Name: Murino Linfócitos Rotulagem por 64 Cu-Antibody Receptor Segmentação para In Vivo Tráfico celular por PET / CT (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Aprenda a rotular linfócitos murinos com anticorpo monoclonal radioativo de cobre para rastrear migração celular in vivo por PET/CT em modelos de inflamação ou câncer. Este método permite imagens de alto contraste com mínimos efeitos na viabilidade celular por até 48 horas.

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Os autores agradecem a Dr. Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant, bem como Natalie Altmeyer pelo apoio durante a análise experiências e dados. Este trabalho foi apoiado pela Werner Siemens-Foundation, o DFG através do SFB685 (B6 projeto) e Fortune (2309-0-0).

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<li>Muranski, P., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+immunotherapy+of+cancer+using+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive immunotherapy of cancer using CD4+ T cells.</a> Curr. Opin. Immunol. 21 (2), 200-208 (2009).</li>
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<li>Tavaré, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Effective+Immuno-PET+Imaging+Method+to+Monitor+CD8-Dependent+Responses+to+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An Effective Immuno-PET Imaging Method to Monitor CD8-Dependent Responses to Immunotherapy.</a> Cancer Res. 76 (1), 73-82 (2016).</li>
<li>Tavaré, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+antibody+fragments+for+immuno-PET+imaging+of+endogenous+CD8%2B+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Engineered antibody fragments for immuno-PET imaging of endogenous CD8+ T cells in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (3), 1108-1113 (2014).</li>
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<li>Rini, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+with+FDG-labeled+Leukocytes+versus+Scintigraphy+with+111In-Oxine-labeled+Leukocytes+for+Detection+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">PET with FDG-labeled Leukocytes versus Scintigraphy with 111In-Oxine-labeled Leukocytes for Detection of Infection.</a> Radiology. 238 (3), 978-987 (2006).</li>
<li>Ritchie, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+macrophage+activated+killer+cells+to+sites+of+metastatic+ovarian+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of macrophage activated killer cells to sites of metastatic ovarian carcinoma.</a> Cancer Immunol. Immunother. 56 (2), 155-163 (2006).</li>
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<li>Huang, J., Lee, C. C. I., Sutcliffe, J. L., Cherry, S. R., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiolabeling+Rhesus+Monkey+CD34%2B+Hematopoietic+and+Mesenchymal+Stem+Cells+with+64Cu-Pyruvaldehyde-Bis%28N4-Methylthiosemicarbazone%29+for+MicroPET+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Radiolabeling Rhesus Monkey CD34+ Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells with 64Cu-Pyruvaldehyde-Bis(N4-Methylthiosemicarbazone) for MicroPET Imaging.</a> Mol. Imaging. 7 (1), (2008).</li>
<li>Griessinger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Tracking+of+Th1+Cells+by+PET+Reveals+Quantitative+and+Temporal+Distribution+and+Specific+Homing+in+Lymphatic+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">In Vivo Tracking of Th1 Cells by PET Reveals Quantitative and Temporal Distribution and Specific Homing in Lymphatic Tissue.</a> J Nucl Med. 55 (2), 301-307 (2014).</li>
<li>Griessinger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((64Cu+antibody-targeting+of+the+T-cell+receptor+and+subsequent+internalization+enables+in+vivo+tracking+of+lymphocytes+by+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">64Cu antibody-targeting of the T-cell receptor and subsequent internalization enables in vivo tracking of lymphocytes by PET.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (4), 1161-1166 (2015).</li>
<li>McCarthy, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+of+high+specific+activity+64Cu+using+a+biomedical+cyclotron%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient production of high specific activity 64Cu using a biomedical cyclotron.</a> Nucl. Med. Biol. 24 (1), 35-43 (1997).</li>
<li>Kalkhof, S., Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chances+and+pitfalls+of+chemical+cross-linking+with+amine-reactive+N-hydroxysuccinimide+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chances and pitfalls of chemical cross-linking with amine-reactive N-hydroxysuccinimide esters.</a> Anal. Bioanal. Chem. 392 (1), 305-312 (2008).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo apresenta um método de confiança e fácil de radiomarcar estavelmente células para o rastreamento in vivo por PET. Utilizando este método, as células Cova-TH1, isoladas e expandidas in vitro a partir de ratinhos dadores, poderia ser marcado radioactivamente com 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb e sua homing foi rastreado para o LNS pulmonares e perithymic como locais de apresentação em um Cova Cova-induzida DTHR aguda das vias aéreas. A modificação do mAb com o...

