Name: Análises celular linhagem e estudos da função de genes utilizando marcm Twin-ponto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Aprenda análises de linhagem celular e estudos de função gênica em neurônios utilizando o protocolo twin-spot MARCM. Esta técnica de alta resolução permite rastrear o desenvolvimento neural com marcadores distintos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST 104-2311-B-001-034) e do Instituto de Biologia Celular e Organismic, Academia Sinica, Taiwan.

1. Construir tsMARCM pronto Flies Usando o Requerido transgenes 11, 13 <ol><li> Gerar a versão original de moscas tsMARCM-prontos de transgenes que são transportadas por moscas individuais 11 (ver Tabela 1). Realizar esquemas de passagem padrão mosca genéticos, que foram descritas anteriormente, colocando vários transgenes nas mesmas populações de moscas 13. <ol><li> Em uma linha progenitora, montar os transgenes de FRT 40A, UAS-mCD8 :: GFP (o primeiro repórter, mCD8 :: GFP; a expressão do transgene está sob o controlo do promotor da sequência de activação a montante, que produz um repórter membrana-tethered aglomerado de diferenciação de rato 8 proteína de fusão com a proteína verde fluorescente), e UAS-rCD2RNAi (o supressor que inibe a expressão do segundo repórter; o ARNi contra a expressão do cluster do rato of diferenciação 2, rcd2) no braço esquerdo do cromossoma 2 nd. Lugar, colocar -GAL4 condutor no X ou 3 rd cromossoma, se possível, específico do tecido. </li><li> No outro lado da linha parental, montar os transgenes de FRT 40A, UAS-rCD2 :: RFP (o segundo repórter, rCD2 :: RFP, o outro repórter membrana-tethered consistindo de proteína rCD2 fundida com a proteína fluorescente vermelha) e UAS-GFPRNAi (o supressor que inibe a expressão de GFP mCD8 ::; a de ARNi contra a expressão de GFP) no braço esquerdo do cromossoma 2 nd. Coloque-choque térmico (hs) -FLP ou FLP tecido especificidade no X ou 3 rd cromossomo, se possível. </li></ol></li><li> Gerar a nova versão de moscas tsMARCM-prontos de transgenes que são transportadas por moscas individuais 14 (ver Tabela 1). Realizar genética da mosca esquemas de passagem de padrão, que foram descritos Previously, colocando vários transgenes nas mesmas populações de moscas 13. <ol><li> Em uma linha progenitora, montar os transgenes de um local DRF e UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (um transgene combinada de mCD8 :: GFP e o supressor que inibe a expressão de rCD2 :: RFP) juntos no mesmo braço de 2º ou 3º cromossoma (pares apropriados de transgenes de FRT e UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i são indicados na Tabela 1). Coloque condutor tecido-específicos por GAL4 em outras do que o cromossoma do local DRF escolhido, se possível cromossomas. </li><li> No outro lado da linha parental, montar os transgenes de um local DRF e UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (o outro transgene combinada de rCD2 :: RFP e o supressor que inibe a expressão de mCD8 :: GFP) no