Name: Genoma Edição e Directed Diferenciação de hPSCs para interrogar Determinantes Lineage no desenvolvimento pancreático humano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprenda a editar genomas de hPSCs usando a plataforma iCRISPR e diferenciá-las em células pancreáticas. Este método permite estudar os determinantes de linhagem no desenvolvimento pancreático humano e investigar as bases genéticas do diabetes.

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Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH / NIDDK (R01DK096239) e New York State Stem Cell Science (NYSTEM C029156). ZZ foi apoiado pelo pós-bolsa NYSTEM do Centro de Biologia de Células-Tronco do Kettering Institute Sloan.

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Os autores não têm nada a revelar.

Considerações de tempo para gerar mutantes Lines Embora as abordagens recentes baseados em sistemas / Cas CRISPR para edição genoma levaram a segmentação bem sucedida, uma plataforma mais eficaz e universal seria preferível em maior escala análises da função do gene. A plataforma iCRISPR oferece um método rápido e eficiente para introduzir mutações a qualquer gene de interesse 5, 9. Em primeiro lugar, o método de síntese gRNA com base em PCR permite a produção de centenas de gRNAs em formato dispostos em um dia sem os passos de clonagem que consomem tempo. Em segundo lugar, com expressão indutível Cas9 doxiciclina em iCas9 hPSCs, o passo que envolve a transfecção gRNA requer apenas uma quantidade mínima de trabalho, e assim, as experiências de segmentação múltipla gRNA podem ser realizadas simultaneamente. Em terceiro lugar, devido à alta eficiência de segmentação atingíveis com o nosso sistema, a análise de ~ 24 - 48 colónias por gRNA transfectadas devem ser suficient para estabelecer múltiplos monoalélicos e linhas mutantes bialélicos para um único gene, embora as eficiências variam dependendo do locus alvo. Uma vez que é possível que um indivíduo treinado para apanhar mecanicamente 384 colónias (placas de 4 x 96 poços) de uma só vez, o que deve levar ~ 4 h, sob um microscópio de dissecação, um indivíduo treinado pode ser esperado para gerar linhas mutantes que afectam a 12 genes dentro 1 - 2 meses. A geração de mutantes simplificada HPSC num curto espaço de tempo permite a análise sistemática de uma série de factores de transcrição e / ou componentes da via de sinalização, que interagem uns com os outros, regulando o processo de desenvolvimento 9. Além disso, eficiente segmentação gene multiplexada também abre a porta para investigar interacções genéticas subjacentes características humanas complexas. Geração de modificações genéticas precisas A derivação de iPSCs específicas no doente, desde tipo de célula somática facilmente acessível<html> s e a diferenciação em tipos de células doença relevantes fornecem uma grande oportunidade para a validação funcional de mutações associadas à doença. No entanto, devido à variabilidade considerável no fundo genética entre os indivíduos, as comparações directas entre iPSCs de doentes e de dadores saudáveis ​​podem não permitem distinguir fenótipos da doença a partir de efeitos de fundo. Portanto, é necessário gerar iPSCs isogénicas controlo corrigindo a mutação da doença de volta para a sequência do tipo selvagem ou para introduzir as mutações específicas de pacientes em um fundo HPSC de tipo selvagem, tal como proposto por outros 25, 26. Além disso a (null) mutações de perda de função, pode-se agora dissecar mais precisamente os mecanismos da doença por meio da introdução de uma alteração de sequência específicos do paciente no locus endógeno em hPSCs, incluindo paciente hipermórficos, hipomórfico, neomorphic, ou dominante negativo mutações. ntent &quot;&gt; modificação genética precisa emprega HDR para reparação de DSB, na presença de um modelo de reparação. Uma vez que é muito menos eficiente do que a reparação de NHEJ de ADN mediada por, um plasmídeo dador contendo a mutação específica para cada paciente, uma cassete de selecção de droga, e os braços de homologia tenha sido previamente utilizado como o modelo de reparação 2. Após a selecção de drogas e de verificação da mutação específica para cada paciente, um segundo passo é geralmente necessária para remover a cassete de selecção de droga. Embora os sistemas Cre-loxP e FLP-FRT mais amplamente usados deixar para trás sequência residual no locus endógeno, o uso de piggyBac transposão tem permitido a remoção contínua da cassete de selecção de droga 27. Mais recentemente, os modelos de ADNcs curtas também foram exibidas para suportar HDR eficiente com as endonucleases de ADN modificadas 28. Comparado com um plasmídeo dador , ADNcs podem ser directamente sintetizados e, portanto, evita o passo de clonagem demorado. Aqui, tem serPT mostraram que, por co-transfecção de gRNA e um molde de ADNcs para induzir a reparação dirigida por homologia, iCRISPR pode ser utilizada para introduzir modificações de nucleótidos específicos com elevada eficiência. Isto é crítico, não só para dissecar o papel dos nucleótidos essenciais dentro de domínios funcionais de proteínas, mas também para a modelagem de mutações de doenças humanas e potencialmente corrigir estas mutações associadas à doença para a intervenção terapêutica. Devido ao grande número de loci de susceptibilidade que estão cada um associado com várias variantes de sequência, modelar doenças complexas e multigénicos tais como diabetes tem sido um desafio para os geneticistas. À medida que a plataforma iCRISPR é permissiva para a rápida geração de uma série de alelos ou para direccionamento do gene multiplexable, que pode facilitar a investigação de múltiplos loci associados à doença, quer individualmente ou em combinação com fundos isogénicas. Segmentação Eficiências e efeitos fora do alvo Nós