Name: Medição do T celular aloreactividade usando imagens de Citometria de Fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprenda a medir alorreatividade de células T usando citometria de fluxo por imagem. Este método de alta vazão permite examinar sinapses imunes individuais entre células T e células apresentadoras de antígenos.

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SCJ foi apoiado por uma Sociedade Internacional de Coração e Pulmão Transplante Research Fellowship e uma Royal College of Physicians e Surgeons of Canada Detweiler Viajando Fellowship.SM foi apoiado em parte por uma Sociedade Internacional de Coração e Pulmão Transplante Award Desenvolvimento de Carreira (para SCJ). SS foi apoiado pelo National Institutes of Health Research Oxford Biomedical Research Centre.JH é o destinatário de uma Kidney Research Fellowship UK Senior não-clínicos. Este trabalho foi financiado pelos seguintes subsídios a AB e KW: um Programa de Confiança Grant Wellcome (082519Z07Z), um coração britânico Foundation Grant Program (PG / 10 / 62,28504) e do Programa da UE Quadro 7 (Um estudo; BioDRIM). Os autores agradecem a Michael Parsons e da Facilidade de Citometria de Fluxo do núcleo do Instituto de Pesquisa Lunenfeld-Tanenbaum, Sistema de Saúde Sinai, Toronto para fornecer acesso a e apoio com o instrumento ImageStream Mark X.