mesmo braço do 2º ou 3º cromossómicas (pares apropriados de transgenes de FRT </em&gt; e UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi são indicados na Tabela 1). Coloque HS-FLP ou tecido-específicos de FLP em diferentes do cromossoma do local DRF escolhido, se possível cromossomas. </li></ol></li></ol> 2. Cruz tsMARCM pronto voa para gerar tsMARCM Clones na sua descendência <ol><li> Moscas Cruz tsMARCM-prontos juntos (por exemplo, colocar 10-15 moscas macho do passo 1.1.1 ou 1.2.1 e 20-30 fêmea virgem voa a partir do passo 1.1.2 ou 1.2.2 juntos) num frasco de fly-food com fresco pasta de levedura-made na parede do frasco. </li><li> Manter as moscas tsMARCM-prontos cruzadas a 25 ° C durante 2 dias para aumentar a probabilidade de acoplamento, antes de recolher ovos fertilizados. </li><li> transferir frequentes as moscas tsMARCM-prontos cruzados em frascos recém-Yeasted para evitar aglomeração (toque para baixo as moscas ou usar o dióxido de carbono para anestesiar as moscas para facilitar a transferência, manter não mais do que 80-100 ovos fertilizados em 10 mL fly-food vial para evitar demasiadas larvas eclodidas). </li><li> Culturas os animais tsMARCM (isto é, ovos fertilizados; um exemplo do genótipo de animais tsMARCM, como utilizados na Figura 3, é Hs-FLP [22], W / W; UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT 40A , GAL4-GH146 / UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT 40A; +; +) que foram colocados em frascos transferidos em série a 25 ° C até que elas se desenvolvem para a fase desejada (por exemplo, embriões, larvas, ou pupas). </li><li> Colocar os tubos transferidos que contêm animais tsMARCM no mesmo estágio de desenvolvimento para uma temperatura de 37 ° de banho C água para 10, 20, 30, 40, e 50 minutos para determinar o tempo óptimo de choque térmico que induz a expressão de FLP para gerar o clones tsMARCM de interesse. Pule esta etapa se FLP tecido especificidade está sendo usado no experimento tsMARCM (é preferível hs-FLP para a linhagem neural analisa; as razões para esta preferência foram previamente descritos 15). NOTA: Repita o passo 2,5 utilizando o tempo ideal de choque térmico em futuras experiências tsMARCM se mais clones tsMARCM de interesse são procurados; Geralmente, mais de expressão de FLP é induzida em HS-FLP [22] em comparação com HS-FLP [1] com o mesmo tempo de choque de calor. </li><li> Cultura dos animais chocados ao calor tsMARCM a 25 ° C até que tenham atingido o estágio de desenvolvimento apropriado e, em seguida, vá para a etapa 3. </li></ol> 3. Prepare-se, Stain, e cérebros Mount Fly Contendo tsMARCM Clones <ol><li> Preparar pratos forceps de proteção. Misture parte A (30 g) e a parte B (3 g) do Kit de Elastómero de Silicone com carvão activado (0,25 g). Despeje a mistura em pratos adequados. </li><li> Dissecar larvas, pupas, ou cérebros adultos fora dos animais tsMARCM em 1X solução salina tamponada com fosfato (PBS) utilizando uma pinça sobre um prato de pinças-protecção