temos<html> encontrado uma boa correlação entre a T7E1 e os resultados do ensaio de RFLP e o número de linhas mutantes identificados por sequenciação. Isso enfatiza a importância da realização destes ensaios em paralelo com o estabelecimento de linhas clonais. Embora as eficiências de segmentação obtidos podem variar de acordo com os loci genómico, na maior parte das experiências individuais de direccionamento de gene, a 20 - 60% dos clones foram encontrados com ambos os alelos mutados (incluindo em grelha e mutações frameshift) 9. Nos casos em que a segmentação gene multiplexado foi realizada, clones mutantes bialélicos triplos com 5-10% de eficiência foram obtidos 5. ADNcs mediada por HDR de vários genes foram também realizados para obter alterações genéticas precisas, com as eficiências de obtenção homozigótica knock-in clones variando de 1 - 10% 5. Trabalhando com CRISPR / Cas em hPSCs, quaisquer mutações em potenciais locais fora do alvo que não compartilham a mesma sequência alvo gRNA estão ainda a ser detectadolass = &quot;xref&quot;&gt; 5, 9, 12. Sequenciamento de genoma completo realizado em um estudo recente também não conseguiu identificar mutações off-alvo substanciais em linhas HPSC clonais gerado usando CRISPR / Cas 29. No entanto, para minimizar qualquer efeito potencial de confundir os fenótipos introduzidos por mutações em locais de efeitos fora do alvo, sugere-se para gerar linhas mutantes independentes utilizando, pelo menos, duas sequências de direccionamento gRNAs independentes diferentes dentro do mesmo gene. fenótipos semelhantes observadas em várias linhas gerada utilizando diferentes gRNAs poderia descartar principalmente a possibilidade de que o fenótipo trata de um efeito fora do alvo. -Feeder dependente versus cultura independente e Segmentação Os métodos tradicionais de cultura HPSC envolvem a sua manutenção e expansão de células de alimentação em meios contendo soro ou substituição de soro que inclui prod animaistos, tais como albumina de soro bovino. células alimentadoras, soro, de substituição de soro, e albumina todos contêm componentes complexos, indefinidos e mostrar considerável variabilidade lote. Adaptar-se a condição de livre de alimentação e química definida reduz significativamente os esforços para a manutenção HPSC e, mais importante, aumenta a consistência dos experimentos de diferenciação. Actualmente, existem muito poucos estudos que descrevem procedimentos de edição de genoma sobre hPSCs cultivadas em condições de cultura totalmente definidos 30. Encontramos maior CRISPR visando eficiência quando gRNA transfecção e deposição clonal foram realizadas em condições livres de alimentação em comparação com condições de cultura dependentes de alimentação. Acreditamos que este é devido ao aumento da sobrevivência das células após a transfecção e propagação de uma única célula para formação de colónias. Além disso, as células alimentadoras foram anteriormente mostrado para sequestrar os reagentes de transfecção, diminuindo assim a eficiência da transfecção. combinandoEdição genoma com Directed Diferenciação Protocolos de diferenciação anteriores produziram apenas uma pequena fracção das células de insulina positivas, a maioria das quais eram polyhormonal e assemelhava-se células fetais endócrinas 23. O progresso recente tem permitido a diferenciação de hPSCs em células mais maduras de glicose-responsive beta-like 16, 17, 19, 20. Podemos rotineiramente obter pelo menos 75% de células da endoderme definitivo, 40% células beta como glicose-responsive Pdx1 + NKX6.1 + progenitoras pancreáticas, e cerca de 20% NKX6.1 + CPEP + usando HUES8 hPSCs 9. Quando combinado com o sistema de edição genoma iCRISPR, este protocolo de diferenciação mais robusto tem facilitado a análise de fatores de transcrição que são cruciais para as pancreáticas progenitoras e endócrinos estágios de diferenciação do pâncreas. Isso fará com queSerá possível, em estudos futuros, para examinar um grande número de genes de doenças candidato para a validação funcional e investigação sobre os mecanismos que estão por trás diabetes 9. Aplicações futuras ou Directions Nosso sistema iCRISPR pode facilitar a geração de modificações genômicas mais complexas, tais como a criação de alelos repórter através do gene alvo usando modelos de DNA longo doadores marcas que codifica a proteína ou repórteres fluorescentes 12 HDR-mediada. Mostrámos que, devido à alta eficiência de segmentação CRISPR obtidos no sistema, este processo pode ser realizado em hPSCs, sem a necessidade de seleccionar mais de um fármaco 12. Além disso, o gene multiplexado segmentação pode ser usado para investigar interacções genéticas doença humana complexa subjacente, como mostrado em nosso estudo recente, o que acreditamos ser o primeiro exemplo desse trabalho 31. iCRISPR também pode ser utilizada para compreender o controlo regulador do gene através da criação de deleções em qualquer ARN não codificadoras ou em regiões reguladoras do gene, tais como promotores e intensificadores. Para gerar mutantes reguladoras eficientemente usando iCRISPR, gRNAs pode ser concebido para interromper o local de ligação de uma proteína de ligação de ADN, incluindo, mas não se restringindo à maquinaria de transcrição basal, ou um factor de transcrição específico de tecido. ADNcs HDR mediada por molde pode também ser utilizada para mutar locais específicos de ligação a proteínas. Finalmente, prevemos que uma maior optimização possa permitir a utilização da plataforma iCRISPR em hPSCs superiores para as análises genéticas de rendimento de fenótipos pluripotência ou fenótipos da doença quando combinado com um protocolo de diferenciação in vitro, em. Estes estudos mediada por iCRISPR pode permitir a identificação mais rápida de genes candidatos e os estudos da sua relevância funcional associada à doença.

