Name: Isolamento e Enriquecimento de fígado progenitoras Subconjuntos identificado por um marcador combinação de superfícies Novel (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprenda a isolar subconjuntos de células progenitoras hepáticas com alta pureza usando citometria de fluxo e um coquetel inovador de marcadores de superfície. Este método permite análises detalhadas da biologia celular em lesões hepáticas.

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Este trabalho foi apoiado pelo Alexander von Humboldt Foundation Award Sofja Kovalevskaja a VLK.

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Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Inflamação do fígado e lesões de diferentes origens desencadear processos regenerativos no fígado que são acompanhados pela expansão de células progenitoras e ativação 2, 3. Estas células progenitoras do fígado possuem características de células-tronco e provavelmente desempenham um papel importante no mecanismo patológico de várias doenças do fígado. A heterogeneidade das células progenitoras do fígado tem sido sugerida. A reavaliaç...

A regeneração hepática é geralmente associada com a capacidade de auto-renovação de hepatócitos. No entanto, as lesões crónicas do fígado ocorrem com a activação de células progenitoras e de expansão, que têm sido associadas com a sua capacidade de se diferenciar em hepatócitos e cholangiocytes 1, 2, 3, 4. Isto é especialmente relevante porque, durante a lesões crónicas, a proliferação de hepatócitos não é eficaz. Apesar de vários estudos de rastreamento genético visando células progenitoras, o seu papel na regeneração hepática permanece controverso 5, 6, 7, 8. Além disso, a activação de células progenitoras tem sido associada ao aumento da resposta fibrótica no fígado, o que levanta dúvidas sobre a sua função exacta durante 9 lesões, 10. A heterogeneidade do compartimento de células progenitoras tem sido sugerido por estudos de expressão gênica que isolaram células progenitoras expressam um único marcador de superfície usando microdissection ou célula métodos baseados em triagem 1, 11. De fato, recentemente, uma combinação marcador de superfície utilizando gp38 novel (podoplanina) inequivocamente marcadores individuais anteriores de células progenitoras para vários subconjuntos 12. É importante ressaltar que esses subgrupos não só diferem na sua expressão do marcador da superfície, mas também exibiram alterações funcionais durante a lesões 12. Vários modelos animais têm sido utilizados para investigar a activação de células progenitoras e a regeneração do fígado. Parece que os vários tipos de lesões promover a activação de diferentes subconjuntos de células progenitoras 12. Isto pode explicar o pHdivergência enotypic da reacção ductular observada em seres humanos 4. Assim, os fenotípicas e funcionais análises complexas de células progenitoras são fundamentais para compreender o seu papel na lesões e o verdadeiro significado da reação ductular em doenças do fígado. Além combinações de marcadores de superfície, as diferenças cruciais em protocolos de isolamento de células complicar ainda mais as conclusões baseadas em estudos anteriores 2. Uma quantidade substancial de estudos abordaram o papel das células progenitoras que diferem muito em sua protocolo de isolamento (por exemplo, a dissociação do fígado (combinação de enzimas e duração do processo), de média densidade e velocidade de centrifugação) 2. Uma técnica de isolamento otimizado, proporcionando uma melhor viabilidade para populações de células raras e reflexiva da composição subconjunto, foi desenvolvido e publicado recentemente 12. O objetivo deste artigo é fornecer uma forma mais detProtocolo ailed deste procedimento de isolamento de células do fígado e o subconjunto de análise para permitir a reprodução apropriada da técnica. Além disso, o protocolo inclui uma comparação com o método de isolamento anterior para demonstrar as diferenças em comparação com o novo protocolo.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>sem vermelho de fenol DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase P</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11249002001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse-I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>17105041</tr><tr><td>ACK que lida</td> as <td>tecnologias</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS da vida do</td> amortecedor<td>HBSS</td> Azida <td></td> de sódio Sigma-Aldrich <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>S2002</td><td>prepara a solução conservada em estoque 10</td></tr><tr><td>% BSA Miltenyi</td><td>Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Solução de enxágue</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>adicione 0,5% (v/v) de BSA e armazene no gelo</td></tr><tr><td>Livre de vermelho de fenol DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1145</td><td></td></tr><tr><td>contagem de contas Bright</td><td>Life Technologies</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>PI</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de bloqueio FcR</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD31 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-418</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Remoção de Células Mortas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>anti-Biotina MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>CD64 Purificado</td><td>BioLegend</td><td>139302</td><td>Diluição: 1:100</td></tr><tr><td>CD16/32 Diluição</td><td>purificada do 101302</td><td>BioLegend</td>: <td>1:100</td></tr><tr><td>CD45 APC/Cy7</td><td>Diluição</td><td>103116</td><td>: 1:200, marca as células hematopoéticas</td></tr><tr><td>CD31 Biotina BioLegend</td><td></td><td>102504</td><td>Diluição: 1:200, marca as células endoteliais</td></tr><tr><td>ASGPR1 Purificado</td><td>Bio-Techne</td><td>AF2755-SP</td><td>Diluição: 1:100, marca os hepatócitos</td></tr><tr><td>Podoplanina APC</td><td>BioLegend</td><td>127410</td><td>Diluição: 1:1.400, marca células progenitoras</td></tr><tr><td>Podoplanina Biotina BioLegend</td><td></td><td>127404</td><td>Diluição: 1:1.400</td></tr><tr><td>CD133 PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-210</td><td>use 3 &micro; L, marcas células progenitoras</td></tr><tr><td>CD133 Biotina</td><td>BioLegend</td><td>141206</td><td>Diluição: 1:100</td></tr><tr><td>CD34 Biotina</td><td>eBioScience</td><td>13-0341-81</td><td>Diluição: 1:100</td></tr><tr><td>CD90.2 Pacific</td><td>Blue BioLegend</td><td>140306</td><td>Diluição: 1:800</td></tr><tr><td>CD157 PE</td><td>BioLegend</td><td>140203</td><td>Diluição: 1:600</td></tr><tr><td>EpCAM Violeta Brilhante 421</td><td>BioLegend</td><td>118225</td><td>Diluição: 1:100</td></tr><tr><td>Sca-1 Biotina</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-101-885</td><td>use 10 &micro; L</td></tr><tr><td>Mouse IgG2b, &kappa; PE</td><td>BioLegend</td><td>400311</td><td></td></tr><tr><td>Rato IgG1 PE</td><td>BioLegend</td><td>400407</td><td></td></tr><tr><td>Rato IgG2b, &kappa; APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>400624</td><td></td></tr><tr><td>Rato IgG2a, &kappa; Biotina</td><td>BioLegend</td><td>400504</td><td></td></tr><tr><td>Rato IgG2a, &kappa; Violeta Brilhante 421</td><td>BioLegend</td><td>400535</td><td></td></tr><tr><td>Hamster Sírio IgG APC</td><td>BioLegend</td><td>402012</td><td></td></tr><tr><td>Hamster Sírio IgG Biotina BioLegend</td><td></td><td>402004</td><td></td></tr><tr><td>Controle Normal de IgG de Cabra Purificado</td><td>Bio-Techne</td><td>AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-Cabra IgG Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11055</td><td>Diluição: 1:800</td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 405</td><td>Life Technologies</td><td>S32351</td><td>Diluição: 1:400</td></tr><tr><td>100 &micro; m Malha de filtro</td><td>A. Hartenstein</td><td>PAS3</td><td></td></tr><tr><td>LS Coluna</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Separador QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Pro Separador</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>FACS AriaTMIII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polipropileno Tubo inferior redondo</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy plus mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>RLT tampão de lise está incluído</td></tr></tbody></table>