visto através de um microscópio de dissecção. NOTA: Um protocolo para dissecção mosca cérebro tem sido descRiBED anteriormente 16. </li><li> Fixar os cérebros voar em uma placa de ponto de vidro com 1x de PBS contendo 4% de formaldeído à temperatura ambiente durante 20 min. Processar os cérebros voar neste placa de ponto de vidro para o restante das etapas. </li><li> Lavar os cérebros mosca três vezes com 1% de PBT (1x PBS contendo 1% de Triton X-100) e lava-se três vezes durante 30 minutos cada um em 1% de PBT (enxaguar: remover PBT e adicionar novo PBT rapidamente; lavar: remover PBT, adicionar novos PBT, e incubar os cérebros da mosca no novo PBT utilizando um agitador orbital). </li><li> Incubar os cérebros voar com a mistura de anticorpos primários durante a noite a 4 ° C ou durante 4 h à temperatura ambiente. Um exemplo da mistura dos anticorpos primários é o anticorpo de rato anti-CD8 (1: 100), anticorpo de coelho anti-DsRed (1: 800), e o anti-anticorpo de ratinho Bruchpilot (Brp) (01:50) em 1% de PBT contendo soro de cabra normal a 5% (NGS). </li><li> Lavar os cérebros mosca três vezes com 1% de PBT e, em seguida lavar três vezes durante 30 minutos cada um com 1% de PBT. </li><li&gt; Incubar os cérebros voar com a mistura de anticorpos secundários durante a noite a 4 ° C ou durante 4 h à temperatura ambiente. Um exemplo da mistura de anticorpos secundários é o anticorpo IgG de cabra anti-rato conjugado com corante fluorescente verde (1: 800), anticorpo anti-IgG de coelho de cabra conjugado com corante amarelo-fluorescentes (1: 800), e de cabra anti-ratinho anticorpos IgG conjugado com corante vermelho-distante-fluorescente (1: 800) em PBT 1% contendo 5% de NGS. </li><li> Lavar os cérebros mosca três vezes com 1% de PBT e, em seguida lavar três vezes durante 30 minutos cada um com 1% de PBT. Montá-los em um micro de slides com um reagente anti-têmpera. Coloque uma tampa de vidro micro no micro slide para cobrir e proteger o cérebro da mosca. Selar as bordas da lâmina de vidro tampa e micro micro usando unha polonês claro. Armazená-los montados e selados voar espécimes cerebrais a 4 ° C. </li></ol> 4. Tome-se, processar e analisar imagens fluorescentes de tsMARCM Clones <ol><li> Capturar imagens fluorescentes de tsMARCM clones from as amostras criada no passo 3.8 utilizando o sistema de microscopia confocal de escolha. </li><li> Pilhas projeto de tsMARCM imagens fluorescentes confocal em bidimensional, achatada imagens usando o software de processamento de imagem fornecido com o sistema de microscopia confocal de escolha (ver Figura 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O e 3T - 3T para exemplos de achatada imagens fluorescentes confocal). </li><li> Contar o número de células dos lados multicelular-NB dos clones tsMARCM utilizando um software de processamento de imagem apropriado (por exemplo, a função &quot;celular counter&quot; no ImageJ 17; ver Figura 3E, 3J, 3O, e 3T para exemplos da célula corpos de neurônios). </li></ol>

