Um protocolo de ressonância magnética para estimativa de tempo de início curso em situações de isquemia Cerebral permanente
16 de setembro de 2017
É descrito um protocolo para a estimativa de tempo de início de curso em um modelo do rato do curso explorando parâmetros quantitativos a ressonância magnética (qMRI). O procedimento explora MRI de difusão para a delimitação da lesão vascular cerebral agudo e quantitativos T1 e T2 (qT1 e qT2) tempos de relaxamento para o sincronismo de AVC.
A ressonância magnética fornece uma ferramenta sensível e específica para detectar AVC isquêmico agudo, determinando o Coeficiente de Difusão Aparente do tecido cerebral denominado ADC. Em um modelo de rato de AVC isquêmico, as diferenças hemisféricas nos tempos quantitativos de relaxamento T1 e T2 dentro da lesão isquêmica aumentaram com o tempo desde o início do AVC. A dependência temporal dessas diferenças é heuristicamente descrita por uma função linear e, portanto, fornece estimativas simples do tempo de início do AVC.
Os volumes de tecido com tempos elevados de relaxamento em T1 e T2 dentro da lesão isquêmica também aumentam linearmente, fornecendo um método complementar para o tempo de AVC. Aqui, apresentamos uma rotina de computador semiautomatizada que usa ADC para delinear o tecido AVC isquêmico agudo na fase hiperaguda da isquemia focal permanente. Tempos de relaxamento elevados também identificados no tecido isquêmico do AVC são usados para determinar o tempo de início do AVC.
Ratos Wistar machos pesando 300 a 400 gramas foram usados e receberam oclusão permanente da artéria cerebral média para induzir acidente vascular cerebral isquêmico focal. Durante a operação e os experimentos de ressonância magnética, o rato é anestesiado com isoflurano por meio de uma máscara facial. Depois de fazer uma incisão no pescoço, a traqueia é exposta e os músculos são separados da traqueia.
A ferida é expandida para abrir caminho para a Artéria Carótida Comum ou CCA. O CCA é exposto evitando o feixe de nervos próximo a ele. Um micro gancho é usado para capturar o CCA e expor a artéria carótida externa, a ECA, e a artéria carótida interna, a ICA.
A circulação do CCA é bloqueada com fio cirúrgico. O ECA é suturado. O corpo carotídeo é separado da ACI e a bifurcação da ACI é localizada para garantir que, quando o fio ocluído é inserido, ele alcance e bloqueie a artéria cerebral média esquerda.
Uma sutura frouxa é introduzida ao redor da ACI. Na ACI, um clipe é inserido de forma que seja colocado mais fundo do que a sutura. A ECA é mantida próxima ao nó duplo que é amarrado ao redor da artéria carótida externa.
A parte excedente do ECA é queimada para evitar hemorragia do ECA. O fio de oclusão é inserido no ECA e o ICA é alinhado com o ECA. O fio é então avançado até o clipe.
A sutura solta é então apertada para que o fio ainda possa deslizar dentro do ECA. O clipe é então removido e o fio de oclusão é avançado até que aproximadamente dois centímetros tenham sido inseridos. Outro nó é adicionado para que o nó solto se torne um nó duplo.
As suturas são amarradas e os afastadores removidos. A ferida é então fechada. Imediatamente após a oclusão, o rato é preso em um berço no centro da barra magnética de 9,4 Tesla usando fones de ouvido e um bloco de mordida.
Durante a imagem, os níveis de isoflurano são mantidos em torno de 2% e a temperatura é mantida perto de 37 graus Celsius usando uma almofada de aquecimento de água colocada sob o torso do rato. Durante a imagem, a frequência respiratória e a temperatura retal são monitoradas. Os dados de ressonância magnética são adquiridos por até cinco horas após a oclusão e, em intervalos de uma hora, são adquiridos 12 cortes axiais amostrados de forma congruente do traço do tensor de difusão, CPMG T2 e Flash T1.
