Genoma Edição e Directed Diferenciação de hPSCs para interrogar Determinantes Lineage no desenvolvimento pancreático humano

Este protocolo demonstra como estabelecer a plataforma iCRISPR para edição rápida do genoma em hPSCs e como incorporar linhas editadas pelo genoma com diferenciação pancreática direcionada por hPSC para estudar o desenvolvimento e a doença pancreática humana. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento pancreático humano, como o controle genético do desenvolvimento pancreático normal e a base molecular do diabetes. A principal vantagem dessas técnicas é que elas nos permitem modificar eficientemente genes de interesse em hPSCs e usar essas linhagens celulares modificadas para estudos de desenvolvimento pancreático humano e doenças in vitro.

Cultive hPSCs em condições quimicamente definidas e livres de alimentador em placas revestidas com vitronectina humana truncada. No dia anterior à eletroporação, adicione 10 inibidores de ROCK micromolares durante a troca de meio. No dia da eletroporação, prepare pratos de 10 centímetros revestidos com vitronectina com antecedência.

Em seguida, remova o meio de cultura das células, lave uma vez com PBS sem cálcio e magnésio e, em seguida, trate as células com reagente de dissociação 1X a 37 graus Celsius por aproximadamente três minutos. Em seguida, aspire o reagente de dissociação antes que as células se desprendam e adicione 10,5 mililitros de meio completo. Use pipetagem suave para formar uma suspensão de célula única antes de transferir para tubos de centrífuga.

Execute uma contagem de células em 500 microlitros de suspensão de células usando um contador de células automatizado. Em seguida, pulverize os hPSCs a 200 vezes G por cinco minutos. Ressuspenda as células em PBS frio a 12,5 vezes 10 elevado à sexta célula por mililitro e alíquota em volumes de 800 microlitros.

Adicione os plasmídeos em cada suspensão de hPSC de 800 microlitros e misture bem. Transfira a mistura para uma cubeta de eletroporação de 0,4 centímetro e mantenha no gelo por aproximadamente cinco minutos. Eletroporar as células usando um sistema de eletroporação a 250 volts e 500 microfarads.

É fundamental usar hPSCs saudáveis e proliferantes para edição do genoma. Após a eletroporação, transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros com cinco mililitros de meio completo pré-aquecido e, em seguida, peletize as células. Ressuspenda as células em 10 mililitros de meio completo com inibidor de ROCK 10 micromolar e coloque uma placa de 10 elevado ao sexto, 2,5 vezes 10 elevado ao sexto e cinco vezes 10 elevado à sexta célula de cada eletroporação em placas revestidas de vitronectina, de modo que pelo menos uma das placas tenha colônias unicelulares suficientes para a colheita.

Cultive as células a 37 graus Celsius. No segundo dia, inicie a seleção de neomicina adicionando meio contendo 500 microgramas por mililitro de sulfato G418. No sexto dia, inicie a seleção de puromicina adicionando um meio contendo um micrograma por mililitro de dicloridrato de puromicina.

Nos dias 10 a 12, as colônias unicelulares de hPSC atingirão de um a dois milímetros de diâmetro. Neste ponto, escolha de 12 a 24 colônias sob um microscópio estéreo. Desagregue mecanicamente as colônias de hPSC em pequenos pedaços usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros e transfira as células diretamente para placas de 24 poços revestidas com vitronectina.

24 horas antes da transfecção de RNA guia, trate as hPSCs iCas9 com dois microgramas por mililitro de doxiciclina. No dia da transfecção, prepare placas de 24 poços revestidas com vitronectina e dissocie as células iCas9 em células únicas usando reagente de dissociação 1X como antes. Em seguida, pulverize as células a 200 vezes G por cinco minutos e ressuspenda as células a 0,5 vezes 10 elevado a sexta células por mililitro em meio completo suplementado com dois microgramas por mililitro de doxiciclina e inibidor de ROCK 10 micromolar.

Placa de 500 microlitros das células ressuspensas em poços individuais da placa de 24 poços. Para cada RNA guia, faça as seguintes misturas de transfecção. Misture A, 50 microlitros de meio sérico reduzido mais um microlitro de RNA guia.

Misture B, 50 microlitros de meio de soro reduzido mais três microlitros de reagente de transfecção. Combine a mistura A e B para fazer uma mistura de 100 microlitros e incube por cinco minutos em temperatura ambiente. Adicione 50 microlitros da mistura às células nos poços duplicados da placa de 24 poços e misture bem.

Após quatro dias, extraia o DNA genômico, a PCR amplifica as regiões-alvo que flanqueiam as sequências de direcionamento do RNA guia e estima a eficiência de edição usando a digestão T7E1. Inicie a diferenciação das linhas de hPSC quando as células atingirem 80% de confluência dois dias após a semeadura. Adicione o dia de diferenciação zero médio e, em seguida, altere a mídia diariamente usando as fórmulas mostradas aqui.

No dia 10, examine os marcadores PP2 progenitores pancreáticos posteriores, PDX1 e NKX6.1 por coloração imunofluorescente em um subconjunto das células. Em seguida, prossiga para a cultura de interface ar-líquido tratando primeiro as células PP2 com inibidor de ROCK 10 micromolar por quatro horas. Decorrido o tempo de incubação, dissocie as células como antes.

Minimize a duração do tratamento com reagente de dissociação para maximizar a sobrevivência celular para semeadura no estágio de diferenciação da interface ar-líquido. Aspirar o reagente de dissociação antes de as células se terem desprendido. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio boo-lah à placa e disperse as células PP2 em células individuais, pipetando suavemente para cima e para baixo.

Colete a suspensão de célula única. Conte o número da célula e faça a pelota das células. Depois de ressuspender o pellet celular no meio de diferenciação S5, identifique de cinco a 10 microlitros de células por ponto em um filtro de inserção transwell.

Adicione o meio S5 na parte inferior de cada inserção transwell e incube com alterações de meio até que os marcadores endócrinos pancreáticos sejam detectáveis por coloração imunofluorescente. Esta figura mostra a junção de extremidade não homóloga mediada por iCRISPR em hPSCs. O nocaute genético é altamente eficiente, pois nenhum processo de seleção está envolvido, e 20% a 50% de mutantes bialélicos podem ser facilmente alcançados.

Para alterações genéticas eficientes e precisas, os RNAs guia são cotransfectados com um doador de DNA de fita simples carregando a alteração específica da sequência, mostrada em vermelho. Freqüentemente, para evitar o recorte em alelos modificados, recomenda-se incluir uma mutação silenciosa na sequência PAM, mostrada aqui em verde. Com este sistema, aproximadamente 10% dos clones que carregam a modificação do genoma mediada por reparo dirigida por homologia desejada, sem alterações adicionais em ambos os alelos, podem ser alcançados.

Uma vez dominado, leva menos de dois meses para estabelecer uma nova linha iCas9 hPSC. Depois disso, uma variedade de linhagens de colônias mutantes de hPSC pode ser gerada dentro de um a dois meses. Após a geração de linhagens mutantes genéticas hPSC, a diferenciação gradual in vitro das linhagens celulares mutantes em células pancreáticas semelhantes a beta nos permite estudar as etapas específicas de desenvolvimento afetadas por essas mutações, o que permitirá uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes da doença.