As células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs) têm a capacidade de se auto-renovar ambos e dão origem a todos os derivados das três linhagens germinais embriónicas. Eles fornecem um recurso valioso para a terapia de substituição celular e modelagem de doença, servindo como uma plataforma única para recapitular processos celulares em um contexto de desenvolvimento humano. Eles são também uma fonte de células experimentais para análises escaláveis, de alto rendimento. No entanto, o progresso tem sido limitado devido a dois desafios principais: a falta de ferramentas de modificação genética eficientes e a dificuldade em recapitulando as etapas de desenvolvimento embrionário complexos em um prato de cultura. A modificação genética é uma ferramenta indispensável para estudar a função do gene em desenvolvimento normal e doença. No entanto, enquanto gene clássica visando abordagens através de recombinação homóloga tem provado ser uma ferramenta poderosa para dissecar a função do gene de rato em células estaminais embrionárias (mESCs) 1, esta abordagemtem sido extremamente ineficiente quando aplicada para hPSCs 2, 3. A recente adesão rápida de nucleases programáveis, específicas do local da natureza para uso em laboratório, incluindo nucleases de dedo de zinco (ZFNs), transcrição ativador-like nucleases efetoras (TALENS), e os aglomerados regularmente intercaladas repete palindrï¿½icas curtas (CRISPR) / CRISPR-associados (CAS) sistemas 4, significa que a engenharia genoma tornou-se uma tarefa muito mais fácil, em uma grande variedade de microrganismos e linhas de células, incluindo em hPSCs. Estas ferramentas de edição gene de tirar vantagem do facto de que as nucleases quiméricos, tais como a endonuclease Cas9 pode permitir que uma ampla gama de modificações genéticas através da indução de quebras de cadeia dupla (DSB) em locais precisos, provocando a endógeno máquinas de reparação do ADN para activar quer não homóloga acabar juntar (NHEJ) ou reparação dirigida por homologia (HDR). Ambos os mecanismos podem ser explorados para a manipulação genética através da indução de either inserção aleatória e mutações de deleção (indels; via NHEJ), para criar mutações frameshift que anulam alelos do gene, ou substituições de nucleotídeos precisos (via HDR), a recapitular mutações do paciente para modelar doenças humanas ou para corrigir uma mutação causadora da doença para a terapia genética . CRISPR / engenharia genoma CAS-mediada requer dois componentes: a constante de endonuclease de Cas9 guiada por ARN necessárias para a clivagem de ADN e ARN de um CRISPR variável (crRNA) e duplex de trans-activação (tracrRNA) que especifica o reconhecimento alvo de ADN. O duplex crRNA / tracrRNA pode ser substituído com um único ARN quimérico guia (gRNA), que foram encontrados para trabalhar mais eficientemente 5, 6, 7. Embora o sistema de / Cas9 CRISPR foi adaptada para os organismos mais experimentais e linhas celulares, o fornecimento e expressão de Cas9 e gRNA varia de forma significativa e deve ser optimizadas para Achieve edição genoma eficiente em muitos sistemas, incluindo hPSCs 8. Uma plataforma de edição de genoma eficiente, iCRISPR, foi criada em hPSCs 5. Neste sistema, uma abordagem TALEN mediada tem sido utilizado para segmentar os dois alelos do AAVS1 &quot;transgene de locus de porto seguro&quot; em trans, um alelo com um transactivador reverso controlado por tetraciclina (M2rtTA) e o outro com um elemento de resposta a tetraciclina (TRE ) que conduz a expressão de Cas9 (iCas9) nas hPSCs. Em linhas clonais estabelecidos (iCas9 hPSCs), Cas9 é altamente expressa com o tratamento doxiciclina. Entretanto, devido ao seu tamanho pequeno (100 nt), gRNAs únicas ou múltiplas podem ser facilmente entregue em iCas9 hPSCs com alta eficiência e pode dirigir Cas9 para a clivagem específica do local, permitindo eficiente disrupção do gene NHEJ-mediada, bem como HDR mediada modificações precisas de nucleótidos na presença de modelos de doadores curtas de ADN de cadeia simples (ADNcs). O sistema pode ser iCRISPRutilizada com sucesso para gerar um painel de linhas HPSC-simulando doença com bialélico (homozigota ou heterozigota composto) ou mutações heterozigóticas de perda de função em importantes genes de desenvolvimento 5, 9. Enquanto um número de grupos relataram edição gene eficiente usando CRISPR / Cas em hPSCs, o sucesso continua a ser limitada a um pequeno número de laboratórios adeptos da tecnologia. A plataforma iCRISPR oferece uma solução eficiente, mas simples para edição gene rotina por pesquisadores de diferentes níveis de habilidade, e já tem sido utilizado em uma série de estudos publicados por nosso grupo e outros 9, 10, 11, 12. Esta abordagem tem também sido alargado para silenciamento indutível com base na expressão de dCas9-KRAB 13. Junto com o progresso de edição de genoma technologia, melhorias significativas também foram alcançados na manutenção HPSC e diferenciação dirigida. Condições de cultura para hPSCs evoluíram a partir de condições do meio do mouse irradiado fibroblastos embrionárias (IMEF) às condições de livre-feeder sobre componentes da matriz extracelular definidos, e de formulações de meios complexos dependentes de alimentador química definida 14. Tais melhorias reduziram a variabilidade na hPSCs devido a diferenças de lote para lote em componentes de substituição de preparação e soro knockout IMEF, e, assim, proporcionar um ambiente mais reproduzível para a diferenciação HPSC. Enquanto isso, um melhor conhecimento das vias de sinalização que regulam o desenvolvimento embrionário humano, bem como as descobertas de exames de drogas de alto rendimento, levaram ao aperfeiçoamento de protocolos de diferenciação 15, 16, 17, 18. Estes protocolos mais de perto imitar em vivo etapas de desenvolvimento e gerar tipos de células que recapitulam de perto os seus homólogos em vivo. Para a diferenciação HPSC na linhagem de pâncreas, protocolos iniciais imitou o desenvolvimento pancreático precoce relativamente bem, mas eventualmente gerado células p polyhormonal que eram de fenótipos fetais imaturos e responderam mal ao estímulo da glicose. Os avanços recentes 16, 17, 19, 20, têm permitido a geração de células beta-pancreáticas como glucose-responsivo, que nos permitirão investigar acontecimentos posteriores, como a formação e ainda a maturação de células beta monohormonal. Aqui, nós pormenor a aplicação de linhas modificada do genoma para o estudo do desenvolvimento pancreático combinando o sistema iCRISPR com a diferenciação in vitro plataforma baseada em direcção HPSC pancr glucose-responsivocélulas beta-like eatic. Este acoplamento de poderosas ferramentas de edição genoma com uma melhor protocolo de diferenciação HPSC não só oferece a velocidade ea escala necessária para atender à crescente demanda por validar a causalidade da doença, mas também permite manipulações genéticas sofisticadas para novas investigações mecanicistas para controlo da transcrição subjacentes ao desenvolvimento normal e de doenças 9 .