<ol><li>Cravedi, P., Heeger, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+monitoring+in+transplantation+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Immunologic monitoring in transplantation revisited.</a> Curr Opin Organ Transplant. 17 (1), 26-32 (2012).</li>
<li>Pearson, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assessment+of+transplantation+tolerance+induced+by+anti-CD4+monoclonal+antibody+in+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">The assessment of transplantation tolerance induced by anti-CD4 monoclonal antibody in the murine model.</a> Transplantation. 55 (2), 361-367 (1993).</li>
<li>Strober, S., Benike, C., Krishnaswamy, S., Engleman, E. G., Grumet, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+transplantation+tolerance+twelve+years+after+prospective+withdrawal+of+immunosuppressive+drugs%3A+studies+of+chimerism+and+anti-donor+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Clinical transplantation tolerance twelve years after prospective withdrawal of immunosuppressive drugs: studies of chimerism and anti-donor reactivity.</a> Transplantation. 69 (8), 1549-1554 (2000).</li>
<li>Fussell, S. T., Donnellan, M., Cooley, M. A., Farrell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+precursor+frequency+does+not+correlate+with+either+the+incidence+or+severity+of+graft-versus-host+disease+after+matched+unrelated+donor+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte precursor frequency does not correlate with either the incidence or severity of graft-versus-host disease after matched unrelated donor bone marrow transplantation.</a> Transplantation. 57 (5), 673-676 (1994).</li>
<li>Roelen, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+cytotoxic+alloreactivity+under+different+immunosuppressive+regimens+in+clinical+islet+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Relevance of cytotoxic alloreactivity under different immunosuppressive regimens in clinical islet cell transplantation.</a> Clin Exp Immunol. 156 (1), 141-148 (2009).</li>
<li>VanBuskirk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+allograft+acceptance+is+associated+with+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human allograft acceptance is associated with immune regulation.</a> J Clin Invest. 106 (1), 145-155 (2000).</li>
<li>Poggio, E. D., Clemente, M., Hricik, D. E., Heeger, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panel+of+reactive+T+cells+as+a+measurement+of+primed+cellular+alloimmunity+in+kidney+transplant+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Panel of reactive T cells as a measurement of primed cellular alloimmunity in kidney transplant candidates.</a> J Am Soc Nephrol. 17 (2), 564-572 (2006).</li>
<li>Zitzner, J. R., Tambur, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ELISPOT+Assays+in+Risk+Assessment+Pre-+and+Post-Kidney+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Role of ELISPOT Assays in Risk Assessment Pre- and Post-Kidney Transplantation.</a> Cells. 1 (2), 100-110 (2012).</li>
<li>Newell, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+B+cell+signature+associated+with+renal+transplant+tolerance+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans.</a> J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).</li>
<li>Brouard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+peripheral+blood+transcriptional+biomarker+panel+associated+with+operational+renal+allograft+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a peripheral blood transcriptional biomarker panel associated with operational renal allograft tolerance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (39), 15448-15453 (2007).</li>
<li>Sagoo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+cross-platform+biomarker+signature+to+detect+renal+transplant+tolerance+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans.</a> J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).</li>
<li>Halloran, P. F., Famulski, K. S., Reeve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+assessment+of+disease+states+in+kidney+transplant+biopsy+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Molecular assessment of disease states in kidney transplant biopsy samples.</a> Nat Rev Nephrol. 12 (9), 534-548 (2016).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+common+blood+gene+signatures+for+the+diagnosis+of+renal+and+cardiac+acute+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of common blood gene signatures for the diagnosis of renal and cardiac acute allograft rejection.</a> PLoS One. 8 (12), e82153(2013).</li>
<li>Khatri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+rejection+module+%28CRM%29+for+acute+rejection+across+multiple+organs+identifies+novel+therapeutics+for+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A common rejection module (CRM) for acute rejection across multiple organs identifies novel therapeutics for organ transplantation.</a> J Exp Med. 210 (11), 2205-2221 (2013).</li>
<li>Halloran, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+diagnosis+of+antibody-mediated+rejection+in+kidney+transplant+biopsies%3A+an+international+prospective+study+%28INTERCOM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: an international prospective study (INTERCOM).</a> Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).</li>
<li>Mastoridis, S., Issa, F., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+biomarkers+and+functional+assays+to+monitor+cell-therapy-induced+tolerance+in+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Novel biomarkers and functional assays to monitor cell-therapy-induced tolerance in organ transplantation.</a> Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 64-71 (2015).</li>
<li>Miqueu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+peripheral+T-cell+repertoire+in+kidney+transplant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the peripheral T-cell repertoire in kidney transplant patients.</a> Eur J Immunol. 40 (11), 3280-3290 (2010).</li>
<li>Morris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+donor-reactive+T+cells%3A+Evidence+for+clonal+deletion+in+tolerant+kidney+transplant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Tracking donor-reactive T cells: Evidence for clonal deletion in tolerant kidney transplant patients.</a> Sci Transl Med. 7 (272), 272ra210(2015).</li>
<li>Dustin, M. L., Bromley, S. K., Kan, Z., Peterson, D. A., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+receptor+engagement+delivers+a+stop+signal+to+migrating+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Antigen receptor engagement delivers a stop signal to migrating T lymphocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (8), 3909-3913 (1997).</li>
<li>Goldsmith, M. A., Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+signal+transduction+by+the+antigen+receptor+without+commitment+to+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Early signal transduction by the antigen receptor without commitment to T cell activation.</a> Science. 240 (4855), 1029-1031 (1988).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+T+cell-dendritic+cell+interactions+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes.</a> Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).</li>
<li>Juvet, S. C., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+CD4%28%2B%29+T+Cell+Alloreactivity+and+Its+Control+by+Regulatory+T+Cells+Using+Time-Lapse+Microscopy+and+Immune+Synapse+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Quantification of CD4(+) T Cell Alloreactivity and Its Control by Regulatory T Cells Using Time-Lapse Microscopy and Immune Synapse Detection.</a> Am J Transplant. 16 (5), 1394-1407 (2016).</li>
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<li>Burbach, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+regulation+of+integrin-dependent+T+cell+conjugate+formation+and+NF-kappa+B+activation+by+the+adapter+protein+ADAP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Distinct regulation of integrin-dependent T cell conjugate formation and NF-kappa B activation by the adapter protein ADAP.</a> J Immunol. 181 (7), 4840-4851 (2008).</li>
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<li>Moreau, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).</li>
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<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li>
<li>Francis, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+transplantation+tolerance+converts+potential+effector+T+cells+into+graft-protective+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of transplantation tolerance converts potential effector T cells into graft-protective regulatory T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (3), 726-738 (2011).</li>
<li>Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+induction+of+transplantation+tolerance+with+a+nondepleting+anti-Cd4+monoclonal+antibody+and+donor-specific+transfusion+before+transplantation.+A+critical+period+of+time+is+required+for+development+of+immunological+unresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness.</a> Transplantation. 61 (11), 1642-1647 (1996).</li>
<li>Faust, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+T+cell+TGFbeta+signaling+and+IL-17+in+allograft+acceptance+and+fibrosis+associated+with+chronic+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of T cell TGFbeta signaling and IL-17 in allograft acceptance and fibrosis associated with chronic rejection.</a> J Immunol. 183 (11), 7297-7306 (2009).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+CD4+Th17+cells+in+mediating+cardiac+allograft+rejection+and+vasculopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A novel role of CD4 Th17 cells in mediating cardiac allograft rejection and vasculopathy.</a> J Exp Med. 205 (13), 3133-3144 (2008).</li>
<li>Emerson, R. O., Mathew, J. M., Konieczna, I. M., Robins, H. S., Leventhal, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+alloreactive+T+cell+repertoire+using+high-throughput+sequencing+of+mixed+lymphocyte+reaction+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Defining the alloreactive T cell repertoire using high-throughput sequencing of mixed lymphocyte reaction culture.</a> PLoS One. 9 (11), e111943(2014).</li>
<li>Stanford, R. E., Ahmed, S., Hodson, M., Banner, N. R., Rose, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+indirect+allorecognition+in+lung+transplant+recipients+with+obliterative+bronchiolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">A role for indirect allorecognition in lung transplant recipients with obliterative bronchiolitis.</a> Am J Transplant. 3 (6), 736-742 (2003).</li>
<li>Benichou, G., Valujskikh, A., Heeger, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+direct+and+indirect+T+cell+alloreactivity+during+allograft+rejection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contributions of direct and indirect T cell alloreactivity during allograft rejection in mice.</a> J Immunol. 162 (1), 352-358 (1999).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+direct+and+indirect+recognition+pathways+to+T+cell+alloreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of direct and indirect recognition pathways to T cell alloreactivity.</a> J Exp Med. 177 (6), 1643-1650 (1993).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Fluxo de citometria de imagem foi usada para demonstrar a formação de sinapses imunológico entre as células T e APCs monoclonais ou na presença de superantigénios 24, 25, 26, 27, 28. Este método tira vantagem do facto de que depois de um T contacto célula-APC produtiva, a célula T reorganiza seu citoesqueleto de actina, polarizando-a para o local de contacto 21. Este rearranjo não ocorre sem a sinalização de TCR, e é, portanto, uma correlação inicial da activação de células T 19, 20, 21. O método aqui apresentado adapta-se esta abordagem para a medição de alorreactiva frequência de células T nas populações de células T policlonais. Como tal, ele pode, no futuro servir como a base para o desenvolvimento de ensaios para Reagentes doador<html> ty em transplantes clínicos. Embora comparações directas ainda não tiverem sido feitas, a detecção de alorreactivas sinapses imunes parece ter poder preditivo superior do que a MLR convencional. Por exemplo, trabalho anterior demonstrou que, no protocolo de tolercia descrito acima, os resultados de uma MLR falhar para correlacionar de forma fiável com o resultado do enxerto 2. Um certo número de ensaios foram desenvolvidos para o estado operacionalmente tolerante em humanos 9, 10, 11, embora estes não medem a função celular efectora em resposta ao aloantigénio. Em contraste, a IFN? Ensaios ELISPOT função de células T efectoras 8 medida mas não pode captar o espectro completo de secreção de citoquinas que podem ser relevantes para a rejeição de aloenxertos aguda e crónica, tal como IL-17, 38,&gt; 39. O ensaio de diluição limitante 4, que é um trabalho intensivo, e o ensaio in vivo de trans-6, que requer ratos, têm limitações práticas significativas que impedem a sua aplicação em um ambiente clínico. As recentes melhorias na análise de células de proliferação utilizando a análise da sequência de TCR de células T que respondem na MLR pode ser de valor, mas como o ensaio aqui apresentado, irá exigir uma validação adicional em estudos clínicos 18, 40. Maior desenvolvimento do ensaio de detecção sinapse imunológico vai exigir que uma série de questões importantes ser respondida. Em primeiro lugar, o ensaio tal como foi desenvolvido só mede aloreactividade directa. A via directa envolve a apresentação de complexos de MHC / péptido alogénicos em APC derivadas do dador. Os últimos são geralmente eliminados rapidamente após o transplante, e ainda mais aloantigio apresentação é Carried fora por APCs que apresentam receptores doador intacta MHC (via semi-directa) ou antigénios do dador transformados em auto MHC (via indirecta). A via indirecta é um importante factor de rejeição crónica 33, 41. Em princípio, deve ser possível detectar sinapses imunes indiretos com este ensaio, mas indiretamente alorreativas células T têm uma freqüência muito menor do que as diretas 42, 43, o que significa que será necessária a análise de um número maior de eventos. Uma segunda consideração é que temos apenas testado neste ensaio utilizando células T CD4 +, enquanto que as células T CD8 + são também uma componente importante da resposta anti-dador. Mais uma vez, deve ser possível de detectar sinapses CD8 + T cell-APC utilizando este método. Outra limitação é que o método requer a avaliação manual e análise de imagens de células no final, membportão contato Rane, e atualmente estamos trabalhando na automatização desta etapa. Finalmente, o método requer testes e desenvolvimento em seres humanos, e estudos preliminares com amostras humanas estão actualmente a ser realizada. Além disso análise fenotípica subconjunto de células T (isto é, efectora, memória, reguladora, etc.) em combinação com a detecção de sinapses imunes em receptores de transplante representaria uma abordagem poderosa para a caracterização do repertório de células T alorreactivas e vai ser um foco importante para trabalho futuro.