isolamento e enriquecimento de fígado progenitoras subconjuntos identificado por um marcador combinação de superfícies novel

Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination

Durante a lesões crónicas do fígado, células progenitoras expandir num processo chamado de reacção ductular, o que também implica o aparecimento de infiltrado celular inflamatório e a activação da célula epitelial. A população de células progenitoras durante essas reações inflamatórias tem sido principalmente investigado utilizando marcadores de superfície individuais, quer por análise histológica, ou por fluxo de técnicas baseadas em citometria. No entanto, os novos marcadores de superfície identificados vários subconjuntos funcionalmente distintas dentro do progenitor fígado / haste compartimento da célula. O método aqui apresentado descreve o isolamento e análise de citometria de fluxo detalhado de subconjuntos progenitoras usando combinações novo marcador de superfície. Além disso, demonstra como os vários subconjuntos de células progenitoras pode ser isolado com pureza elevada utilizando métodos automatizados magnética e separação por FACS com base em. Importante, novos e enzimática simplificado dissociação do fígado permite o isolamento destas populações de células raras com uma alta viabilidadeque é superior em comparação com outros métodos existentes. Isto é especialmente relevante para o estudo de mais células progenitoras in vitro ou para o isolamento de ARN de alta qualidade para analisar o perfil de expressão do gene.

O procedimento aqui apresentado para a digestão do fígado utilizando uma nova mistura de enzimas resulta numa suspensão de uma única célula contendo parenquimatosa do fígado e células não-parenquimatosas (Figuras 1 e 2a). Após a lise ACK-de células vermelhas do sangue, o fluxo directo análise de citometria da suspensão de célula única é possível (Figuras 1 e 2). A estratégia envolve a propagação de exclusão de dupletos e...

lesões no figado são acompanhadas por expansão de células progenitoras que representa uma população celular heterogénea. classificação Novel deste compartimento celular permite a distinção dos vários subgrupos. O método descrito aqui ilustra a análise de citometria de fluxo e de alta pureza isolamento de vários subconjuntos que podem ser utilizadas para ensaios posteriores.

Isolamento e Enriquecimento de fígado progenitoras Subconjuntos identificado por um marcador combinação de superfícies Novel

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular ...