<table><tbody><tr><td>Meio quimicamente definido (E8)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>Essential 8 meio basal e suplemento Essential 8 incluídos</td></tr><tr><td>Forma humana recombinante truncada de vitronectina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de ROCK Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de dissociação (enzima TrypLE Select)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563029</td><td>1x, livre de origem animal, enzima recombinante</td></tr><tr><td>G418 Sulfato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10131035</td><td>Geneticin Antibiótico Seletivo</td></tr><tr><td>Dicloridrato de Puromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>Antibiótico Seletivo Puromicina</td></tr><tr><td>DNA Polimerase (Herculase II Fusion)</td><td>Agilent Technologies</td><td>Kit de</td><td>PCR</td></tr><tr><td>600679 MEGAshortscript T7 Transcrição kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Kit de Limpeza de Transcrição</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>Hidrato de doxiciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM médio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Soro Reduzido</td></tr><tr><td>Lipofectamina RNAiMAX Reagente de Transfecção</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>13778150</tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit de lenços</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td>Kit de extração de DNA genômico</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 meio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>Meio BLAR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Feito sob medida com uma formulação publicada (Rezania et al., 2014)</td></tr><tr><td>Suplemento de L-glutamina (GlutaMAX)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>LAMPIRE Biological Laboratories</td><td>7500855</td><td>Livre de ácidos graxos</td></tr><tr><td>GDF8</td><td>PeproTech</td><td>120-00</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>Inibidor de GSK-3</td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>Vitamina C</td></tr><tr><td>FGF7</td><td>R & D Systems</td><td>251-KG</td><td></td></tr><tr><td>SANT1</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1974</td><td>Inibidor de ouriço</td></tr><tr><td>RA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td>Ácido retinóico</td></tr><tr><td>LDN</td><td>Stemgent</td><td>04-0019</td><td>Inibidor de BMP</td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3533</td><td>Antagonista Wnt&nbsp;</td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>TPB</td><td>EMD Millipore</td><td>565740-1MG</td><td>Ativador PKC</td></tr><tr><td>3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>ALK5i II</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-270-445</td><td>ALK5 inibidor II</td></tr><tr><td>ZnSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0251</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>GSiXX</td><td>EMD Millipore</td><td>565789</td><td>Inibidor da gama secretase XX, inibidor de sinalização NOTCH</td></tr><tr><td>N-Cys (N-acetilcisteína)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>EMD Millipore</td><td>648471</td><td>Vitamina E análogo</td></tr><tr><td>R428</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2841</td><td>AXL receptor tirosina quinase inibidor</td></tr><tr><td>24 mm Transwell com inserto</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3414</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Sistema de Eletroporação</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>0,4 cm Cuvetes de Eletroporação</td><td>Bio-Rad</td><td>1652081</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-TALEN-L</td><td>Addgene</td><td>59025</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-TALEN-R</td><td>Addgene</td><td>59026</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-Neo-M2rtTA</td><td>Addgene</td><td>60843</td><td></td></tr><tr><td>AAVS1-Puro-iCas9</td><td>Addgene</td><td>58409</td><td></td></tr><tr><td>T7 Endonuclease I</td><td>NEB</td><td>M0302L</td><td></td></tr><tr><td>Tampão 2</td><td>NEB</td><td>B7002S</td><td>NEBuffer 2</td></tr><tr><td>Oligonucleotídeo longo</td><td>Eton Bioscience ou anticorpo IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOX17</td><td>R& D Systems</td><td>AF1924</td><td>1:500</td></tr><tr><td>FOXA2 anticorpo</td><td>Millipore</td><td>07-633</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CXCR4-APC anticorpo</td><td>R& D Systems</td><td>FAB170A</td><td>1:25</td></tr><tr><td>PDX1 anticorpo</td><td>R& D Systems</td><td>AF2419</td><td>1:500</td></tr><tr><td>NKX6.1 anticorpo</td><td>DSHB</td><td>F55A12</td><td>1:500</td></tr><tr><td>NKX2.2 anticorpo</td><td>DSHB</td><td>74.5A5</td><td>1:100</td></tr><tr><td>NEUROD1</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-1084</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo de insulina</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>1:2.000</td></tr><tr><td>anticorpo peptídico C</td><td>DSHB</td><td>GN-ID4-c</td><td>1:2.000</td></tr><tr><td>Anticorpo glucagon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2654</td><td>1:1.000</td></tr></tbody></table>

