorescência menos um de cada citocina. Como esperado, muito poucas células são positivas para IL-17A ou IL-17F nos controles de fluorescência menos um, permitindo a discriminação precisa de sinais positivos versus negativos para ajustar adequadamente as portas para a identificação de células positivas para IL-17A ou IL-17F nas amostras experimentais. A coloração intracelular representativa de células T isoladas do rim e da aorta de camundongos do tipo selvagem infundidos com veículo ou angiotensina II revela a presença de um subconjunto de células T que expressam IL-17A ou IL-17F em ambos os tecidos.

Além disso, a coloração intracelular de células T dos linfonodos de drenagem aórtica demonstra que as células T CD8 positivas expressam interferon gama e T-bet após a estimulação da angiotensina II. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em seis a nove horas, dependendo do número de tecidos que estão sendo processados. Ao realizar este procedimento, é importante trabalhar de forma rápida e eficiente para minimizar a morte celular.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar suspensão unicelular a partir do rim murino, aorta e linfonodos e caracterizar e quantificar subconjuntos de células imunes desses órgãos. Essa técnica permite que fisiologias cardiovasculares e renais explorem as mudanças nas populações de células imunes que podem contribuir para a hipertensão e outras doenças pró-inflamatórias.