Rastreamento de células não-invasiva é um instrumento versátil para monitorizar a função celular, migração e homing in vivo. Estudos recentes de rastreamento de células têm-se centrado no mesenquimais 1, 2 ou da medula óssea derivadas de células estaminais 3 no contexto da medicina regenerativa, as células brancas do sangue perifico autogos em inflamação ou linfócitos T em terapias de células adoptivas contra cancro de 3, 4. A elucidação dos locais de acção e os princípios subjacentes biológicos de terapias à base de células é de grande importância. Linfócitos T citotóxicos CD8 +, por engenharia genética do receptor de antigénio quimérico (CAR) células T ou linfócitos que se infiltram no tumor (TIL) foram amplamente considerada como o padrão de ouro. No entanto, as células TH1 específicas para o antigénio associado a tumores provaram ser uma alternativa eficaz opção de tratamento 4, &lt;/ sup&gt; 5, 6, 7. Como actores-chave na inflamação, as doenças auto-imunes específicas de órgãos (por exemplo, artrite reumatóide ou asma brônquica), e células de elevado interesse em imunoterapia do cancro, é importante caracterizar a distribuição e homing padrões temporais de células TH1. Não invasiva in vivo de imagiologia por PET apresenta, um método altamente sensível quantitativa 8 para analisar os padrões de migração celular, no retorno in vivo, e os sítios de acção de células T e respostas durante a inflamao, alergias, infecções ou de rejeição de tumor 9, 10, 11. Clinicamente, 111In-oxina é usado para cintigrafia de leucócitos para a discriminação de inflamação e infecção de 12, enquanto que 2-desoxi-2- (18F) fluoro-D-glucose (18F-FDG) é comumente utilizada para estudos de rastreio celular por PET 3, 13. Uma grande desvantagem deste marcador de PET, no entanto, é a meia-vida curta do radionuclídeo 18 M em 109,7 min e a baixa estabilidade intracelular que impede a imagiologia em pontos de tempo mais tardios após a transferência adoptiva de células. Para longo prazo, os estudos in vivo de rastreio celular por PET, embora instável nas células, 64 Cu-PTSM é frequentemente usado para marcar as células não especificamente 14, 15, com efeitos prejudiciais minimizadas sobre a viabilidade das células T e a função de 16. Este protocolo descreve um método para reduzir ainda mais os efeitos desvantajosos sobre a viabilidade e função das células utilizando um receptor de células T (TCR) de mAb marcado radioactivamente especï¿½ico. Em primeiro lugar, a produção do radioisótopo 64 Cu, a conjugação do mAb KJ1-26 com the quelante DOTA, e o subsequente 64 de Cu-radiomarcação são mostrados. Num segundo passo, o isolamento e a expansão de células TH1 Cova-de ratinhos dadores DO11.10 e a radiomarcação com 64Cu-carregado DOTA-conjugado mAb KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) são descritos em detalhe. A avaliação dos valores de absorção e de efluxo de radioactividade com um calibrador de doses e pela y-contagem, respectivamente, bem como a avaliação dos efeitos de 64 Cu-radiomarcao sobre a viabilidade celular por exclusão com azul de tripano e funcionalidade com ELISA y IFN-são apresentados . Para não invasiva no rastreamento de células in vivo, o desencadeamento de um modelo de ratinho de-induzida aguda das vias aéreas Cova DTHR e aquisição de imagem por PET / CT após transferência adoptiva de células encontram-se descritos. Além disso, esta abordagem de marcao podem ser transferidos para diferentes modelos de doença, as células T de murídeo com diferentes TCRs ou células gerais de interesse com receptores ligados a membranas ou mar expressãokers subjacente membrana contínua de vaivém 17.