Os detalhes dos parâmetros da sequência estão listados no manuscrito. No final do experimento, os ratos são sacrificados e a coloração com cloreto de trifenil tetrazólio ou TTC é realizada para confirmar a presença de isquemia no cérebro de ratos. Detalhes para a coloração TTC são fornecidos no manuscrito.
Obtidos os dados de RM, buscamos desenvolver um método semiautomatizado para detectar o tecido isquêmico e caracterizar sua assinatura relaxométrica. O relaxamento T2 foi modelado como um decaimento mono exponencial. Os mapas T2 foram ajustados tomando o algoritmo natural ao longo da dimensão do tempo de eco e ajustando uma função linear em cada voxel.
O relaxamento T1 foi modelado como uma magnetização monoexponencial retornada ao equilíbrio e ajustada usando o método do giz binário. Os mapas ADC foram calculados assumindo a perda exponencial mono de sinal em relação ao valor B. Com todas as imagens quantitativas no lugar, o tecido isquêmico pode ser identificado usando os mapas de ADC recíproco.
Esses mapas foram limiares de tal forma que o tecido foi rotulado como isquêmico se o ADC recíproco excedesse um desvio absoluto mediano acima do ADC recíproco mediano do tecido não isquêmico. Este processo pode ser realizado de forma automática e objetiva. Com o tecido isquêmico demarcado, foi calculada a distribuição de T1 e T2 em cada volume de interesse.
Para obter a distribuição de T1 e T2 no hemisfério contralateral, foi refletido o volume de interesse para o tecido isquêmico. Neste exemplo, as distribuições T1 e T2 podem ser vistas mudando para a direita com o tempo após o início. Para descrever as mudanças nas distribuições de T1 e T2 com o tempo, usamos dois parâmetros diferentes.
O parâmetro f é definido conforme mostrado. Isso fornece uma parametrização heurística da fração de voxels na lesão isquêmica que têm valores de T1 ou T2 anormalmente altos ou baixos. É necessário que o voxel em um mapa T1 ou T2 possa ser categorizado como tendo um valor alto, baixo ou normal.
Um valor alto de T1 ou T2 na lesão isquêmica foi definido como aquele que excede 1/2 máximo acima da mediana de T1 ou T2 do volume não isquêmico de interesse. F1 é a fração de voxels isquêmicos com altos valores de T1, F2 a fração de voxels com altos valores de T2. Em segundo lugar, o volume de sobreposição dentro das regiões de tecido isquêmico identificado com ADC com T1 alto e T2 alto é calculado, normalizado pelo volume cerebral total.
O F1, F2 e o volume de sobreposição foram calculados para todos os ratos em todos os momentos de medição. Eles foram então usados separadamente para calcular o tempo de início da isquemia, ajustando um modelo linear. Ao fazer isso, a incerteza nos tempos de início pode ser calculada.
Essas incertezas foram parametrizadas pelo erro quadrático médio para o ajuste linear. Na lesão de AVC positiva para difusão, todos os parâmetros aumentaram linearmente com o tempo. E de acordo com as barras de erro quadrático médio, nosso protocolo fornece estimativas de tempo de início do AVC com uma precisão de meia hora.
É uma tendência geral que os dados de T2 superem T1 e a melhor precisão para a determinação do tempo de início é obtida a partir do volume de T1 e T2 elevados sobrepostos. Regiões com T1 e T2 anormais estão heterogeneamente dispersas dentro da lesão isquêmica, provavelmente devido a diferentes sensibilidades desses parâmetros quantitativos de RM às alterações fisiopatológicas causadas pela isquemia. Isso sugere que os parâmetros quantitativos de ressonância magnética também podem ser informativos sobre o status do tecido. Aqui, apresentamos um protocolo de ressonância magnética que permite estimar o tempo de início do AVC com considerável precisão e, ao fazê-lo, é informativo sobre o estado do tecido cerebral durante a isquemia permanente.