<ol><li>Ito, M., Masuda, N., Shinomiya, K., Endo, K., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+neural+projections+reveals+clonal+composition+of+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of neural projections reveals clonal composition of the Drosophila brain.</a> Curr Biol. 23 (8), 644-655 (2013).</li>
<li>Yu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+development+and+organization+of+the+adult+Drosophila+central+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal development and organization of the adult Drosophila central brain.</a> Curr Biol. 23 (8), 633-643 (2013).</li>
<li>Goodman, C. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodman%2C+CS+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1993).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies%3A+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).</li>
<li>Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+requirement+of+the+USP%2FEcR-B+ecdysone+receptor+for+mushroom+body+neuronal+remodeling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila.</a> Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).</li>
<li>Chiang, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+brain-wide+wiring+networks+in+Drosophila+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution.</a> Curr Biol. 21 (1), 1-11 (2011).</li>
<li>Jefferis, G. S., Marin, E. C., Stocker, R. F., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+neuron+prespecification+in+the+olfactory+map+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Target neuron prespecification in the olfactory map of Drosophila.</a> Nature. 414 (6860), 204-208 (2001).</li>
<li>Hong, W., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+wiring+specificity+in+the+fly+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system.</a> Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+of+the+Drosophila+Chinmo+BTB-zinc+finger+protein+govern+neuronal+temporal+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gradients of the Drosophila Chinmo BTB-zinc finger protein govern neuronal temporal identity.</a> Cell. 127 (2), 409-422 (2006).</li>
<li>Yu, H. H., Chen, C. H., Shi, L., Huang, Y., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twin-spot+MARCM+to+reveal+the+developmental+origin+and+identity+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Twin-spot MARCM to reveal the developmental origin and identity of neurons.</a> Nat Neurosci. 12 (7), 947-953 (2009).</li>
<li>Yu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+developmental+sequence+of+a+Drosophila+neuronal+lineage+as+revealed+by+twin-spot+MARCM%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A complete developmental sequence of a Drosophila neuronal lineage as revealed by twin-spot MARCM.</a> PLoS Biol. 8 (8), (2010).</li>
<li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreenspan%2C+RJ+%22Fly+pushing+%3A+the+theory+and+practice+of+Drosophila+genetics%22">Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).</li>
<li>Awasaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+Drosophila+lineage-restricted+drivers+via+patterned+recombination+in+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Making Drosophila lineage-restricted drivers via patterned recombination in neuroblasts.</a> Nat Neurosci. 17 (4), 631-637 (2014).</li>
<li>Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+mosaics+for+lineage+analysis+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Generating mosaics for lineage analysis in flies.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (1), 69-81 (2014).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Lin, S., Kao, C. F., Yu, H. H., Huang, Y., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+analysis+of+Drosophila+lateral+antennal+lobe+neurons+reveals+notch-dependent+binary+temporal+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Lineage analysis of Drosophila lateral antennal lobe neurons reveals notch-dependent binary temporal fate decisions.</a> PLoS Biol. 10 (11), e1001425(2012).</li>
<li>Zhan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Dscam+diversity+in+regulating+axon+guidance+in+Drosophila+mushroom+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Analysis of Dscam diversity in regulating axon guidance in Drosophila mushroom bodies.</a> Neuron. 43 (5), 673-686 (2004).</li>
<li>Griffin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+twin+spot+generator+for+differential+Drosophila+lineage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The twin spot generator for differential Drosophila lineage analysis.</a> Nat Methods. 6 (8), 600-602 (2009).</li>
<li>Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Q+system%3A+a+repressible+binary+system+for+transgene+expression%2C+lineage+tracing%2C+and+mosaic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis.</a> Cell. 141 (3), 536-548 (2010).</li>
<li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li>
<li>Kao, C. F., Yu, H. H., He, Y., Kao, J. C., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+deployment+of+factors+regulating+temporal+fate+in+a+diverse+neuronal+lineage+of+the+Drosophila+central+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hierarchical deployment of factors regulating temporal fate in a diverse neuronal lineage of the Drosophila central brain.</a> Neuron. 73 (4), 677-684 (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Passos críticos dentro do Protocolo Passos 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5, e 3.2 são críticos para a obtenção de bons resultados tsMARCM. Condutores -GAL4 específicos de tecidos que não expressam GAL4 em progenitores neurais são preferidos para os passos 1.1.1 e 1.2.1. Evitar o excesso de aglomeração dos animais cultivadas em frascos fly-alimentares no passo 2.3. Porque a latência de indução, o nível de expressão de FLP após a choque térmico, e o tempo médio de divisão de progenitores neuronai...