<table><tbody><tr><td>HCl, Suprapur</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>1.00318</td><td>64produção</td></tr><tr><td>Metanol, Suprapur</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>1.06007</td><td>64produção</td></tr><tr><td>Isopropanol, Suprapur</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>1.0104</td><td>64produção</td></tr><tr><td>Pt/Ir (90/10) placa</td><td>&Ouml; gussa</td><td>Produção personalizada</td><td>64</td></tr><tr><td>Câmara PEEK</td><td>WKL</td><td>Produção personalizada</td> <td>64produção</td></tr><tr><td>64Ni</td><td>Produção Chemotrade</td><td></td><td>64</td></tr><tr><td>Polygram SIL G/UV 254 placa</td><td>Macherey-Nagel</td><td>805021</td><td>64produção</td></tr><tr><td>Troca iônica coluna</td><td>BioRad</td><td>AG1-X8</td><td>64produção</td></tr><tr><td>Sistema alvo de estado sólido para PETtrace</td><td>WKL</td><td>costum made</td><td>64production</td></tr><tr><td>64work-up module</td><td>WKL</td><td>costum made</td><td>64produção</td></tr><tr><td>Calibrador de dose</td><td>Capintec</td><td>CRC-25R</td><td></td></tr><tr><td>PETtrace ciclotron</td><td>General Electric Medical Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOTA-NHS</td><td>Macrocíclicos</td><td>B-280</td><td>DOTA-conjugação</td></tr><tr><td>Anti-cOVA-TCR anticorpo (KJ1-26)</td><td></td><td>Isolado de cultura de células de hibridoma</td><td>DOTA-conjugação</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71633</td><td>DOTA-conjugação</td></tr><tr><td>H+ Chelex 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td>DOTA-conjugação</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 unidade de filtro</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC910008</td><td>DOTA-conjugação</td></tr><tr><td>Rotipuran água ultrapura</td><td>Carl</td><td>Roth HN68.3</td><td>DOTA-conjugação</td></tr><tr><td>Acetato de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32301</td><td>DOTA-conjugação</td></tr><tr><td>PBS</td><td>University Tuebingen</td><td></td><td>Conjugação DOTA</td></tr><tr><td>Micro Bio-spin P-6 coluna</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>7326221</td><td>DOTA-conjugação</td></tr><tr><td>Citrato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71497</td><td>DOTA-conjugação</td></tr><tr><td>Cyclone Plus PhosphorImager&nbsp;</td><td>Perkin-Elmer</td><td>L2250116</td><td>DOTA-conjugação</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Merck Millipore</td><td>102568</td><td>ingrediente para meio de células T&nbsp;</td></tr><tr><td>Ingrediente FCS</td><td>Merck Millipore</td><td>S0115/1004B</td><td>para meio de células T&nbsp;</td></tr><tr><td>Ingrediente de piruvato de sódio</td><td>Merck Millipore</td><td>L0473</td><td>para meio de células T&nbsp;</td></tr><tr><td>MEM-aminoácidos</td><td>Merck Millipore</td><td>K0293</td><td>ingrediente para meio de células T&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Ingrediente Merck Millipore</td><td>L 1613</td><td>para meio de células T&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; Penicilina/Estreptomicina</td><td>Merck Millipore</td><td>A2212</td><td>ingrediente para meio de células T&nbsp;</td></tr><tr><td>0,05 mM 2-&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>ingrediente para meio de células T&nbsp;</td></tr><tr><td>DO11.10 camundongos</td><td></td><td>reprodutores internos Cultura de</td><td>células TH1</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>Cultura de células TH1</td></tr><tr><td>Filtro de células 40 &micro; m&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>TH1 cultura de células</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>TH1 cultura de células</td></tr><tr><td>CD4 MicroBeads, camundongo</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-097-145</td><td>Cultura de células TH1</td></tr><tr><td>Separador QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-976</td><td>Cultura de células TH1</td></tr><tr><td>Coluna LS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td>Cultura</td></tr> <tr>de células TH1<td>anticorpo anti-CD4 (Gk1.5)</td><td></td><td>Isolado de cultura de células de