Os objetivos gerais deste protocolo de digestão hepática são avaliar os diversos subconjuntos de progenitores hepáticos por citometria de fluxo e isolar essas células com alta pureza utilizando um coquetel novedoso de marcadores superficiais para análises downstream adicionais. Este método pode ajudar a responder diversas questões sobre a biologia das células progenitoras hepáticas, por exemplo, quais são suas características específicas de subconjunto e qual sua causa distante durante lesão hepática. A principal vantagem desta técnica é que ela permite o isolamento de células progenitoras com alta pureza e viabilidade, o que é importante para a análise in vitro.Embora esta técnica de digestão forneça informações sobre a biologia de células progenitoras, ela pode ser realmente utilizada para o isolamento de populações de células hematopoiéticas e endoteliais. Para preparar uma suspensão de células únicas a partir do fígado de um camundongo, transfira os lobos para uma placa de Petri seca e use um bisturi para cortar os tecidos em cubos homogêneos de aproximadamente dois milímetros cúbicos. Transfira os fragmentos para dois tubos cónicos de centrífuga de 15 mililitros por fígado, co

isolation-enrichment-liver-progenitor-subsets-identified-novel

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Aqui nós descrevemos o isolamento de células do fígado CD133 expressando-tronco e células-tronco do câncer de fígado murino todo, um processo que requer a digestão dos tecidos, o enriquecimento de células eo isolamento de citometria de fluxo. Nós incluem métodos para o isolamento de células avançado única e expansão clonal.

Isolamento de CD133 + células tronco do fígado de Expansão Clonal

Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

Uma técnica para isolar hepatócitos humanos e células hepáticas não parenquimatosas do mesmo doador é descrita. Os diferentes tipos de células hepáticas constroem a base para modelos funcionais de fígado e engenharia de tecidos. Este novo método visa isolar células hepáticas com alto rendimento e viabilidade.

Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

Demonstramos como identificar e isolar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de murino medula óssea usando uma combinação de magnética e fluorescência classificação (MACS e FACS). Este protocolo pode ser usado para ensaios em vitro cultura (culturas metilcelulose ou líquido), na vivo experiências de transferência adotiva e análises de RNA/proteína.

Identificação e isolamento de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores da medula óssea de rato

Este protocolo detalha um monolayer, método soro-livre para gerar eficientemente Hepatocyte-como pilhas das pilhas de haste pluripotentes humanas (hPSCs) em 18 dias. Isto implica seis etapas como hPSCs se diferenciam seqüencialmente em tipos de células intermediárias, como a raia primitiva, endoderma definitivo, foregut posterior e progenitores de broto hepático antes de formar células como hepatócitos.

Diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas em células hepáticas

O objetivo deste artigo é fornecer uma abordagem padronizada para induzir a diferenciação de progenitor hepático humano das células-tronco pluripotentes. O desenvolvimento deste procedimento com formulações de mídia prontas para uso oferece ao usuário um sistema fácil de gerar células hepáticas humanas para pesquisa biomédica e tradução.

Especificação progenitora hepática de células-tronco pluripotentes usando um sistema de diferenciação definido

Este artigo fornece uma metodologia detalhada para as abordagens de dissociação tecidual e fracionamento celular permitindo o enriquecimento de células epiteliais viáveis de regiões proximais e distais do pulmão humano. Aqui essas abordagens são aplicadas para a análise funcional das células progenitoras epiteliais pulmonares através do uso de modelos de cultura organoides 3D.

Isolamento e enriquecimento de células progenitoras epiteliais pulmonares humanas para a cultura organoide

Aqui descrevemos e demonstramos um protocolo para o isolamento da célula endotelial do fígado do camundongo primário (LSEC). O protocolo é baseado na perfusão da colagem hepática, purificação celular não parenquimal por centrifugação de baixa velocidade e seleção de contas magnéticas CD146. Também fenótipo e caracterizamos esses LSECs isolados usando citometria de fluxo e microscopia eletrônica de varredura.

Isolamento e Caracterização de Células Endoteliais Hemorlicais do Fígado Primário do Rato

Hepatócitos carregados de lipídios são inerentes à regeneração hepática, mas geralmente são perdidos após a centrifugação do gradiente de densidade. Aqui, apresentamos um protocolo de isolamento celular otimizado que retém hepatócitos esteatóticos, produzindo populações representativas de hepatócitos regeneradores após hepatectomia parcial em camundongos.

Isolamento de Hepatócitos Regeneradores após Hepatectomia Parcial em Camundongos

Aqui apresentamos um método não genético para gerar esferoides hepáticos autólogos humanos usando células mononucleares isoladas do sangue periférico em estado estacionário.

Esferoides do fígado humano do sangue periférico para estudos de doença hepática

Os hepatócitos derivados de células-tronco pluripotentes podem ser purificados por meio da classificação celular, usando uma combinação de coloração mitocondrial e molécula de adesão de células leucocitárias ativadas (ALCAM, também conhecida como CD166).

Aplicação de coloração de mitocôndrias vivas na classificação de células para purificar hepatócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Aprenda a isolar subconjuntos de células progenitoras hepáticas com alta pureza usando citometria de fluxo e um coquetel inovador de marcadores de superfície. Este método permite análises detalhadas da biologia celular em lesões hepáticas.

Isolamento e Enriquecimento de fígado progenitoras Subconjuntos identificado por um marcador combinação de superfícies Novel

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