O cérebro, composta por um vasto número e diversos tipos de neurônios, dota animais com a capacidade de perceber, processar e responder aos desafios do mundo externo. Os neurónios do adulto de Drosophila cérebro central são derivados a partir de um número limitado de células estaminais neurais, chamados neuroblastos (RN), durante o desenvolvimento 1, 2. A maioria dos RN participando de neurogênese cerebral em Drosophila sofrem divisão assimétrica para gerar RN auto-renovação e células-mãe gânglio (GMCS), e os GMCs seguida, passar por outra rodada de divisão para produzir duas células-filhas que se diferenciam em neurónios 3 (Figura 1A ). Devido à complexidade da morfologia neuronal e os desafios associados com a identificação de neurônios específicos, uma tecnologia positiva rotulagem mosaico, análise de mosaico com um marcador de células reprimível (marcm), foi inventada para permitir que o visualizatião de um único neurónio, ou um pequeno subconjunto de neurónios para fora da população de neurónios não marcados circundantes, 4. Marcm utiliza o sistema / alvo de reconhecimento da FLP (FRT) para mediar a recombinação específica do local entre os cromossomas homólogos dentro de uma célula precursora divisória transportando um alelo heterozigoto de um gene repressor, cuja expressão normalmente inibe a expressão de um gene repórter 4 flipase (FLP). Após a divisão mitótica, os cromossomas recombinantes são segregadas em células individuais, de modo a que uma célula contenha alelos homozigóticos do gene repressor e a outra célula não tem gene do repressor de expressão do repórter em que a célula (e seus descendentes) não é mais bloqueadas 4. Três padrões clonais são normalmente encontrados em um experimento marcm quando FLP é estocasticamente induzida em RNs ou GMCs: clones de uma única célula e dois de células-GMC, que retratam a morfologia neuronal na Resolução de uma única célulan, e multi-celular-NB clones, que revelam padrões morfológicos inteiras de neurônios derivados de um NB comum (Figura 1B). A técnica marcm tem sido amplamente aplicado em estudos neurobiológicos Drosophila, inclusive na identificação do tipo neuronal para reconstruir redes de fiação em todo o cérebro, a linhagem neural análises para revelar a história do desenvolvimento dos neurônios, caracterização fenotípica das funções dos genes envolvidos na especificação do destino celular e morfogênese neuronal e diferenciação estuda 5, 6, 7, 8, 9, 10. Porque marcm convencional única de etiquetas uma das duas células filhas (e linhagens) após o evento mitótico recombinação induzida, informações potencialmente úteis a partir do lado não marcado está perdido. Esta limitação se opõe à aplicação do M básicaSistema ARCM a de alta resolução análises de muitas linhagens neuronais que mudar destinos celulares em tempo rápido ou precisão análises de funções de genes em neurônios idênticas de diferentes animais 11, 12. Cama local marcm (tsMARCM) é um sistema avançado que rotula neurónios derivados a partir de um antepassado comum com duas cores distintas, o que permite a recuperação de informação útil a partir de ambos os lados das células individuais, superando assim a limitação do sistema marcm inicial 11 ( Figura 2A - 2C). No sistema tsMARCM, dois interferência de RNA (RNAi) -based eliminadores estão situados em locais de trans-cromossomas homólogos dentro de uma célula precursora, e a expressão dessas supressores independentemente inibir a expressão dos respectivos repórteres (Figura 2B). Na sequência específica do local recombinações mitóticas mediada através do sistema FLP / FRT, a twsupressores S baseado em RNAi ser segregados em células individuais para permitir a expressão dos repórteres distintos (Figura 2B). Dois padrões clonais, de uma única célula associada a clones de uma única célula e de duas células-GMC associados com clones multi-celular-NB, são tipicamente vistos em um experimento tsMARCM (Figura 2C). Informação derivada a partir de um lado das células individuais podem ser utilizados como a referência para o outro lado, permitindo-alta resolução analisa linhagem neural, tais como-datado de nascimento os neurónios marcados, e analisa fenotípica de neurónios idênticas em diferentes animais para a investigação exacta da função do gene neural 11, 12. Aqui, nós apresentamos um protocolo passo-a-passo que descreve como realizar uma experiência tsMARCM, que pode ser utilizado por outros laboratórios para alargar os seus estudos de desenvolvimento neural (bem como o desenvolvimento de outros tecidos, se aplicável) em Drosophila.