hibridoma</td><td>Anticorpo anti-CD8 de cultura de células TH1</td></tr><tr><td>(5367.2)</td><td></td><td>Isolado de cultura de células de hibridoma Cultura de</td><td>células TH1</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-rato (MAR18.5)</td><td></td><td>Isolado de cultura de células de hibridoma Cultura de</td><td>células TH1</td></tr><tr><td>Complemento de coelho MA</td><td>tebu-Bio</td><td>CL3221</td><td>Cultura de células TH1</td></tr><tr><td>Anti-IL-4 anticorpo (11B11)</td><td></td><td>Isolado de cultura de células de hibridoma Cultura de</td><td>células TH1</td></tr><tr><td>cOVA 323-339-peptídeo&nbsp;</td><td>EMC-micro-coleções</td><td>Pedido personalizado</td><td>Cultura de células TH1</td></tr><tr><td>CPG1668-oligonucleotídeos</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td>Pedido personalizado</td><td>Cultura de células TH1</td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Novartis</td><td>65483-116-07</td><td>Cultura de células TH1</td></tr><tr><td>Placas de 96 poços</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>655180</td><td>Placas de cultura de células TH1</td></tr><tr><td>de 24 poços</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>662160</td> Frasco de cultura de <td>células TH1</td></tr><tr><td></td><td>Greiner&nbsp;</td><td>660175</td><td>Placas de cultura de células TH1</td></tr><tr><td>de 48 poços</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>677 180</td><td>rotulagem de células</td></tr><tr><td>Gammacell 1000</td><td>Best Theratronics</td><td>via consulta&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gulmay RT225</td><td>Gulmay</td><td>via inquérito&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripano</td><td>Merck Millipore</td><td>L6323</td><td>in vitro avaliação</td></tr><tr><td>Mouse IFN-&gama; Avaliação 558258</td><td></td><td>in vitro da ELISA</td><td>BD Biosciences</td></tr><tr><td>Kit de detecção de apoptose PE Annexin V&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Avaliação</td> <td>559763in vitro</td></tr><tr><td>Tubo 5 mL</td><td>Avaliação Sarstedt</td><td>55.476</td><td>in vitro</td></tr><tr><td>Tubos de fundo redondo&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352008</td><td>in vitro avaliação</td></tr><tr><td>Assistente &gamma;-contador</td><td>Perkin-Elmer</td><td>2480-0010</td><td>in vitro avaliação</td></tr><tr><td>ELISA Reader MultiscanEX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51118177</td><td>in vitro avaliação</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Leica</td><td>via consulta&nbsp;</td><td>Avaliação in vitro</td></tr><tr><td>BD LSRII&nbsp;</td><td>Consulta da BD Biosciences</td><td>via&nbsp;</td><td>in vitroevaluation</td></tr><tr><td>Camundongos BALB / c</td><td>Charles River</td><td>028</td><td>in vivo tráfego de células</td></tr><tr><td>Gel de alumínio</td><td>Serva Eletroforese</td><td>12261.01</td><td>in vivo tráfico de células</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer HealthCare</td><td>Encomendado via Hospital universitário</td><td>< >in vivo tráfico de células</td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Ratiopharm</td><td>Encomendado via Hospital universitário</td><td>in vivo tráfico de células</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>CP-Pharma</td><td>Encomendado via Hospital universitário</td><td>in vivo tráfico de células</td></tr><tr><td>30 G agulha</td><td>BD Biosciences</td><td>304000</td><td>in vivo tráfico de células</td></tr><tr><td>Seringa</td><td>BD Biosciences</td><td>11612491</td><td>in vivo tráfego celular</td></tr><tr><td>Capilares 10 &micro; L</td><td>VWR</td><td>612-2439</td><td></td></tr><tr><td>Inveon PET scanner</td><td>Siemens Healthineers</td><td>não está mais disponível</td><td>in vivo tráfego de células, empresas alternativas: Bruker, Mediso&nbsp;</td></tr><tr><td>O scanner Inveon SPECT/CT</td><td>Siemens Healthineers</td><td>não está mais disponível</td><td>in vivo tráfego de células</td></tr><tr><td>Inveon Research Workplace</td><td>Análise de imagem da Siemens Healthineers</td><td></td><td>, software alternativo: Pmod</td></tr></tbody></table>