O transplante de órgão sólido transformou o tratamento de doentes com doenças terminais do rim, fígado, coração, e pulmões. Devido às disparidades em maiores e menores de histocompatibilidade, no entanto, aloenxertos são prontamente rejeitados por células T do receptor se imunossupressores não são usados. Estes agentes têm numerosos efeitos adversos, incluindo os riscos de cancro e disfunção de órgãos. Um importante objectivo clínico é, portanto, para diminuir a dose de imunossupressão para o nível mínimo requerido para evitar a rejeição de aloenxertos. Este nível é susceptível de variar, dependendo do grau de activação do sistema imune inato; o grau de doador-receptor aloantigénio incompatibilidade; e as diferenças inter-pacientes em função imune, farmacocinética e farmacodinâmica. Infelizmente, os clínicos de transplante não têm quaisquer ferramentas para avaliar com precisão a reactividade dador em doentes individuais 1. o mistoreacção de leucócitos (MLR) pode detectar reactividade doador, mas falha para prever de forma fiável resultado enxerto 2, 3. Ensaios de diluição limitantes, ELISPOTs de citoquinas, e o ensaio de trans-vivo quer medir um intervalo limitado de respostas ou não são práticos assinaturas 4, 5, 6, 7, 8 os perfis de expressão .Gene revelaram relacionados com a tolerância operacional 9, 10, 11, 12 e rejeição 13, 14, 15, mas estes nem sempre são generalizáveis entre populações 16 e podem em última análise, têm utilidade limitada em pacientes individuais. Analy baseada na sequênciases do receptor de células T (TCR) de células T no sangue periférico 17 ou proliferar na MLR 18 também têm sido desenvolvidos, mas requerem mais a validação. Conceptualmente, seria desejável ter um ensaio que detecta os passos necessários primeiros na activação de células T destinatário por um antigénio do doador. Uma vez que a cultura de células ao longo do dia (como na MLR) pode introduzir produtos manufacturados, um tal teste, idealmente não iria requerer a medição de eventos a jusante, tais como a proliferação ou função efectora. De igual modo, no entanto, também seria desejável para o teste de depender de algum elemento de função de células T, pois as avaliações puramente descritivos (Por exemplo, sequenciação de TCR) pode ser incapaz de distinguir entre as células T anérgicas e funcionais. Numerosos estudos indicam que o contacto prolongado t-APC é necessário para a formação de uma sinapse imune, que é um primeiro aspecto essencialpasso na resposta de células T 19, 20, 21, 22. Recentemente, relatou que, durante a dinâmica em imagiologia lapso de tempo in vitro, de cerca de 5 - 10% de rato células T CD4 + formar contactos de longa duração com células de osso alogénico derivadas de medula dendríticas (BMDCs) 23. A frequência de contacto prolongado foi aumentada em animais que rejeitaram um enxerto, ao passo que em ratinhos previamente tornada tolerante aos mesmos antigénios, manteve-se em níveis observados em ratinhos untransplanted 23. Interacções de longa duração foi reduzida na presença de receptor Tregs e aumento na sua ausência, e observou-se fenómenos semelhantes, utilizando células humanas T e DCs derivadas de monócitos alogénicos (MoDCs) 23. No entanto, a enumeração de contactos prolongados feita dentro de um populatio de células T policlonaln é demorado e trabalhoso. Por isso, fez uso de imagens de citometria de fluxo para examinar a formação de sinapses imunológico alogênico. fluxo de imagem citometria incorpora as de aquisição de dados e análise de capacidades multiparamétricos de citometria de fluxo convencional com as habilidades de imagem de uma única célula de microscopia de fluorescência. Esta técnica foi utilizada por outros investigadores a estudar a formação de sinapses imune pelas células T monoclonais 24, 26, 27 ou na presença de superantigénios 28. Em tais configurações, no entanto, a frequência de células T que respondem varia de 30-100%, enquanto que as células T aloreactivas são geralmente estimado para representar 5-15% do total de repertório de células T 29, 30, 31, 32. Importante, nós mostramos que o fluxo de imagem citometria pode produzir avery medida comparável de alorreactiva frequência de células T 23 e que as alterações na frequência sinapse dentro de uma população de células T policlonais são preditivos de resultado do enxerto 23. Actualmente, esta abordagem tem sido optimizado para medir a aloreactividade directa de células T CD4 +, mas, em princípio, também poderia ser desenvolvido para analisar as células T CD8 + e da via indirecta. Aloreactividade indireta é acreditado para tornar-se cada vez mais relevante em tempos mais longos pós-transplante 33. Estamos actualmente a desenvolver este método a utilização de células humanas, o que permitirá testar em pacientes. Assim, no futuro, a abordagem geral pode ser útil para a avaliação funcional de respostas de células T em receptores de transplante, antes do transplante; imediatamente após o transplante; e, a longo prazo, quando a minimização da droga torna-se um objetivo importante.