<table><tbody><tr><td>Dióxido de carbono (CO2)</td><td>Fornecedor local</td><td>n.a.Anestesiar</td> <td>moscas</td></tr><tr><td>CO2 almofada</td><td>Fornecedor local</td><td>n.a.Classificar</td><td>, cruzar e transferir</td></tr><tr><td>moscas 10x PBS pH 7.4</td><td>Uniregion Bio-Tech (ou outros fornecedores)</td><td>PBS001</td><td>Dissecar, enxaguar, lavar e imunocorar cérebros de moscas</td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>Corrigir cérebros de moscas</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Enxágue, lave e imunomarque cérebros de moscas</td></tr><tr><td>Cabra normal</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>005-000-121</td><td>Imunocoloração de cérebros de moscas soro</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rato anti-rato anticorpo CD8</td><td>Invitrogen</td><td>MCD0800</td><td>Imunocoloração de cérebros de moscas</td></tr><tr><td>Coelho anti-DsAnticorpo vermelho</td><td>Clonetech</td><td>632496</td><td>Imunocoloração de cérebros de moscas</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Brp de camundongo</td><td>Estudos de desenvolvimento Banco de hibridoma</td><td>nc82</td><td>Imunocoloração de cérebros de moscas</td></tr><tr><td>Anticorpo IgG anti-rato de cabra conjugado com Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>Cérebros de moscas imunocorantes</td></tr><tr><td>Anticorpo IgG anti-coelho de cabra conjugado com Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td>Cérebros de moscas imunocorantes</td></tr><tr><td>Anticorpo IgG anti-rato de cabra conjugado com Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td>Cérebros de moscas imunocorantes</td></tr><tr><td>Reagente antidesbotamento de ouro SlowFade</td><td>Sondas moleculares</td><td>S36936</td><td>Monte cérebros de moscas e proteja a extinção de fluorescência</td></tr><tr><td>Placa de vidro de depressão PYREX 9</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td>Dissecar, enxaguar, lavar e imunomanchar cérebros de moscas</td></tr><tr><td>Kit de elastômero de silicone Sylgard 184</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Faça pratos Sylgard pretos para proteger o fórceps durante a dissecção cerebral</td></tr><tr><td>Carvão ativado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242276-250G</td><td>Faça pratos Sylgard pretos</td></tr><tr><td>Dumont #5 fórceps</td><td>Fine Science Ferramentas</td><td>11252-30</td><td>Dissecar e montar cérebros de moscas</td></tr><tr><td>Micro slide</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td>Montar cérebros de mosca</td></tr><tr><td>Micro vidro de cobertura nº 1.5</td><td>VWR International</td><td>48366-205</td><td>Montar cérebros de mosca</td></tr><tr><td>Esmalte de unhas</td><td>Fornecedor local</td><td>não disponível</td><td>Selar micro vidro de cobertura em micro lâminas</td></tr><tr><td>Incubadora&nbsp;</td>A cultura <td>LTI603</td> da <td>Kansin Instruments</td><td>voa a 25 &deg; C</td></tr><tr><td>(ou outros fornecedores)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Banho-maria</td><td>Kansin Instruments</td><td>WB212-B2</td><td>Induz choque térmico em moscas a 37 &graus; C</td></tr><tr><td>(ou outros fornecedores)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>Kansin Instruments</td><td>OS701</td><td>Lavagem e imunocoloração de cérebros de moscas</td></tr><tr><td>(ou outros fornecedores)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Leica</td><td>EZ4</td><td>Classificar, cruzar e transferir moscas; Dissecar, enxaguar, lavar e imunocolorir cérebros de moscas</td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Zeiss (ou outros fornecedores)</td><td>LSM 700 (ou outros modelos)</td><td>Imagem tsMARCM clones</td></tr><tr><td>software de processamento de imagem 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>não disponível</td><td>Pilhas de projetos de imagens confocais</td></tr><tr><td>Software de processamento de imagem 2 (e.g., ImageJ)&nbsp;</td><td>não disponível</td><td>não disponível</td><td>Contar o número de células de clones tsMARCM</td></tr></tbody></table>