murino linfócitos rotulagem por<sup&gt; 64</sup&gt; cu-antibody receptor segmentação para<em&gt; in vivo</em&gt; tráfico celular por pet / ct

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Este protocolo ilustra a produção de 64 Cu e o quelante de conjugao / radiomarcação de um anticorpo monoclonal (mAb), seguido por cultura de células de linfócitos de murídeo e o receptor 64 de Cu-anticorpo segmentação das células. Avaliação in vitro do marcador radioactivo e não-invasivo de rastreamento de células in vivo num modelo animal de uma via respiratória de tipo retardado de reacção de hipersensibilidade (DTHR) por PET / CT são descritos. Em detalhe, a conjugação de um mAb com o quelante de ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético (DOTA) é mostrado. Após a produção de 64 Cu radioactivos, marcação radioactiva do mAb DOTA-conjugado é descrito. Em seguida, a expansão de ovalbumina de galinha (Cova) CD4 + especï¿½ico interferão (IFN) -γ produtoras de células T auxiliares (Cova-TH1) e a radiomarcação subsequente das células Cova-TH1 estão representados. Várias técnicas in vitro são apresentados para avaliar a effects de 64 Cu-radiomarcao sobre as células, tais como a determinação da viabilidade das células por exclusão do azul de tripano, a coloração para a apoptose com anexina V por citometria de fluxo, e a avaliação da funcionalidade por ensaio imunossorvente ligado a enzima de IFN-γ (ELISA) . Além disso, a determinação da incorporação radioactiva nas células e a estabilidade de marcação são descritos em detalhe. Este protocolo descreve ainda como realizar os estudos de seguimento de células em um modelo animal para uma DTHR das vias respiratórias e, por conseguinte, a indução de-induzida das vias respiratórias Cova DHTR aguda em ratinhos BALB / c está incluído. Finalmente, um fluxo de trabalho / CT robusta PET incluindo aquisição de imagem, reconstrução e análise é apresentada. A abordagem de direccionamento do receptor 64 de Cu-anticorpo com a internalização do receptor subsequente proporciona uma elevada especificidade e estabilidade, reduzida toxicidade celular, e as taxas de efluxo baixos em comparação com PET-traçadores comuns para marcação celular, por exemplo, 64 Cu-pyruvaldehyde bis (N-4-metiltio-semicarbazona) (64 Cu-PTSM). Finalmente, a nossa abordagem permite não invasiva no rastreamento de células in vivo por PET / CT com uma óptima relação sinal-para-fundo durante 48 h. Esta abordagem experimental pode ser transferido para modelos animais e tipos de células diferentes com receptores ligados a membranas que são internalizados.

A Figura 1 resume a marcação das células Cova-TH1 com o 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb e a concepção experimental para o in vitro e em estudos in vivo abrangidos neste protocolo. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55270/55270fig1.jpg" /> Figura 1: 64 de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb processo de etiquetagem &amp; Desenho Experimental. (A)</stron...

Seguindo a preparação de um anticorpo monoclonal 64 Cu-modificados se ligar a um receptor de células T de murino transgico, as células T são radiomarcados in vivo, analisadas para a viabilidade, funcionalidade, estabilidade rotulagem e apoptose, e transferidas adoptivamente para ratinhos com uma via aérea hipersensibilidade de tipo retardado reacção para imagem não invasivo por tomografia de emissão de positrões / tomografia computadorizada (PET / CT).

Murino Linfócitos Rotulagem por<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antibody Receptor Segmentação para<em&gt; In Vivo</em&gt; Tráfico celular por PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

