Medição do T celular aloreactividade usando imagens de Citometria de Fluxo

O objetivo geral deste procedimento é medir a aloreatividade de linfócitos T utilizando citometria de fluxo com imagem. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na imunologia de transplantes, como qual proporção dos linfócitos T de um receptor reage contra aloantígenos do doador. Esta técnica combina o poder multiparamétrico e quantitativo da citometria de fluxo com as capacidades de imagem da microscopia fluorescente, permitindo a análise de alto rendimento das sinapses entre linfócitos T individuais e células apresentadoras de antígenos.

Quem demonstrará o procedimento será Sajad Moshkelgosha, um pós-doutorando do meu laboratório. Comece semeando zero vírgula cinco vezes 10 à sexta células dendríticas em cada poço de uma placa de cultura celular de 96 poços, seguido por um vezes 10 à sexta células T, e um volume final de até 50 microlitros no total de meio de cultura por poço.

Incube as culturas frias por quatro horas a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono. Em seguida, adicione três vezes o volume da cultura de formaldeído a um vírgula cinco por cento em PBS a cada poço durante 30 minutos à temperatura ambiente. Ao final da fixação, transfira as células de cada poço para um tubo de poliestireno correspondente de cinco mililitros.

Incube as células com os anticorpos conjugados ao fluorocromo apropriado em 100 microlitros de tampão de lavagem por 30 minutos à temperatura ambiente, protegidos da luz. Em seguida, lave as células em um mililitro de tampão de lavagem e reconstitua os pellets em tampão de permeabilização/lavagem contendo fitaleína FITC. Após mais 30 minutos à temperatura ambiente, protegidos da luz, lave as células em um mililitro de tampão de permeabilização/lavagem fresco.

Resuspenda os pellets no corante nuclear de interesse em tampão de permeabilização/lavagem e incube por 30 minutos, à temperatura ambiente e protegido da luz. Lave as células com um mililitro de tampão de permeabilização/lavagem, seguido por uma lavagem com tampão de lavagem apenas. Em seguida, ressuspenda as células em 50 a 100 microlitros de tampão de lavagem fresco.

Transfira as células para pequenos tubos cônico com tampa. Para analisar as interações célula a célula, reserve primeiro um canal para a aquisição de imagem em campo claro e carregue o primeiro tubo controle. Com o canal de campo claro desativado, na janela de trabalho, crie um novo gráfico de dispersão para cada canal utilizado com a razão de aspecto sobre a área.

Selecione os singletos em que a proporção de aspecto é próxima a um. Para cada fluorocromo, verifique a população positiva e ajuste a voltagem do laser na caixa de iluminação, conforme necessário. Na caixa de canais, selecione os canais apropriados para os fluorocromos utilizados na coloração.

Em seguida, clique em gravar. Quando o número de eventos atingir o limite especificado, a aquisição será interrompida automaticamente. Após a obtenção de todos os controles de coloração simples, carregue o primeiro tubo da amostra experimental e adquira dezenas de milhares de eventos nos canais de análise apropriados, incluindo o canal de campo claro.

Para gerar uma matriz de compensação, carregue os arquivos de controle de coloração simples no assistente de compensação e selecione os canais fluorescentes apropriados para o experimento. Após confirmar que as populações positivas corretas foram selecionadas, clique duas vezes em um valor na matriz e adicione o gráfico à área de análise para cada canal. Clique em concluir para salvar a matriz de compensação como um arquivo CTM.

Carregue o arquivo RIF no software de análise apropriado. Converta o arquivo RIF em um arquivo DAF para análise de dados. Abra o arquivo da primeira amostra.

Plote a raiz quadrada média da taxa de variação da intensidade da imagem no canal de campo claro. Em seguida, plote a razão de aspecto versus a área para o marcador de célula apresentadora de antígeno. Selecione os dupletos que contêm uma única célula apresentadora de antígeno.

Trace a razão de aspecto versus a área para o marcador de célula T. Selecione os dupletos contendo uma única célula T. Para identificar as células em contato umas com as outras, no menu de análise, utilize a opção de máscaras para abrir o gerenciador de máscaras e nomeie a nova máscara como máscara de objeto de célula T.

Clique no botão de função e, na caixa de diálogo, selecione o objeto. Selecione o canal em que o marcador de linfócito T é detectado e clique em OK. Crie uma máscara para o marcador de célula apresentadora de antígeno no canal apropriado da mesma maneira. Plote a intensidade de fluorescência do marcador de linfócito T na máscara do objeto da célula apresentadora de antígeno contra a intensidade de fluorescência da célula apresentadora de antígeno na máscara do objeto do linfócito T.

Em seguida, desenhe um gate que inclua apenas as células em contato umas com as outras. Por fim, revise manualmente as imagens de FITC de faloidina dos eventos dentro desse gate para distinguir as sinapses imunes maduras dos simples contatos célula a célula, utilizando a função de imagens de marcação para identificar essas imagens. Aqui, o gate de contato da membrana é mostrado para linfócitos T CD4 positivos esplênicos obtidos de receptores tolerizados e não tolerizados de aloenxertos cardíacos B6 sete dias após o transplante e coincubados com células dendríticas derivadas da medula óssea B6, conforme demonstrado.

Com os eventos sinápticos e não sinápticos indicados pelas miras verdes. As análises dos canais brilhante e fluorescente também permitem a visualização dos eventos sinápticos e não sinápticos individuais. De fato, as sinapses de receptores CDA não tolerizados e tolerizados de corações B6 são facilmente distinguíveis dos contatos não sinápticos pela presença de densas cristas positivas para FITC na interface entre a célula T e a célula apresentadora de antígeno.

Após desenvolvimento adicional, esta técnica poderá ser aplicada em ambientes clínicos, como na redução ou suspensão da imunossupressão ou na predição do resultado do enxerto em receptores humanos de transplantes.