<table><tbody><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Várias</td><td>variações</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenotetracético, solução 0,5 M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 detergente não iônico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>A solução de formaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>é 37% de formaldeído e, portanto, deve ser diluída 25 vezes para uma solução de 1,5%</td></tr><tr><td>Filtros de células, 70 &mu; m tamanho dos poros</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Isotiocianato de faloidina-fluoresceína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5282</td><td></td></tr><tr><td>7-aminoactinomicina D</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1310</td><td>Reconstituir em DMSO</td></tr><tr><td>Anti-rato conjugado com aloficocianina CD90.2</td><td>eBioscience</td><td>17-0902</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rato conjugado com azul do Pacífico CD11b</td><td>eBioscience</td><td>48-0112</td><td>Pacific blue foi substituído por eFluor 450</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse CD3</td><td>eBioscience</td><td>13-0032</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse MHC classe II</td><td>eBioscience</td><td>13-5321</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse B220</td><td>eBioscience</td><td>13-0452</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse CD8</td><td>eBioscience</td><td>13-0081</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas anti-biotina CD19 biotinilado</td><td>eBioscience</td><td>13-0193</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas anti-biotina</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>Colunas LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Separador de células magnéticas MidiMACS</td><td>MIltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>mouse recombinante GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>TGF e beta humano recombinante; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>Humano TGF&beta; 1 tem atividade em células de camundongo</td></tr><tr><td>Amnis ImageStream X Mark II</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>Citômetro de fluxo de imagem; detalhes disponíveis em http://www.emdmillipore.com/</td></tr> <tr><td>IDEAS Software</td><td>Amnis/EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>Download gratuito (registro obrigatório): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20</td></tr><tr><td>Meio de cultura de células&nbsp;</td><td>Vários</td><td>Varia</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Vários</td><td>Varia</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células</td><td>Vários</td><td>Varia</td><td></td></tr></tbody></table>