O objetivo geral deste procedimento é rotular de forma estável linfócitos murinos com um anticorpo monoclonal radioativo modificado com cobre, a fim de acompanhar a distribuição temporal e os padrões de direcionamento dos linfócitos in vivo por PET/TC em modelos murinos de inflamação ou câncer. Este método pode ajudar a elucidar os locais de ação e os principais princípios biológicos subjacentes às terapias baseadas em células, como terapias com células-tronco na medicina regenerativa ou imunoterapias contra o câncer. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a obtenção de imagens da migração celular por até 48 horas, com alto contraste e efeitos prejudiciais mínimos sobre as células.Este método pode ser facilmente transferido para qualquer tipo celular de interesse com receptores específicos ligados à membrana e anticorpos monoclonais correspondentes. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades com os processos de conjugação do quelante e marcação radiativa, resultando em uma fração imunorreativa menor e atividade específica para a célula. Comece desinfetando um camundongo DO11.10 com etanol 70%.Em seguida, fixe os membros com fita adesiva e faça uma incisão mediana ao longo do abdômen do animal. Puxe lateralmente ambos os lados da incisão, separe a pele do peritônio e localize os linfonodos cervicais, axilares, braquiais e inguinais. Usando pinças rombas, transfira os linfonodos para um recipiente contendo PBS com 1% de FCS.Em seguida, abra o peritônio, separe o baço do pâncreas e do tecido conjuntivo e armazene o baço com os linfonodos. Quando todos os tecidos tiverem sido coletados, transfira as amostras para um filtro de 40 micrômetros em um tubo cônico de 15 mililitros e use o êmbolo de uma seringa para macerar os tecidos. Em seguida, lave o filtro com 10 mililitros de soro bovino fetal em PBS e colete a suspensão de células simples por centrifugação.Após a lise das células vermelhas do sangue, re-suspenda o pellet de células brancas do sangue em PBS fresco contendo FCS e MicroBeads positivos para CD4, conforme as instruções do fabricante. Após 20 minutos a quatro graus Celsius, lave as células em até 50 mililitros de tampão PBS fresco com FCS e re-suspenda as células no volume apropriado de PBS com FCS para a eluição das populações celulares negativas para CD4 em coluna magnética. Carregue as células em uma coluna de separação celular magnética e colete o fluxo passante em um tubo cônico de 15 mililitros.No final da separação magnética de células, use o êmbolo para transferir a população de células positivas para CD4 para um novo tubo cônico e ajuste a concentração da suspensão de linfócitos T positivos para CD4 para um vezes 10 à sexta células por mililitro em meio completo fresco, para armazenamento a quatro graus Celsius. Colete as células negativas para CD4 por centrifugação. Re-suspenda o pellet em anticorpos monoclonais anti-CD4, anti-CD8, camundongo anti-rato e complemento de coelho, e incube por 45 minutos a 37 graus Celsius.Após coletar as células por centrifugação, ressuspenda o pellet em três mililitros de meio completo fresco e irradie as células apresentadoras de antígeno selecionadas negativamente com 30 grays. Ajuste a concentração das células apresentadoras de antígeno para cinco vezes 10 à sexta potência de células por mililitro em meio completo fresco e adicione 100 microlitros de linfócitos T CD4-positivos e 100 microlitros de células apresentadoras de antígeno nas respectivas poças experimentais de uma placa de fundo plano de 96 poços. Em seguida, adicione os estímulos apropriados a cada poça e transfira a placa para uma incubadora de cultura celular.Para a marcação radiométrica de células TH1 específicas por ovalbumina de galinha, use primeiro um calibrador de dose para aspirar 37 megabecquerels do anticorpo radioativo específico para linfócitos T de interesse em uma seringa sem volume morto. Em seguida, transfira o anticorpo para um copo de reação e meça, subtraindo a quantidade remanescente de radioatividade na seringa da quantidade inicialmente aspirada. Acrescente então um mililitro de solução salina ao copo para gerar uma solução com concentração de 37 megabecquerels por mililitro.Em seguida, adicione duas vezes 10 à sexta potência de células OVA-TH1 em 0,5 mililitros de meio completo a cada poço de uma placa de 48 poços, seguido por 20 microlitros da solução de anticorpo radiomarcado. Após 30 minutos em um incubador de cultura celular com segurança radiológica, a 37 graus Celsius e 7,5% de dióxido de carbono, reúna as células radiomarcadas em um tubo cônico de 50 mililitros para duas lavagens em 10 mililitros de PBS a 37 graus Celsius. Para medir a captação e o efluxo do anticorpo radiomarcado, imediatamente após a segunda