genoma edição e directed diferenciação de hpscs para interrogar determinantes lineage no desenvolvimento pancreático humano

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Interrogando a função do gene em auto-renovação ou diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) oferece uma plataforma valiosa para a compreensão do desenvolvimento humano e dissecar os mecanismos da doença em um prato. Para capitalizar sobre esta aplicação potencial requer ferramentas de edição de genoma eficientes para gerar mutantes HPSC em genes associados à doença, bem como in vitro protocolos de diferenciação HPSC para produzir tipos de células doenças relevantes que recapitulam de perto os seus homólogos em vivo. Uma plataforma de edição de genoma eficiente para hPSCs chamado iCRISPR foi desenvolvido através da segmentação TALEN mediada de uma cassete de expressão Cas9 no locus AAVS1. Aqui, são descritos os protocolos para a geração de linhas Cas9 HPSC indutíveis utilizando células cultivadas num meio quimicamente definido e livre de uma condição de alimentação. Os procedimentos detalhados para utilizar o sistema iCRISPR para knockout gene ou alterações genéticas precisas em hPSCs, seja através de nem homóloga extremidade de união (NHEJ) ou através de alterações de nucleótidos precisos utilizando um modelo de reparação dirigida por homologia (HDR), respectivamente, estão incluídas. Estes procedimentos técnicos incluem descrições de concepção, produção e transfecção de RNAs guia CRISPR (gRNAs); a medição da taxa de mutação por meio de ensaios CRISPR ou T7E1 RFLP; ea criação e validação de linhas mutantes clonais. Finalmente, procedimentos crônica de diferenciação HPSC em células beta-pancreáticas como glicose-responsive imitando no desenvolvimento embrionário de pâncreas vivo. Combinando tecnologia iCRISPR com a diferenciação HPSC dirigido permite que o exame sistemático da função do gene para promover nossa compreensão dos mecanismos de desenvolvimento e doença diabetes pancreáticas.

Protocolos para gerar linhagens mutantes HPSC usando a plataforma iCRISPR e diferenciar hPSCs em células ß-like glicose-responsivos são descritos. Combinando tecnologia de edição de genoma com a diferenciação HPSC-dirigida fornece uma plataforma poderosa para a análise sistemática do papel das determinantes da linhagem no desenvolvimento humano e progressão da doença.

Genoma Edição e Directed Diferenciação de hPSCs para interrogar Determinantes Lineage no desenvolvimento pancreático humano