medição do t celular aloreactividade usando imagens de citometria de fluxo

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

A medição da reactividade imunológica a antigénios do dador em receptores de transplante é provável que seja crucial para o sucesso redução ou interrupção do tratamento. A reacção mista de leucócitos (MLR), ensaios de diluição limitante, e o ensaio de trans-vivo hipersensibilidade de tipo retardado (DTH) foram todas aplicadas a esta questão, mas estes métodos têm limitado a capacidade de previsão e / ou limitações práticas significativas que reduzem a sua utilidade. fluxo de imagem citometria é uma técnica que combina os poderes quantitativos multiparamétricos de citometria de fluxo com as capacidades de imagens de microscopia fluorescente. Recentemente, feito uso de uma abordagem por citometria de fluxo de imagem para definir a proporção de células T do receptor, capazes de formar sinapses imunes maduras, com as células apresentadoras de antigénio do doador (APCs). Usando um modelo de transplante de coração de rato bem caracterizada, que demonstraram que a frequência de in vitro sinapses imunes entre o t-APC Membreventos contato ane previu fortemente resultado do enxerto em rejeição, a tolerância, e uma situação onde a sobrevivência do transplante depende de células T reguladoras induzidas. A frequência dos contactos t-APC aumentou com células T de ratinhos, durante a rejeição aguda e diminuíram com as células T de murganhos que não responde prestados ao aloantigénio. A adição de células T reguladoras para o sistema in vitro reduzida prolongados contactos t-APC. Criticamente, este efeito também foi observado com policlonalmente humana expandida, que ocorre naturalmente células T reguladoras, que são conhecidos para controlar a rejeição de tecidos humanos em modelos de ratinho humanizados. Além disso o desenvolvimento desta abordagem pode permitir uma caracterização mais profunda do compartimento de células T alorreactivas do em receptores de transplantes. No futuro, o desenvolvimento e a avaliação deste método utilizando células humanas podem constituir a base de ensaios utilizados para seleccionar pacientes para minimização imunossupressão, e ele pode ser usado para medir o impacto de tolerogénioic terapias na clínica.