lavagem, transfira uma vez 10 à sexta potência de células OVA-TH1 marcadas com anticorpo monoclonal em um mililitro de meio completo para cada um dos 10 tubos para contagem gama.Pelicular as células por centrifugação e transferir os sobrenadantes para 10 novos tubos de contagem gama. Em seguida, lavar as células com um mililitro de meio completo para remover qualquer anticorpo monoclonal marcado com radionuclídeo não ligado, e transferir os sobrenadantes para outros 10 novos tubos de contagem gama. A seguir, adicionar um mililitro de meio completo fresco às células e medir os valores iniciais de captação em um contador gama.Para a imagemagem por PET/TC in vivo, imediatamente após a marcação radiativa, ajuste as células OVA-TH1 para uma concentração de cinco vezes 10 à sétima células por mililitro em PBS e aspire 200 microlitros das células em uma seringa de um mililitro equipada com agulha de 30 gauge. Injecte as células por via intraperitoneal em um animal doente com reação de hipersensibilidade tardia à ova, entre o quarto e o quinto mamilo. Em seguida, para facilitar o registro conjunto das imagens de PET e TC durante a análise de imagem, fixe capilares de vidro contendo solução de anticorpo marcado radiativamente sob a maca de um pequeno animal.Quando o nível apropriado de sedação for alcançado, aplique pomada nos olhos do animal e use cotonetes e fita cirúrgica para imobilizar o camundongo na maca. Mova a maca com o camundongo para o escâner de PET e centralize o campo de visão com foco nos pulmões para adquirir uma varredura estática de PET de 20 minutos com uma janela de energia de 350 a 650 quiloeletronvolts. Transfira a maca com o camundongo para o escâner de TC.Por meio da visualização de reconhecimento, centralize o campo de visão nos pulmões. Adquira uma imagem planar de TC por meio de 360 projeções durante uma rotação de 360 graus no modo step-and-shoot, com um tempo de exposição de 350 milissegundos e um fator de agrupamento de quatro. A dose radioativa aplicada de 0,7 megabecquerels reduz a viabilidade das células TH1 em apenas 8%, enquanto doses mais altas demonstram um efeito ainda mais acentuado.Em comparação com a marcação radiativa com cobre-PTSM, não é observada nenhuma vantagem significativa para o anticorpo radiomarcado. As células TH1 marcadas com anticorpo radioativo específico para linfócitos T demonstram nenhuma perda de funcionalidade, conforme evidenciado pela secreção de interferon gama, um efluxo reduzido de radioatividade e uma indução diminuída de apoptose em comparação com as células TH1 marcadas com cobre-PTSM. Aqui, são apresentadas imagens representativas de PET estático de alta resolução e imagens anatômicas de TC após a transferência adotiva de células marcadas com anticorpo monoclonal radiomarcado, com as imagens fusionadas nas vistas coronal, axial e sagital com a ajuda de capilares de vidro posicionados conforme acabou de ser demonstrado.Foram delineados volumes de interesse nos linfonodos pulmonares e peritímicos nas imagens de PET corrigidas para decaimento e normalizadas para calcular a porcentagem da dose injetada por centímetro cúbico. O rastreamento da migração das células OVA-TH1 para os linfonodos pulmonares e peritímicos como sítios de apresentação de ova em uma reação de hipersensibilidade tardia nas vias aéreas revela que os sinais de PET in vivo derivados das células OVA-TH1 marcadas com anticorpo monoclonal são consideravelmente mais altos do que os sinais das células marcadas com cobre-PTSM. Além disso, os valores de captação das células OVA-TH1 foram significativamente aumentados nos animais doentes com reação de hipersensibilidade tardia em comparação com seus irmãos controle não tratados.Uma vez dominada, esta técnica pode ser utilizada para estudar os papéis e locais de ação específicos de células imunes em modelos animais de doenças humanas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que cada tipo celular pode reagir de forma diferente à radiação e ajustar a quantidade de radioatividade utilizada para a marcação de acordo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar e cultivar células T específicas para antígenos, marcar essas células com um anticorpo radioativo e imaginar sua distribuição e cinética de homing com PET/CT.Não se esqueça de que trabalhar com radioatividade pode ser extremamente perigoso e que precauções, como o uso de blindagem de chumbo adequada, minimização dos tempos de exposição e aumento da distância em relação à fonte radioativa, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste vídeo, demonstramos a radiomarcação intracelular de células T auxiliares usando anticorpos monoclonais conjugados com isótopos radioativos para imagens de tomografia por emissão de pósitrons não invasivas.