O benefício de quantificar os tempos de relaxamento para estimar o tempo de início do AVC é que eles são insensíveis a variações inerentes causadas por fatores técnicos, como heterogeneidades do campo magnético e densidade de prótons, incluindo a variação esperada do campo magnético dentro da lesão isquêmica. Deve-se perceber que o protocolo atual se aplica apenas à isquemia permanente e os parâmetros de aquisição de dados de ressonância magnética fornecidos no artigo são específicos para o scanner de ressonância magnética de 9,4 Tesla usado. Nossos estudos anteriores no artigo anexo mostram que o procedimento também é preciso em 4,7 Tesla.
No geral, acreditamos que nosso protocolo tem aplicação na pesquisa pré-clínica de AVC, incluindo estudos que investigam terapias anti-isquêmicas.
Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para estimar o momento do início do acidente vascular cerebral em um modelo de rato utilizando imagens de ressonância magnética quantitativa (qMRI). O método utiliza a ressonância magnética de difusão para identificar lesões de acidente vascular cerebral agudo e emprega tempos de relaxamento T1 e T2 quantitativos para determinar com precisão o momento do início do acidente vascular cerebral.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Imagem por Ressonância Magnética
- Pesquisa sobre AVC
Contexto
- A ressonância magnética (RM) é fundamental para detectar o acidente vascular cerebral isquêmico agudo.
- O estudo concentra-se em um modelo de rato para explorar a relação entre os tempos de relaxamento qT1 e qT2 e o momento da ocorrência do acidente vascular cerebral.
- Compreender o momento de início do acidente vascular cerebral é essencial para melhorar os resultados do tratamento.
- A ressonância magnética por difusão ajuda a delinear lesões isquêmicas de forma eficaz.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para estimar o momento de início do acidente vascular cerebral utilizando parâmetros de RMq.
- Avaliar as alterações nos tempos de relaxação T1 e T2 em relação à progressão do acidente vascular cerebral.
- Fornecer uma abordagem semi-automatizada para identificar tecido isquêmico.
Métodos Utilizados
- Ratos Wistar machos foram submetidos à oclusão permanente da artéria cerebral média para induzir acidente vascular cerebral.
- Realizou-se ressonância magnética de difusão para obter dados sobre os tempos de relaxamento T1 e T2.
- Mapas de ADC foram gerados para delinear o tecido isquêmico.
- Modelos estatísticos foram aplicados para estimar o tempo de início do acidente vascular cerebral com base nas alterações dos tempos de relaxamento.
Resultados Principais
- Os tempos de relaxamento T1 e T2 quantitativos aumentaram linearmente com o tempo após o acidente vascular cerebral.
- O método semi-automatizado identificou efetivamente o tecido isquêmico.
- O momento do início do acidente vascular cerebral pôde ser estimado com incerteza reduzida mediante modelagem linear.
- Os tempos de relaxamento elevados correlacionaram-se com o volume de tecido isquêmico.
Conclusões
- O estudo fornece um protocolo robusto para estimar o momento de início do acidente vascular cerebral em um modelo de rato.
- Parâmetros quantitativos de RNM são valiosos para compreender a dinâmica do acidente vascular cerebral.
- Este método pode aumentar a precisão do diagnóstico e do planejamento do tratamento do acidente vascular cerebral.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A estimativa do momento de início do acidente vascular cerebral é fundamental para a avaliação pré-clínica de terapêuticas neuroprotetoras, em que o cronograma influencia diretamente a interpretação mecanicista e as decisões de prosseguimento ou interrupção. Este protocolo de ressonância magnética fornece biomarcadores quantitativos dependentes do tempo (qT1, qT2, Voverlap) que permitem reduzir os riscos nos modelos de acidente vascular cerebral ao vincular a progressão fisiopatológica a pontos finais mensuráveis por imagem. A abordagem apoia a validação de alvos em modelos de isquemia permanente, oferecendo um método reprodutível para alinhar o momento do tratamento com a evolução da lesão, aumentando a confiança preditiva nas fases iniciais da descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da correlação entre o momento da intervenção e a progressão da lesão derivada de ressonância magnética quantitativa.
