Análises celular linhagem e estudos da função de genes utilizando marcm Twin-ponto
2 de março de 2017
Aqui, nós apresentamos um protocolo para uma técnica de marcação de mosaico que permite a visualização dos neurónios derivados de uma célula progenitora comum em duas cores distintas. Isso facilita a análise de linhagem neural com a capacidade de neurônios individuais-datando de nascimento e função do gene estudar nos mesmos neurônios de diferentes indivíduos.
O objetivo geral deste protocolo MARCM de ponto duplo é realizar análises de linhagem celular de alta resolução e melhores estudos de função gênica. O tecido cerebral é composto por um grande número de neurônios diversos, é um desafio estudar o mecanismo subjacente a como os neurônios se reúnem durante o desenvolvimento. A principal vantagem dessa técnica é rotular neurônios derivados de progenitores de neurônios comuns em duas cores distintas.
Que permitem a recuperação do nascimento da informação de neurônios individuais. Portanto, essa técnica pode ajudar os pesquisadores a explorar o mecanismo celular e molecular subjacente ao desenvolvimento neural. Demonstrando o procedimento hoje estará Pei-Chi Chung.
Um técnico do laboratório do Professor Yu. Comece combinando machos e fêmeas prontos para MARCM em um frasco de alimento para moscas com fermento fresco no frasco. Mantenha as moscas prontas MARCM de ponto duplo cruzado a 25 graus Celsius por dois dias para aumentar a chance de acasalamento antes de coletar os ovos fertilizados.
Para evitar a superlotação quando as larvas eclodirem, bata nas moscas prontas MARCM de ponto duplo cruzadas e transfira para frascos recém-fermentados. Cultive a prole MARCM de ponto gêmeo, até que atinja o estágio desejado de desenvolvimento. Aqui, as moscas no estágio larval serão eletrocutadas pelo calor para induzir a expressão de flippase.
Transfira os frascos para moscas para um banho-maria a 37 graus Celsius por 10, 20, 30, 40 e 50 minutos para determinar o choque térmico ideal para a expressão de flippase. Para gerar os clones MARCM de ponto duplo de interesse. O momento do choque térmico determina o estágio de geração de limpeza, enquanto o período de choque térmico define quantas clareiras serão geradas.
Cultive os animais MARCM de ponto duplo chocados pelo calor a 25 graus Celsius, até o estágio de desenvolvimento desejado. Em seguida, prossiga para a coloração e montagem. Adicione PBS aos pratos de proteção da pinça.
E então, transfira os animais MARCM de ponto duplo para os pratos. Enquanto olha através de um microscópio de dissecação, use uma pinça para dissecar os cérebros dos animais MARCM de ponto duplo. Primeiro, remova a cabeça do corpo da mosca.
Em seguida, remova suavemente a cutícula sem danificar o cérebro. Em seguida, remova cuidadosamente as traqueias que aparecem como fibras de cor branca. Transfira os cérebros para uma placa de vidro, contendo 4% de formaldeído e PBS.
E fixe em temperatura ambiente por 20 minutos. Comece o procedimento de coloração enxaguando os cérebros das moscas três vezes com 1% de PBT. E depois lavando com 1% PBT três vezes.
Com agitação por 30 minutos de cada vez. Incube os cérebros das moscas com uma mistura de anticorpos primários durante a noite a quatro graus Celsius ou por quatro horas em temperatura ambiente. Enxágue e lave os cérebros das moscas três vezes cada com 1% PBT, agitando como antes.
Em seguida, incube os cérebros das moscas com uma mistura de anticorpos secundários por quatro horas em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Depois de enxaguar e lavar os cérebros como antes, monte os cérebros em uma microlâmina com um reagente anti-têmpera. E então coloque uma tampa de vidro para cobrir e proteger os cérebros das moscas.
Sele as bordas da micro lamínula e da microlâmina usando esmalte transparente. Finalmente, capture imagens fluorescentes de clones MARCM de ponto duplo das amostras usando o sistema de microscopia confocal de sua escolha. Esta figura mostra os resultados do clone MARCM de ponto gêmeo, um neurônio de projeção olfativa anterodorsal VL2p derivado da indução de flippase.
Mediar a recombinação mitótica no neuroblasto adPN no estágio embrionário. Este primeiro diagrama mostra o padrão de neurogênese. Nesta imagem de microscópio confocal do cérebro, os adPNs VL2p são mostrados em verde e estão associados a adPNs neuroblastos multicelulares em magenta.
Esta imagem mostra as células no corno lateral. A morfologia neuronal do lobo antenal é vista aqui. Esta imagem mostra os dados de DL1 adPNs.
Como visto aqui, os adPNs DL1 aparecem mais tarde no desenvolvimento do que os adPNs VL2p. A indução de clones MARCM de pontos gêmeos de adPNs DC3 demonstra que esse tipo neuronal aparece mais tarde no desenvolvimento. Esta imagem mostra que o evento MARCM de ponto duplo ocorre em um neurônio GAL4 negativo dentro da linhagem adPN.