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Este protocolo demonstra como estabelecer a plataforma iCRISPR para edição gênica rápida em hPSCs e como incorporar linhagens com edição genômica à diferenciação pancreática direcionada de hPSCs para estudar o desenvolvimento e as doenças pancreáticas humanas. Esses métodos podem ajudar a responder perguntas fundamentais na área do desenvolvimento pancreático humano, como o controle genético do desenvolvimento pancreático normal e a base molecular do diabetes. A principal vantagem dessas técnicas é que elas nos permitem modificar com eficiência genes de interesse em hPSCs e utilizar essas linhagens celulares modificadas para estudos do desenvolvimento e das doenças pancreáticas humanas in vitro.Cultive hPSCs em condições quimicamente definidas e livres de camada de alimentação em placas revestidas com vitronectina humana truncada. No dia anterior à eletroporação, adicione inibidor de ROCK a 10 micromolar durante a troca de meio. No dia da eletroporação, prepare com antecedência placas de 10 centímetros revestidas com vitronectina.Em seguida, remova o meio de cultura das células, lave uma vez com PBS sem cálcio e magnésio e, então, trate as células com o reagente de dissociação 1X a 37 graus Celsius por aproximadamente três minutos. A seguir, aspire o reagente de dissociação antes que as células se desprendam e adicione 10,5 mililitros de meio completo. Utilize pipetagem suave para formar uma suspensão de células simples antes de transferir para tubos de centrífuga.Realize uma contagem celular em 500 microlitros de suspensão celular utilizando um contador celular automatizado. Em seguida, centrifugue as hPSCs a 200 × g durante cinco minutos. Re-suspenda as células em PBS frio a 12,5 × 10⁶ células por mililitro e alíquota em volumes de 800 microlitros.Adicione os plasmídeos em cada suspensão de hPSC de 800 microlitros e misture bem. Transfira a mistura para uma cubeta de eletroporação de 0,4 centímetro e mantenha em gelo por aproximadamente cinco minutos. Eletropore as células utilizando um sistema de eletroporação em 250 volts e 500 microfarads.É fundamental utilizar hPSCs saudáveis e em proliferação para a edição do genoma. Após a eletroporação, transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros com cinco mililitros de meio completo pré-aquecido e, em seguida, pelote as células. Re-suspenda as células em 10 mililitros de meio completo com inibidor de ROCK a 10 micromolar e plaque uma vez 10 à sexta, 2,5 vezes 10 à sexta e cinco vezes 10 à sexta células de cada eletroporação em placas revestidas com vitronectina, de modo que pelo menos uma das placas tenha colônias suficientes de células isoladas para seleção.Cultive as células a 37 graus Celsius. No segundo dia, inicie a seleção com neomicina adicionando meio contendo 500 microgramas por mililitro de sulfato de G418. No sexto dia, inicie a seleção com puromicina adicionando meio contendo um micrograma por mililitro de diidrocloreto de puromicina.Nos dias 10 a 12, as colônias de células isoladas de hPSC atingirão um a dois milímetros de diâmetro. Nesse momento, selecione 12 a 24 colônias sob um microscópio estereoscópico. Desagregue mecanicamente as colônias de hPSC em pequenos fragmentos utilizando uma ponteira de pipeta de 200 microlitros e transfira as células diretamente para placas de 24 poços revestidas com vitronectina.24 horas antes da transfeção do RNA guia, trate as hPSCs iCas9 com dois microgramas por mililitro de doxiciclina. No dia da transfeção, prepare placas de 24 poços revestidas com vitronectina e dissocie as células iCas9 em células isoladas usando o reagente de dissociação 1X, como antes. Em seguida, pelote as células a 200 vezes G durante cinco minutos e re-suspenda-as a 0,5 vezes 10 à sexta células por mililitro em meio completo suplementado com dois microgramas por mililitro de doxiciclina e inibidor de ROCK a 10 micromolares.Plaque 