- Valor Operacional: Oferece um método padronizado e parcialmente automatizado para delimitar tecido isquêmico e quantificar diferenças nos tempos de relaxamento entre grupos experimentais.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos biológicos por meio de modelagem linear de estimativas do tempo de início derivadas de qT2 (precisão de ±28 min), garantindo alinhamento temporal consistente em estudos de dose-resposta.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera métricas quantitativas de relaxação em nível de vóxel, T1 e T2, que servem como biomarcadores reprodutíveis do estado do tecido isquêmico.
- Valor Operacional: A rotina baseada em ADC permite o delineamento objetivo da lesão, reduzindo a variabilidade entre operadores na quantificação do volume da lesão.
- Prontidão do Ensaio: Saídas como Voverlap e diferenças qT2 entre hemisférios fornecem leituras lineares e escaláveis, compatíveis com fluxos de trabalho de imagem de alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Relaciona biomarcadores precoces de ressonância magnética com confirmação histopatológica (coloração TTC), apoiando a validação de desfechos de imagem frente à validação padrão-ouro de infarto.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Quantifica a heterogeneidade crescente da lesão por meio da distribuição anormal de voxels qT1/qT2, informando o estado tecidual para além da classificação binária de infarto/não infarto.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite análise estratificada por tempo dos efeitos terapêuticos ao ancorar intervenções ao tempo estimado de início, reduzindo a variabilidade em estudos longitudinais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta pré-clínica de acidente vascular cerebral, apoiando a validação inicial de alvos por meio de modelagem hemodinâmica e avançando até a identificação de compostos líderes por meio de triagem de eficácia sensível ao tempo em modelos de isquemia permanente.
- Biologia da Descoberta: Testa o engajamento do alvo ao medir como intervenções alteram a dependência temporal linear das diferenças de qT1 e qT2 entre os hemisférios isquêmico e contralateral.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios por meio de limiarização automatizada de ADC e classificação de vóxeis (T1/T2 alto/baixo/normal) para caracterização consistente da lesão.
- Análises: Fornece variáveis dependentes quantitativas (F1, F2, Voverlap, diferença hemisférica de qT2) que alimentam modelos lineares para o cálculo retroativo do tempo de início e quantificação da incerteza.
- Pesquisa Translacional: Conecta biomarcadores de imagem à progressão do volume da lesão e ao estado do tecido, apoiando a continuidade com a validação histopatológica.
- Reutilização Empresarial: A rotina computadorizada semiautomatizada é projetada para aplicação longitudinal ao longo de diferentes pontos temporais e grupos de tratamento, permitindo a reutilização da plataforma em estudos com múltiplos braços.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao fornecer pontos finais de imagemagem quantitativa com resolução temporal que refletem estados fisiopatológicos em evolução.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio da aquisição padronizada por RM (9,4T, CPMG T2, Flash T1, tensor de difusão) e pós-processamento objetivo por meio da rotina semi-automatizada.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao permitir o alinhamento temporal preciso da administração da dose com a evolução da lesão, reduzindo falsos negativos em janelas terapêuticas sensíveis ao tempo.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao quantificar a incerteza nas estimativas do tempo de início (±25 a ±47 min), permitindo que as equipes ponderem as evidências com base na precisão temporal.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em aquisição de RM quantitativa, modelagem de tempos de relaxação e análise estatística voxel a voxel.
- Depende de infraestrutura de RM de alto campo (scanner de 9,4 T mencionado; protocolo validado em 4,7 T em trabalhos anteriores) e software para mapeamento de ADC, ajuste de T1/T2 e regressão linear.
- Necessita padronização entre equipes dos limiares de classificação de voxels (por exemplo, T1/T2 alto definido como >1/2 do máximo acima da mediana contralateral) e protocolos de delimitação de lesões.
- A adaptação a modelos de isquemia transitória ou scanners clínicos exige revalidação devido às diferentes trajetórias fisiopatológicas e restrições técnicas mencionadas na fonte.
- Limitação prática: A aplicabilidade do protocolo restringe-se à isquemia focal permanente; a precisão diminui em modelos com reperfusão ou isquemia transitória, conforme o material de origem.