Este método foi utilizado para investigar alorreactividade de células T CD4 + em ratinhos tornaram tolerantes a aloantigénios doadores antes de transplante heterotópico de aloenxerto cardíaco. Ratinhos CBA (H-2 k) foi dado um protocolo de tolercia que consiste em um específico do doador (B6, H-2 b) transfusão de sangue combinado com um não-anticorpo que empobrecem células CD4 um mês antes de receber um transplante cardíaco B6. Este protocolo resulta em sobrevivência do aloenxerto de longo prazo que é dependente de células T reguladoras Foxp3 + 36, 37. Sete dias após o transplante, as células T CD4 + esplénicas foram obtidos a partir tornadas tolerantes e destinatários não tornados tolerantes de aloenxertos cardíacos e B6 foram co-incubadas com DC derivadas de medula óssea B6 de acordo com este protocolo. A Figura 2 mostra os dados representativos a partir desta experiência. O portão de contacto membrana é mostrada na Figura 2Uma, com mira verdes colocados sobre um evento sináptica (painel esquerdo, 1) e sobre um evento não-sináptica (painel da direita). A Figura 2B mostra os canais de campo claro e de fluorescência para este evento. Para reduzir a tendência, os dados foram analisados por um observador cego para atribuição do tratamento 23. Como mostrado em vários exemplos na Figura 3, tanto a partir de não tornados tolerantes (Figura 3A-B) e tornados tolerantes (Figura 3C-D) receptores CBA de corações B6, sinapses são facilmente distinguidos dos contactos não-sinápticos pela presença de uma crista de FITC-positivos densa na interface t-APC. Estes resultados mostram que a detecção visual de sinapses imunes realizadas por células T do receptor faixas com o grau de alorreactividade no receptor. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig2.jpg" /> Figura 2. Identificação de t-APC Doublets com MembranaContato e formação de sinapses imunes. Os eventos no portão dupleto final (Figura 1F) são analisados. A. marcador de células T de fluorescência na máscara objecto APC é representada graficamente contra a APC fluorescência do marcador na máscara objecto DC. Alguns eventos doublet ter uma APC e uma célula T sem contato célula-célula e aparecem no canto inferior esquerdo da trama (imagens não mostrados). Um portão de contacto da membrana pode assim ser desenhada que inclui apenas dupletos em que as células T e APCs estão em contacto. As imagens de cada evento neste portão são analisadas quanto à evidência de rearranjo do citoesqueleto de actina no canal de faloidina-FITC e pode ser marcado usando o software de análise. O painel da esquerda indica um evento sinapse imune (identificada como 1 e indicado pela mira verdes), enquanto que o painel direita indica um evento de contacto da membrana, sem a formação de sinapses imune (marcado 2 e indicada por mira verdes). A determinação da formação de sinapses requer análise manual de estesimagens, mostrado em B. B. A linha de cima mostra as imagens de campo claro e de fluorescência de canal para um dupleto com uma sinapse imune (corresponde ao evento 1 em A); a linha inferior mostra um dupleto com contacto membrana mas sem formação de sinapses (corresponde ao caso 2 em A). Os dados foram analisados de forma cega no que diz respeito à atribuição do tratamento e são de uma experiência anteriormente publicada em 23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55283/55283fig3.jpg" /> Figura 3. Exemplos de formação de T-APC sinapse. Ratinhos CBA receberam aloenxertos cardíacos provenientes de dadores B6 após quer sem pré-tratamento (AB) ou após a indução de tolerância com sangue total B6 sob a tampa de um anticorpo anti-CD4 não descartável ( <st<html> rong&gt; CD). Após 7 dias, as células T CD4 + esplénicas foram testados para a formação de sinapses com DCs B6. A. Três exemplos de dupletos não-sinápticas com contacto de membrana a partir de um animal não tornados tolerantes. B. Três exemplos de sinapses imunes a partir de um animal não tornados tolerantes. C. Três exemplos de dupletos não-sinápticas com contacto de membrana a partir de um animal tornados tolerantes. D. Três exemplos de sinapses imunológicas de um animal tornados tolerantes. a formação de sinapses é indicada pela presença de uma crista brilhante, FITC-positivos na interface t-APC (CH03). Os dados foram analisados de forma cega no que diz respeito à atribuição do tratamento e são de uma experiência anteriormente publicada em 23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55283/55283fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> ays &quot;&gt; <tbody><tr><td> Anticorpo / Dye </td><td> fluorocromo </td><td> Canal </td><td> Concentração </td></tr><tr><td> CD11c </td><td> eF450 </td><td> CH02 </td><td> 5 ug / ml, titula empiricamente </td></tr><tr><td> CD90.2 </td><td> APC </td><td> CH06 </td><td> 5 ug / ml, titula empiricamente </td></tr><tr><td> phalloidin </td><td> FITC </td><td> CH03 </td><td> 0,05-0,5 ug / ml </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> - </td><td> cH05 </td><td> 25 ug / mL </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Os anticorpos e corantes utilizados neste estudo. anticorpos fluorocromo-conjugados, corantes, fornecedores, e as concentrações recomendadas são apresentados na tabela. O fluxo de imagiologia citómetro canal que foi utilizado para detectar cada fluorocromo também é mostrado na tabela.

Este artigo descreve um método para medir a aloreactividade numa população mista de células T utilizando citometria de fluxo de imagem.