500 microlitros das células ressuspendidas em poços individuais da placa de 24 poços. Para cada RNA guia, prepare as seguintes misturas de transfeção. Mistura A, 50 microlitros de meio com soro reduzido mais um microlitro de RNA guia.Misture B, 50 microlitros de meio com soro reduzido mais três microlitros de reagente de transfeção. Combine a mistura A e B para obter uma mistura final de 100 microlitros e incube por cinco minutos à temperatura ambiente. Adicione 50 microlitros da mistura às células nos poços duplicados da placa de 24 poços e homogeneíze bem.Após quatro dias, extraia o DNA genômico, amplifique por PCR as regiões-alvo adjacentes às sequências direcionadas pelo RNA guia e estime a eficiência de edição utilizando a digestão com T7E1. Inicie a diferenciação das linhagens de hPSC quando as células atingirem 80% de confluência, dois dias após a semeadura. Adicione o meio do dia zero de diferenciação e, em seguida, troque os meios diariamente utilizando as fórmulas mostradas aqui.No dia 10, examine os marcadores do progenitor pancreático tardio PP2, PDX1 e NKX6.1, por meio de coloração imunofluorescente em um subconjunto das células. Em seguida, prossiga para o cultivo na interface ar-líquido, tratando primeiro as células PP2 com inibidor de ROCK 10 micromolar por quatro horas. Após o tempo de incubação, dissocie as células como anteriormente.Minimize a duração do tratamento com o reagente de dissociação para maximizar a sobrevivência celular durante a semeadura na fase de diferenciação na interface ar-líquido. Aspire o reagente de dissociação antes que as células se desprendam. Em seguida, adicione 10 mililitros do meio boo-lah à placa e disperse as células PP2 em células individuais pipetando suavemente para cima e para baixo.Colete a suspensão de células isoladas. Conte o número de células e faça um pellet das células. Após ressuspender o pellet celular no meio de diferenciação S5, coloque de cinco a dez microlitros de células por ponto em um filtro de inserto de transwell.Adicione o meio S5 à parte inferior de cada inserto de transwell e incube com trocas de meio até que os marcadores endócrinos pancreáticos sejam detectáveis por coloração imunofluorescente. Esta figura mostra a junção de extremidades não homóloga mediada por iCRISPR em hPSCs. A interrupção gênica é altamente eficiente, já que nenhum processo de seleção é envolvido, e mutantes bialélicos de 20% a 50% podem ser facilmente obtidos.Para alterações genéticas eficientes e precisas, os RNAs guia são cotransfectados com um doador de DNA de fita simples que carrega a alteração de sequência específica, mostrada em vermelho. Frequentemente, para evitar novos cortes nos alelos modificados, recomenda-se incluir uma mutação silenciosa na sequência PAM, mostrada aqui em verde. Com este sistema, pode-se obter aproximadamente 10% de clones carregando a modificação genômica desejada mediada por reparo direcionado por homologia, sem alterações adicionais em ambos os alelos.Uma vez dominada, a técnica leva menos de dois meses para estabelecer uma nova linhagem de iPSCs com iCas9. Depois disso, é possível gerar diversas linhagens de colônias mutantes de iPSCs em um a dois meses. Após a geração das linhagens celulares mutantes de iPSCs, a diferenciação passo a passo in vitro dessas linhagens em células semelhantes a beta pancreáticas permite estudar os passos específicos do desenvolvimento afetados por essas mutações, o que possibilitará uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes das doenças.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

O presente estudo descreve uma abordagem diferenciada dirigida em induzir a diferenciação de pâncreas de células estaminais embrionárias humanas. De grande importância é a constatação de que células endoteliais co-cultura maturação media de células-tronco embrionárias humanas derivadas progenitores pâncreas em células que expressam insulina.