análises celular linhagem e estudos da função de genes utilizando marcm twin-ponto

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

M osaic uma nálise com um r epressible c ell m arker (marcm) é um sistema de rotulagem mosaico positivo que tem sido amplamente aplicado em estudos neurobiológicos Drosophila para descrever morfologias intrincadas e de manipular a função de genes em subconjuntos de neurônios dentro de outra forma não marcado e imperturbável organismos. mosaicos genéticos gerados no sistema marcm são mediadas através de recombinação específica do local entre os cromossomas homólogos dentro de divisão de células precursoras para produzir ambos os clones (marcm) marcados e não marcados células filhas durante a mitose. Uma extensão do método marcm, chamado duplo-spot marcm (tsMARCM), etiquetas, tanto das células individuais derivadas de um antepassado comum com duas cores distintas. Esta técnica foi desenvolvida para permitir a recuperação da informação útil a partir de ambos os hemi-linhagens. Por abrangente análise de diferentes pares de clones tsMARCM, o sistema permite tsMARCM de alta resolução mappin linhagem neuralg para revelar o nascimento-ordem exacta dos neurónios marcados produzidos a partir de células progenitoras comuns. Além disso, o sistema também se estende tsMARCM estudos de função do gene, permitindo a análise fenotípica de neurónios idênticas de diferentes animais. Aqui, descrevemos como aplicar o sistema tsMARCM para facilitar estudos sobre o desenvolvimento neural em Drosophila.

O sistema tsMARCM tem sido usado para facilitar a linhagem neural análises e estudos da função gênica por recuperar informações importantes sobre os neurônios derivados do RN comuns. O sistema tem sido utilizado para identificar a maioria (se não todos) os tipos neuronais, determinar o número de células de cada tipo neuronal, e determinar a ordem de nascimento desses neurônios 11, 12, 18 (ver a ...

Aqui, nós apresentamos um protocolo para uma técnica de marcação de mosaico que permite a visualização dos neurónios derivados de uma célula progenitora comum em duas cores distintas. Isso facilita a análise de linhagem neural com a capacidade de neurônios individuais-datando de nascimento e função do gene estudar nos mesmos neurônios de diferentes indivíduos.

Análises celular linhagem e estudos da função de genes utilizando marcm Twin-ponto

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

O objetivo geral deste protocolo MARCM de dois pontos é realizar análises de linhagem celular de alta resolução e aprimorar estudos sobre a função gênica. O tecido cerebral é composto por um grande número de neurônios diversos, o que torna desafiador estudar o mecanismo subjacente ao modo como os neurônios se organizam durante o desenvolvimento. A principal vantagem desta técnica é rotular neurônios derivados de progenitores neuronais comuns com duas cores distintas.Que permitem recuperar o surgimento da informação de neurônios individuais. Portanto, esta técnica pode ajudar os pesquisadores a explorar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao desenvolvimento neural. Demonstrando o procedimento hoje será Pei-Chi Chung.Um técnico do laboratório da Professora Yu. Comece combinando machos e fêmeas prontos para o MARCM de duplo marcador em um frasco com alimento para moscas contendo fermento fresco no frasco. Mantenha as moscas cruzadas prontas para o MARCM de duplo marcador a 25 graus Celsius por dois dias para aumentar a probabilidade de acasalamento antes de coletar os ovos fertilizados.Para evitar o excesso de lotação quando as larvas eclodem, bata levemente os tubos com

cell-lineage-analyses-and-gene-function-studies-using-twin-spot-marcm

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Uma busca fundamentais em biologia celular é definir os mecanismos subjacentes à identidade dos organelos que tornam as células eucarióticas. Aqui é proposto um método para identificar os genes responsáveis ​​pela integridade morfológica e funcional de organelas vegetais utilizando microscopia de fluorescência e as ferramentas a próxima geração de sequenciação.

Microscopia de fluorescência de Triagem e seqüenciamento da próxima geração: Ferramentas úteis para a identificação de genes envolvidos na integridade das Organelas

Galaxy e David surgiram como ferramentas populares que permitem que os investigadores sem formação bioinformática para analisar e interpretar dados de RNA-Seq. Descreve-se um protocolo para C. elegans investigadores para executar ARN-Seq experiências, o acesso e processar o conjunto de dados usando Galaxy e obter informação biológica significativa a partir das listas de genes utilizando DAVID.