Marcação de linfócitos T auxiliares murinos usando anticorpos monoclonais radiomarcados

Este vídeo demonstra uma técnica envolvendo um radioimunoconjugado para a imagem in vivo de um tumor em um modelo de camundongo. Após a injeção do radioimunoconjugado, os anticorpos do conjugado se ligam a um antígeno de membrana específico nas células cancerígenas. O radiotraçador do conjugado emite pósitrons que interagem com elétrons vizinhos para produzir energia, que é detectada por um scanner de tomografia por emissão de pósitrons (PET) para criar uma imagem do tumor.

Uma técnica de imagem PET in vivo para detectar tumores em um modelo murino usando anticorpos radiomarcados

Nós descrevemos um protocolo geral para no rastreamento de células in vivo utilizando ressonância magnética em um modelo de rato com ex vivo células marcadas. Um protocolo típico para a marcação de células, o processamento de aquisição de imagem e a quantificação é incluído.

In vivo 19 F MRI para Rastreamento celular

A cicloadição de Diels-Alder de demanda inversa de elétrons bioortogonal foi aproveitada para criar uma estratégia de imagem PET pré-direcionada eficaz e modular para o câncer. Neste protocolo, as etapas desta metodologia são descritas no contexto de um sistema modelo que emprega o anticorpo direcionado ao câncer colorretal huA33 e um radioligante marcado com 64.

Aproveitando a demanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder para Pretargeted PET Imagem

Peptídeos virais-derivado acoplados ao anticorpo-conjugados (ACs) é uma abordagem ganhando impulso devido ao potencial de entregar cargas moleculares com acumulação de células de tumor aumento. Utilizando métodos comuns para avaliar a conjugação do peptide, AC e acúmulo intracelular de carga e direcionamento do tumor, este protocolo ajuda pesquisadores durante as fases de desenvolvimento inicial chave.

Avaliação inicial do anticorpo cojugado modificado com peptídeos virais-derivado para aumentar a acumulação celular e melhorando o direcionamento do Tumor

Este protocolo descreve um método de imagem residente tumor infiltrando T CD8 células rotulado com anticorpos fluorescente acoplados dentro de fatias de tumor de pulmão humano. Esta técnica permite análises em tempo real de migração de células T CD8 usando microscopia confocal.

Ex Vivo Imagem de linfócitos de T CD8 residente no Tumor de pulmão humano fatias utilizando microscopia Confocal

Protocolos para avaliação quantitativa da quimiotaxia de linfócitos e migração são ferramentas importantes para pesquisa de Imunologia. Aqui, um protocolo em vitro é descrito que permite em tempo real, multiplexados avaliação da migração celular, bem como um complementares na vivo técnica permitindo rastreamento de células nativas para o baço.

Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo

Aqui, demonstramos os métodos para a quantificação na vivo de saída de leucócitos de ingênuo, inflamado e pele murino maligna. Realizamos uma Head-to-comparação de dois modelos: transdermal FITC photoconversion de aplicativo e in situ . Além disso, vamos demonstrar a utilidade da photoconversion para controlar a saída de leucócitos de tumores cutâneos.

Quantificar a saída de leucócitos através de vasos linfáticos da pele murino e tumores

Este protocolo descreve uma técnica para populações diferentes da pilha da imagem em drenar nós de linfa sem alterações na estrutura do órgão.

Visualizando estrutura de linfonodos e localização celular usando microscopia confocal ex-vivo

Este protocolo descreve a metodologia para rastreamento não invasivamente de células T geneticamente modificadas para expressar receptores de antígeno quimérico in vivo com uma plataforma clinicamente disponível.

Imagem dinâmica das células T do receptor de antígeno quimérico com [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Tomografia Computadorizada

Este artigo detalha a metodologia para radiomarcação de um anticorpo monoclonal anti-CD19 humano-específico e como usá-lo para quantificar células B no sistema nervoso central e tecidos periféricos de um modelo de esclerose múltipla em camundongos usando imagens PET in vivo, contagem gama ex vivo e abordagens de autorradiografia.

Imagem de células B CD19+ em um modelo experimental de encefalomielite autoimune em camundongos usando tomografia por emissão de pósitrons

Aprenda a rotular linfócitos murinos com anticorpo monoclonal radioativo de cobre para rastrear migração celular in vivo por PET/CT em modelos de inflamação ou câncer. Este método permite imagens de alto contraste com mínimos efeitos na viabilidade celular por até 48 horas.

Murino Linfócitos Rotulagem por

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