Células endoteliais em co-cultura Maturação media de células estaminais humanas embrionárias a células pancreáticas produtoras de insulina em uma abordagem diferenciada Direção

A edição do genoma de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) pode ser feita de forma rápida e eficiente. Apresentado aqui é um procedimento experimental robusto para projetar geneticamente hPSCs, como exemplificado pela edição do locus de porto seguro AAVS1 para expressar EGFP e introduzir resistência a antibióticos.

Estabelecimento de Genoma-editados pluripotentes humanas Lines Stem Cell: A partir de Segmentação de Isolamento

Aqui, apresentamos pluripotentes humanas de protocolos de cultura de células-tronco (hPSC), usados para diferenciar hPSCs em CD34+ progenitores hematopoiéticos. Este método usa a manipulação de estágio específico de WNT canônico sinalização para especificar células exclusivamente para ambos o programa hematopoiética definitivo ou primitivo.

Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

Aqui nós descrevemos um protocolo de 4 estágios para diferenciar as células-tronco embrionárias humanas para NKX6-1 + progenitoras pancreáticas in vitro. Este protocolo pode ser aplicado a uma variedade de linhas de células estaminais pluripotentes humanas.

Diferenciação eficiente dos Pluripotent Stem Cells para NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Progenitores pancreáticas

Este protocolo descreve detalhadamente a geração de células-tronco livre pegada pluripotentes induzidas (iPSCs) de células do pâncreas humanas em condições de livre de alimentador, seguido pela edição usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas e caracterização de modificado clones de célula única.

Eficiente geração e edição de IPSCs livre de alimentador de células pancreáticas humanas utilizando o sistema CRISPR-Cas9

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar insulina expressando 3D pancreatoids murino de progenitores pancreático flutuantes e10.5 dissociada e a mesênquima associada.

Geração de insulina tridimensional, livre de andaime expressando Pancreatoids do Mouse progenitoras pancreáticas em Vitro

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para diferenciar as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em proteína de pâncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) células para a geração de linhagens pancreáticas baseiam no crescimento não-colônia tipo monocamada de dissociou células únicas. Este método é adequado para produzir células hPSC-derivado homogêneas, a manipulação genética e rastreio.

Eficiente geração de pâncreas/duodeno Homeobox proteína 1+ Posterior Foregut/pancreático progenitores de hPSCs em culturas de adesão

O presente protocolo descreve um método aprimorado para aumentar a co-expressão dos fatores de transcrição PDX1 e NKX6.1 em progenitores pancreáticos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em monocamadas planares. Isto é conseguido reabastecendo a matriz fresca, manipulando a densidade celular e dissociando as células endodérmicas.

Diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas em precursores de células beta pancreáticas em um sistema de cultura 2D

A diferenciação de células-tronco em ilhotas fornece uma solução alternativa ao tratamento convencional do diabetes e à modelagem da doença. Descrevemos um protocolo detalhado de cultura de células-tronco que combina um kit de diferenciação comercial com um método previamente validado para auxiliar na produção de ilhotas derivadas de células-tronco secretoras de insulina em um prato.

Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Humanas em Aglomerados de Ilhotas Produtoras de Insulina

Este artigo apresenta um protocolo para diferenciação dirigida e análise funcional de células semelhantes a células β. Descrevemos as condições e passagens ideais de cultura para células-tronco pluripotentes humanas antes de gerar células pancreáticas produtoras de insulina. A diferenciação em seis estágios progride desde a formação definitiva da endoderme até células funcionais semelhantes às células β que secretam insulina em resposta à glicose.

Protocolo Otimizado para Geração de Células Funcionais Secretoras de Insulina Pancreáticas a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Fornecemos um protocolo minimamente invasivo para o transplante intramuscular de ilhéus de células-tronco pancreáticas derivadas de células-tronco humanas em camundongos imunodeficientes, para implantação in vivo e análise posterior.

Transplante Intramuscular de Células Endócrinas Pancreáticas Derivadas de Células-Tronco Humanas Pluripotentes em Camundongos

Aprenda a editar genomas de hPSCs usando a plataforma iCRISPR e diferenciá-las em células pancreáticas. Este método permite estudar os determinantes de linhagem no desenvolvimento pancreático humano e investigar as bases genéticas do diabetes.

Genoma Edição e Directed Diferenciação de hPSCs para interrogar Determinantes Lineage no desenvolvimento pancreático humano

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