Uma vez dominada, essa técnica pode ajudar os pesquisadores a analisar a linhagem neural e fornecer diferentes marcadores para distinguir neurônios de clones de neuroblastos. Além disso, o MARCM de ponto duplo pode produzir clones mutantes homozigotos para explorar o mecanismo molecular. Em um fundo genético heterozigoto.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo MARCM de dois pontos distintos projetado para análises de linhagem celular de alta resolução e estudos de função gênica em neurônios. Ao rotular neurônios provenientes de células progenitoras comuns com duas cores diferentes, os pesquisadores podem acompanhar efetivamente o desenvolvimento e a datação do nascimento de neurônios individuais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia do Desenvolvimento
Contexto
- O tecido cerebral consiste em uma diversa variedade de neurônios.
- Compreender a montagem de neurônios durante o desenvolvimento é complexo.
- As técnicas atuais podem não fornecer resolução suficiente para o rastreamento de linhagem.
- Este protocolo tem como objetivo abordar esses desafios.
Objetivo do Estudo
- Realizar análises detalhadas de linhagem celular.
- Aprimorar estudos sobre a função gênica em neurônios.
- Facilitar a exploração dos mecanismos celulares e moleculares no desenvolvimento neural.
Métodos Utilizados
- Protocolo Twin-spot MARCM para marcação de neurônios.
- Uso de marcadores de cores distintas para rastreamento de linhagem.
- Técnicas de imagem de alta resolução.
- Análise do desenvolvimento neuronal e função gênica.
Resultados Principais
- Marcação bem-sucedida de neurônios provenientes de progenitores comuns.
- Capacidade de recuperar informações sobre o nascimento de neurônios individuais.
- Compreensão aprimorada da linhagem neural e do desenvolvimento.
- Aplicações potenciais no estudo da função gênica em diferentes indivíduos.
Conclusões
- O protocolo twin-spot MARCM é uma ferramenta valiosa para a pesquisa em neurociência.
- Ele permite a análise detalhada da linhagem neuronal e da função gênica.
- Essa técnica pode avançar significativamente nossa compreensão do desenvolvimento neural.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O entendimento da linhagem neural e da função gênica em organismos modelo fornece insights fundamentais para a validação de alvos no desenvolvimento de neuroterapias. A técnica twin-spot MARCM permite o mapeamento de alta resolução da ordem de nascimento neuronal e a análise fenotípica de neurônios geneticamente idênticos entre indivíduos, apoiando a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva ao vincular mecanismos de desenvolvimento a resultados funcionais em sistemas relevantes para doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio do rastreamento da linhagem neuronal a partir de progenitores comuns para avaliar a função gênica em populações celulares definidas.
- Valor Operacional: Facilita a desmistificação biológica por meio da análise fenotípica de clones mutantes homozigotos em contextos heterozigotos, reduzindo a ambiguidade mecanicista.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao fornecer dados quantitativos de linhagem que se correlacionam com mecanismos de doenças neurodesenvolvimentais.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Produz sistemas neuronais validados e codificados por cores, adequados para triagem de compostos em circuitos neurais relevantes para doenças.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade do ensaio por meio da geração clonal induzível e específica de estágio, controlada pela duração do choque térmico.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em múltiplos subtipos neuronais (por exemplo, linhagens de adPN) para triagem fenotípica comparativa.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Apoia a modelagem de sistemas relevantes para doenças ao permitir a análise da ordem de nascimento de neurônios implicados em transtornos neurodesenvolvimentais.
- Redução Mecanística de Riscos: Permite a análise fenotípica de neurônios idênticos entre animais para distinguir a variabilidade genética da estocástica em estudos de função gênica.
- Continuidade Pré-clínica: Conecta descoberta e validação ao fornecer dados com resolução de linhagem para estudos de engajamento de alvos e modulação de vias.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método twin-spot MARCM integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação inicial de alvos até estudos mecanicistas pré-clínicos, especialmente para indicações neurodesenvolvimentais nas quais a origem e a conectividade neuronais são fundamentais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao associar perturbação gênica a fenótipos neuronais específicos de linhagem.
- Triagem: Fornece preparações neuronais prontas para ensaios e reprodutíveis, com resultados quantitativos baseados no momento clonal de nascimento e na expressão de marcadores.
- Análises: Permite análise comparativa da morfologia neuronal e da expressão gênica em diferentes estágios de desenvolvimento, utilizando leituras de dupla cor.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à validação pré-clínica ao fornecer modelos alinhados à linhagem para modulação de alvos alinhados a biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma capacidade reutilizável para gerar coortes neuronais padronizadas em diversos projetos e sistemas modelo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir confundimentos relacionados à linhagem em estudos de função gênica.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e padronização por meio da indução clonal controlada e protocolos padronizados de coloração e montagem.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de avançar/não avançar ao permitir a detecção precoce de efeitos fenotípicos específicos da linhagem, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Apoia o avanço ajustado ao risco ao fornecer clareza mecanicista sobre alvos neuronais em tecidos heterogêneos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em genética de Drosophila, técnicas de marcação clonal e microscopia confocal para interpretação precisa da linhagem.
- Depende de instrumentação, incluindo aparelho de choque térmico, microscópios de dissecação e sistemas de imagem confocal para indução e visualização clonal.
- Necessita padronização entre equipes quanto ao tempo de choque térmico, protocolos de coloração e parâmetros de aquisição de imagens para garantir consistência clonal entre diferentes usuários.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a diferentes linhagens neuronais ou estágios de desenvolvimento além do modelo adPN apresentado.
- Inclui limitações práticas, como a dependência da eficiência clonal em relação à duração do choque térmico e a necessidade de otimização para cada linhagem-alvo, conforme observado no protocolo.
