Isolamento e Enriquecimento de fígado progenitoras Subconjuntos identificado por um marcador combinação de superfícies Novel

Os objetivos gerais deste protocolo de digestão hepática são avaliar os diversos subconjuntos de progenitores hepáticos por citometria de fluxo e isolar essas células com alta pureza utilizando um coquetel novedoso de marcadores superficiais para análises downstream adicionais. Este método pode ajudar a responder diversas questões sobre a biologia das células progenitoras hepáticas, por exemplo, quais são suas características específicas de subconjunto e qual sua causa distante durante lesão hepática. A principal vantagem desta técnica é que ela permite o isolamento de células progenitoras com alta pureza e viabilidade, o que é importante para a análise in vitro.

Embora esta técnica de digestão forneça informações sobre a biologia de células progenitoras, ela pode ser realmente utilizada para o isolamento de populações de células hematopoiéticas e endoteliais. Para preparar uma suspensão de células únicas a partir do fígado de um camundongo, transfira os lobos para uma placa de Petri seca e use um bisturi para cortar os tecidos em cubos homogêneos de aproximadamente dois milímetros cúbicos. Transfira os fragmentos para dois tubos cónicos de centrífuga de 15 mililitros por fígado, contendo cada um 2,5 mililitros de tampão de digestão.

E coloque as amostras em banho-maria a 37 graus Celsius com agitação suave aos cinco e dez minutos. Após 15 minutos de digestão, utilize uma pipeta de 1.000 microlitros com ponteira cortada para titular suavemente os pedaços de fígado. Em seguida, devolva os tubos ao banho e deixe os pedaços sedimentarem por dois minutos.

Em seguida, filtre duas alíquotas de aproximadamente 700 microlitros do sobrenadante através de um filtro de 100 mícrons previamente umedecido com 800 microlitros de tampão de coleta. E substitua o sobrenadante removido por tampão de digestão fresco. Quando o tecido hepático não for mais visível, passe todo o sobrenadante dos tubos de digestão através do filtro.

E recolha todas as células por centrifugação. Ressuspenda os pellets em um mililitro de tampão de lise de cloreto de amônio e potássio, à temperatura ambiente, interrompendo a lise com cinco mililitros de tampão de coleta fresco após um minuto. Recolha as células com outra centrifugação.

Em seguida, aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet solto. E ressuspenda as células em quatro mililitros de tampão de coleta fresco sobre gelo. Para determinar o número de células da amostra de fígado por citometria de fluxo, primeiro, misture 20 microlitros da suspensão de células hepáticas com 174 microlitros de PBS em um tubo de poliestireno de 1,5 mililitro e seis microlitros de iodeto de propídio.

Adicione microesferas de contagem que permitam a quantificação celular e carregue a mistura de microesferas e células no citômetro de fluxo. Selecione com base nos parâmetros de dispersão lateral e dispersão anterior para evitar detritos. Exclua os dupletos por meio de um gate de altura da dispersão anterior versus área da dispersão anterior e as células mortas positivas para iodeto de propídio.

Em seguida, carregue uma amostra de 30 microlitros no citômetro de fluxo e registre os eventos. Para corar as células hepáticas para análise citométrica de fluxo dos subconjuntos de progenitores, transfira alíquotas de 2x10^5 células para tubos de reação de 1,5 mililitro. E pelletize as células por centrifugação.

Resuspenda os pellets no bloqueador Fc e incube por cinco minutos no gelo. Em seguida, adicione 50 microlitros do coquetel de anticorpos de interesse para marcação da superfície celular aos tubos apropriados e incube por 20 minutos no gelo, protegidos da luz. Ao final da incubação, lave as amostras com 400 microlitros de tampão de marcação por amostra.

E ressuspender os pellets em 100 microlitros do coquetel apropriado de anticorpos secundários por 20 minutos no gelo, protegidos da luz. Em seguida, lavar as células com mais 400 microlitros de tampão de marcação. E ressuspender os pellets em 300 microlitros de tampão de marcação contendo iodeto de propídio.

Meça a amostra utilizando um citômetro de fluxo. Para enriquecer a população de células progenitoras por separação com microesferas magnéticas, transfira 1,5-2x10^6 células para o número apropriado de tubos cónicos de 15 mililitros e recolha as células por centrifugação. Ressuspenda os pellets em 400 microlitros de HBSS suplementado com BSA.

E adicione 40 microlitros de microesferas antí-CD31 e 30 microlitros de microesferas antí-CD45 para uma incubação de 15 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, lave as células em cinco mililitros de HBSS com BSA. E ressuspenda os pellets em 100 microlitros de microesferas para remoção de células mortas para uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente.

Enquanto as células estão em incubação, equilibre uma coluna de seleção positiva de tamanho apropriado para cada fígado com três mililitros de HBSS mais BSA. Em seguida, adicione 900 microlitros de HBSS mais BSA às células e filtre as células através de uma malha de filtro de poliamida de 100 mícrons. Aplique as células incubadas com microesferas filtradas nas colunas, coletando o eluato no tubo de centrífuga.

Quando todas as células tiverem passado pela coluna, lave as colunas três vezes com três mililitros de HBSS mais BSA. Peliculize as células por centrifugação e reconstitua o pellet celular em 100 microlitros de tampão de lavagem e bloqueador de Fc. Combine os pellets celulares de quatro a seis fígados ou até menos de 1x10^6 células negativamente selecionadas.

Após cinco minutos, marque as células com anticorpo biotinilado anti-GP38 por 10 minutos no gelo. Ao final da incubação, recolha as células por centrifugação para ressuspendê-las em 400 microlitros de tampão de lavagem e cinco microlitros de Microesferas Anti-Biotina. Após 15 minutos a quatro graus Celsius, lave imediatamente as células com cinco mililitros de tampão de lavagem.

E ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão de lavagem fresco. Coloque as células ressuspendidas em um suporte refrigerado de 15 tubos e inicie a separação magnética automática. Em seguida, centrifugue o fluxo passante e ressuspenda os pellets na solução apropriada para a análise experimental subsequente planejada.

Aplicando o gate nas células negativas para CD45, CD31 e receptor de asialoglicoproteína um, selecionam-se as células progenitoras hepáticas, que podem então ser agrupadas de acordo com a expressão de glicoproteína 38 e CD133. As células gp38 positivas CD133 positivas e as células gp38 negativas CD133 positivas representam as populações celulares mais abundantes entre as células negativas para CD45, CD31 e ASGPR1 no fígado de camundongos adultos saudáveis, com diferenças aparentes na expressão de diversos marcadores superficiais previamente associados a células progenitoras. O isolamento dessas células progenitoras por microesferas magnéticas, conforme acabou de ser demonstrado, resulta em uma pureza superior a 90% das células hepáticas, com alto grau de viabilidade.

Ao tentar isolar essas células incomuns, é importante levar em consideração as enzimas utilizadas durante as etapas de digestão hepática, pois diferentes enzimas podem favorecer a obtenção de subpopulações específicas de progenitores e reduzir significativamente os níveis de expressão de CD133. É fundamental lembrar que a pureza e o rendimento celular dependem da preparação suave das suspensões de células únicas do fígado. Além disso, uma grande quantidade de detritos celulares e contaminação por células em morte podem afetar negativamente o sucesso deste protocolo.