Medição do T celular aloreactividade usando imagens de Citometria de Fluxo

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

O objetivo geral deste procedimento é medir a aloreatividade de linfócitos T utilizando citometria de fluxo com imagem. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na imunologia de transplantes, como qual proporção dos linfócitos T de um receptor reage contra aloantígenos do doador. Esta técnica combina o poder multiparamétrico e quantitativo da citometria de fluxo com as capacidades de imagem da microscopia fluorescente, permitindo a análise de alto rendimento das sinapses entre linfócitos T individuais e células apresentadoras de antígenos.Quem demonstrará o procedimento será Sajad Moshkelgosha, um pós-doutorando do meu laboratório. Comece semeando zero vírgula cinco vezes 10 à sexta células dendríticas em cada poço de uma placa de cultura celular de 96 poços, seguido por um vezes 10 à sexta células T, e um volume final de até 50 microlitros no total de meio de cultura por poço.Incube as culturas frias por quatro horas a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono. Em seguida, adicione três vezes o volume da cultura de formaldeído a um vírgula cinco por cento em PBS a cada poço durante 30 minutos à temperatura ambiente. Ao final da fixação, transfira as células de cada poço para um tubo de poliestireno correspondente de cinco mililitros.Incube as células com os anticorpos conjugados ao fluorocromo apropriado em 100 microlitros de tampão de lavagem por 30 minutos à temperatura ambiente, protegidos da luz. Em seguida, lave as células em um mililitro de tampão de lavagem e reconstitua os pellets em tampão de permeabilização/lavagem contendo fitaleína FITC. Após mais 30 minutos à temperatura ambiente, protegidos da luz, lave as células em um mililitro de tampão de permeabilização/lavagem fresco.Resuspenda os pellets no corante nuclear de interesse em tampão de permeabilização/lavagem e incube por 30 minutos, à temperatura ambiente e protegido da luz. Lave as células com um mililitro de tampão de permeabilização/lavagem, seguido por uma lavagem com tampão de lavagem apenas. Em seguida, ressuspenda as células em 50 a 100 microlitros de tampão de lavagem fresco.Transfira as células para pequenos tubos cônico com tampa. Para analisar as interações célula a célula, reserve primeiro um canal para a aquisição de imagem em campo claro e carregue o primeiro tubo controle. Com o canal de campo claro desativado, na janela de trabalho, crie um novo gráfico de dispersão para cada canal utilizado com a razão de aspecto sobre a área.Selecione os singletos em que a proporção de aspecto é próxima a um. Para cada fluorocromo, verifique a população positiva e ajuste a voltagem do laser na caixa de iluminação, conforme necessário. Na caixa de canais, selecione os canais apropriados para os fluorocromos utilizados na coloração.Em seguida, clique em gravar. Quando o número de eventos atingir o limite especificado, a aquisição será interrompida automaticamente. Após a obtenção de todos os controles de coloração simples, carregue o primeiro tubo da amostra experimental e adquira dezenas de milhares de eventos nos canais de análise apropriados, incluindo o canal de campo claro.Para gerar uma matriz de compensação, carregue os arquivos de controle de coloração simples no assistente de compensação e selecione os canais fluorescentes apropriados para o experimento. Após confirmar que as populações positivas corretas foram selecionadas, clique duas vezes em um valor na matriz e adicione o gráfico à área de análise para cada canal. Clique em concluir para salvar a matriz de compensação como um arquivo CTM.Carregue o arquivo RIF no software de análise apropriado. Converta o arquivo RIF em um arquivo DAF para análise de dados. Abra o arquivo da primeira amostra.Plote a raiz quadrada média da taxa de variação da intensidade da imagem no canal de campo claro. Em seguida, plote a razão de aspecto versus a área para o marcador de célula apresentadora de antígeno. Selecione os dupletos que contêm uma única célula apresentadora de antígeno.Trace a razão de aspecto versus a área para o marcador de célula T. Selecione os dupletos contendo uma única célula T. Para identificar as células em contato umas com as outras, no menu de análise, utilize a opção de máscaras para abrir o gerenciador de máscaras e nomeie a nova máscara como máscara de objeto de célula T.Clique no botão de função e, na caixa de diálogo, selecione o objeto. Selecione o canal em que o marcador de linfócito T é detectado e clique em OK. Crie uma máscara para o marcador de célula apresentadora de antígeno no canal apropriado da mesma maneira. Plote a intensidade de fluorescência do marcador de linfócito T na máscara do objeto da célula apresentadora de antígeno contra a intensidade de fluorescência da célula apresentadora de antígeno na máscara do objeto do linfócito T.Em seguida, desenhe um gate que inclua apenas as células em contato umas com as outras. Por fim, revise manualmente as imagens de FITC de faloidina dos eventos dentro desse gate para distinguir as sinapses imunes maduras dos simples contatos célula a célula, utilizando a função de imagens de marcação para identificar essas imagens. Aqui, o gate de contato da membrana é mostrado para linfócitos T CD4 positivos esplênicos obtidos de receptores tolerizados e não tolerizados de aloenxertos cardíacos B6 sete dias após o transplante e coincubados com células dendríticas derivadas da medula óssea B6, conforme demonstrado.Com os eventos sinápticos e não sinápticos indicados pelas miras verdes. As análises dos canais brilhante e fluorescente também permitem a visualização dos eventos sinápticos e não sinápticos individuais. De fato, as sinapses de receptores CDA não tolerizados e tolerizados de corações B6 são facilmente distinguíveis dos contatos não sinápticos pela presença de densas cristas positivas para FITC na interface entre a célula T e a célula apresentadora de antígeno.Após desenvolvimento adicional, esta técnica poderá ser aplicada em ambientes clínicos, como na redução ou suspensão da imunossupressão ou na predição do resultado do enxerto em receptores humanos de transplantes.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este artigo descreve uma técnica simples para induzir aloantígenos específicos de anergia em células mononucleares do sangue periférico. A técnica pode ser aplicada clinicamente para gerar células não-alorreativas doador. Infusão dessas células poderia melhorar a reconstituição imunológica e reduzir a toxicidade após o transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas.