Análise transcriptomic de<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA Sequenciação de dados através da Suíte Tuxedo no Projeto Galaxy

Granel gene expressão medições nuvem célula individual diferenças nas populações de células heterogêneas. Aqui, descrevemos um protocolo para análise de expressão do gene como unicelular e índice classificação por Florescence ativado celular classificação (FACS) pode ser combinado para delinear a heterogeneidade e immunophenotypically caracterizam populações de células molecularmente distinta.

Uma combinatória célula única abordagem para caracterizar o Molecular e imunofenotípica heterogeneidade de tronco humano e populações de Progenitor

Um protocolo para realizar o rastreamento de linhagem e a análise genética funcional dos genes candidatos em um único nível celular usando a análise de mosaico com marcadores duplos (MADM). A análise clonal madm fornece uma estrutura quantitativa para medir o comportamento proliferativo, a saída celular e a relação de linhagem de progenitores individuais e suas células filhas.

Rastreamento de linhagem e análise clonal no desenvolvimento de córtex cerebral usando análise de mosaico com marcadores duplos (MADM)

Aqui, os autores apresentam a utilidade de MULTI-seq para fenotipagem e posterior emparelhamento scRNA-seq e scATAC-seq na caracterização dos perfis de acessibilidade transcriptômica e cromatina na retina.

Análise multiplexada da expressão genética da retina e acessibilidade da Chromatina usando scRNA-Seq e scATAC-Seq

CUT&amp;RUN e suas variantes podem ser usadas para determinar a ocupação de proteínas na cromatina. Este protocolo descreve como determinar a localização da proteína na cromatina usando uliCUT&amp;RUN unicelular.

Localização de fator unicelular em Chromatina usando decote de entrada ultra-baixa sob alvos e liberação usando nuclease

A expressão gênica é regulada por interações de promotores gênicos com elementos regulatórios distais. Aqui, descrevemos como a baixa entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite a identificação dessas interações em tipos celulares raros, que antes eram imensuráveis.

Um fluxo de trabalho integrado para estudar a arquitetura do genoma espaço-temporal centrada no promotor em populações celulares escassas

Desenvolvemos uma abordagem oncogenômica comparativa entre espécies utilizando análises genômicas e telas genômicas funcionais para identificar e comparar alvos terapêuticos em tumores surgidos em modelos de camundongos geneticamente modificados e o tipo de tumor humano correspondente.

Perfil Genético e Triagem de Abandono em Escala Genômica para Identificar Alvos Terapêuticos em Modelos Murinos de Tumor Maligno de Bainha de Nervo Periférico

A análise precisa de dados de microscopia multidimensional requer fluxos de trabalho complexos. Este artigo demonstra como usar o software Cell-ACDC. Ele aproveita modelos orientados por IA de última geração para segmentação, rastreamento, análise de linhagem celular e quantificação de dados de microscopia. Crucialmente, complementa esses modelos com uma estrutura inovadora para correção semiautomatizada da saída dos modelos.

Análise de dados de microscopia multidimensional usando Cell-ACDC

Este estudo apresenta um protocolo multioma espacial Trekker–CUT&amp;Tag que combina codificação de barras espacial direta de uma seção de tecido com análise multioma de célula única. Essa abordagem permite o perfilamento espacialmente resolvido de uma única célula da expressão gênica e a modificação da histona H3K27ac simultaneamente, oferecendo insights mecanicistas sobre a regulação gênica no contexto da microanatomia tecidual.

Perfilamento Multiômico Integrado de Célula Única Espacialmente Resolvido do Transcriptoma e Alvos Epigenômicos em Seções de Tecido Congelado

Aprenda análises de linhagem celular e estudos de função gênica em neurônios utilizando o protocolo twin-spot MARCM. Esta técnica de alta resolução permite rastrear o desenvolvimento neural com marcadores distintos.

Análises celular linhagem e estudos da função de genes utilizando marcm Twin-ponto

Explorar mais vídeos