Indução de aloantígenos específicos de anergia em células mononucleares do sangue periférico por Estimulação com aloantígenos Co-estimulatórias bloqueio de sinal

Este vídeo demonstra um método para avaliar a aloreatividade em populações mistas de células T, observando interações com células dendríticas portadoras de aloantígenos, levando à formação de sinapses imunológicas. A coloração diferencial e a quantificação de dublês contendo sinapses por citometria de fluxo revelam aloreatividade de células T.

Medindo a aloreatividade em uma população mista de células T

Este vídeo demonstra uma técnica baseada em citometria de fluxo usando dois fluorocromos para identificar células T CD4+ e CD8+, células T γδ, células B, células natural killer (NK) e monócitos em células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs). Ao incubar as células com anticorpos conjugados com fluorocromo contra os marcadores de superfície, os subconjuntos de células são identificados usando uma estratégia ideal de controle citométrico de fluxo.

Um ensaio de citometria de fluxo para identificar subconjuntos de células imunes em células mononucleares do sangue periférico

O vídeo demonstra um método imunológico para monitorar in vivo a produção de linfócitos T citotóxicos induzidos por adjuvantes ou CTL. Um camundongo é pré-injetado com linfócitos T CD8 + de doadores proliferativos corados com corante geneticamente modificado. A injeção subcutânea de ovalbumina com adjuvantes gera linfócitos T CD8+ citotóxicos que são identificados pós-colheita por meio de imunomarcação e citometria de fluxo.

Uma técnica imunológica para monitorar a geração de linfócitos T citotóxicos mediados por adjuvantes

Este protocolo descreve um ensaio de citotoxicidade sensível baseado em células. Ao enumerar a diminuição na frequência de células T CD4+ alvo vivas na presença de um número crescente de células T CD8+ efetoras, este ensaio permite a avaliação direta da atividade citolítica de células T CD8+ específicas do antígeno.

Baseada em células de Citometria de Fluxo Ensaio medir citotóxicos Atividade

Este artigo descreve um método para a geração e propagação de clones de células T humanas que respondem especificamente a um aloantígeno definido. Este protocolo pode ser adaptado para clonagem de células T humanas específicas para uma variedade de ligantes peptídicos-MHC.

Geração de Células T humanas alo-específicos a partir de Sangue Periférico

Descrevemos um protocolo para monitorar a mobilidade radial de células imunes não aderentes in vitro usando um aparelho coletor/slide de sedimentação celular. A migração celular é rastreada em monocamadas de células tumorais ou em proteínas da matriz extracelular. O exame por microscopia de luz e fluorescência permite a observação da mobilidade celular e da funcionalidade citotóxica.

Radial Mobilidade e função citotóxica de Retroviral Replicando Vector transduzidas, Alloresponsive não aderentes Linfócitos T

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Aqui, apresentamos um protocolo de fluxo cytometric para identificar CD4+ e CD8+ T células, as células γδ T, células B, células NK e monócitos no sangue periférico humano usando apenas dois fluorochromes em vez de sete. Com esta abordagem, cinco marcadores adicionais podem ser gravadas na maioria dos citômetros.

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O influxo de cálcio, uma medida da sinalização de células T, é uma maneira eficaz de analisar as respostas à estimulação de receptores de células T. Este protocolo para multiplexação de Indo-1 com painéis de anticorpos direcionados a moléculas de superfície celular aproveita as capacidades altamente flexíveis da citometria de fluxo de espectro completo.

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Análise da atividade de células T humanas em um ambiente de co-cultura alogênica de células tumorais pré-tratadas

Aprenda a medir alorreatividade de células T usando citometria de fluxo por imagem. Este método de alta vazão permite examinar sinapses imunes individuais entre células T e células apresentadoras de antígenos.

Medição do T celular aloreactividade usando imagens de Citometria de Fluxo

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