Name: Criação Ixodes scapularis, O Ticked Black-legged: Alimentando estágios imaturos em ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Aprenda um protocolo eficaz para alimentar estágios imaturos de carrapatos em ratos, aumentando a sobrevivência dos Ixodes scapularis e reduzindo o estresse nos hospedeiros. Este método simplifica a criação de colônias.

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Os autores agradecem a ajuda da equipe da Laboratory Animal Medicine, University of Nevada, Reno. MM recebeu financiamento do Nevada INBRE.

O protocolo (Número-00682) descrito a seguir é aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Nevada Reno e segue as diretrizes da Universidade de Nevada, animal comitê de ética em pesquisa do Reno. Resumidamente, os ratinhos foram anestesiados com isoflurano e um cone de ponta foi utilizada para manter os níveis de isoflurano contínua durante 20 min. Uma pomada veterinário foi usado para evitar a secagem dos olhos sob anestesia. pitada dedo do pé foi usada para determinar o nível de anestesia e a taxa de respiração foi medido ao longo do procedimento. Ratos foram mantidos em gaiolas individuais e monitorados até que a consciência foi recuperado. Os ratinhos foram usados ​​apenas uma vez para a alimentação carrapato e foram sacrificados recuperação da carraça. A eutanásia foi realizada pelo Laboratório de pessoal da equipe Medicina Animal. CO 2 e deslocamento cervical foram utilizados para a eutanásia de animais. NOTA: Trabalhando em carrapatos requer o uso de eq de protecção individual completouipment. Para a contagem carrapatos imaturos, usar revestimentos brancos de laboratório, luvas de borracha nitrílica longos para cobrir a abertura da manga do revestimento do laboratório tapado com elásticos, e sapatos fechados. Para infestando ratos com carrapatos, use uma rede de cabelo, macacões descartáveis, luvas de manga comprida sobre as mangas, e tampas do pé. Utilizar combinações de cor branca ou luz para detectar carrapatos rebeldes. Verifique periodicamente luvas e mangas para carrapatos. 1. Quarto Preparação para o alojamento dos animais <ol><li> Designar uma sala separada a ratinhos de casas infestadas com carraças. Coloque uma esteira ou fita adesiva de dupla face tapete pegajoso fora e dentro da porta para evitar a fuga acidental carrapato. </li></ol> 2. Contagem Carrapatos para Mouse Infestação <ol><li> Colocar fita de face dupla em todo as bordas superiores de um x 5&quot; x 14&quot; recipiente de plástico 7&quot; e encher com água a cerca de 2 cm. </li><li> Colocar uma outra pequena caixa ou uma placa de Petri, no centro do recipiente e encher com água a 1 cm a criação de um &amp;# 34; fosso&quot; em torno deste recipiente </li><li> Armazenar o frasco contendo larvas ou ninfas dentro da placa de Petri. </li><li> Use um pincel fino para remover as larvas ou ninfas do frasco e contar sob o microscópio. Contagem de 50 larvas ou ninfas 25 em frascos de cintilação separados. Cobrir os frascos imediatamente com malha de nylon ou de tela de tecido organdy e fechar com bandas de borracha. </li></ol> 3. Infestando ratos com Imaturo Os carrapatos <ol><li> Use uma bancada de trabalho de cor branca ou luz e cole fita dupla face em torno do perímetro da área de trabalho. </li><li> Anestesiar rato com isoflurano. Verifique o nível de anestesia por pitada dedo do pé. Uma vez anestesiados, transferir o mouse para uma almofada de aquecimento coberta com toalhas de papel e anexar a um cone de nariz para o abastecimento de isoflurano continuou. </li><li> Aplique de petróleo à base de gelatina pomada para evitar a secura. Nota o padrão de respiração do rato para ajustar os níveis de isoflurano (80 -. 230 respirações por minuto é normal, reduz-se o nível de isoflurano brÉ inferior a 80 respirações por minuto para evitar a morte do animal). </li><li> Tome um frasco de 50 larvas ou 25 ninfas e coloque carrapatos sob a pele na cabeça entre as orelhas com um pincel ( Figura 1 ). Mantenha o rato sob anestesia durante 20 minutos após a colocação para dar tempo suficiente para as carraças se fixarem. </li><li> Mova o mouse para um padrão, caixa de plástico sapato-tipo gaiola descartável do mouse com tampas estáticas e cama branca. Fornecer brinquedos, água e alimentos ad libitum como por cuidado normal do mouse. </li><li> Armazene a gaiola do mouse dentro de uma gaiola de rato ou gerbil maior alinhada com fita adesiva dupla face em torno das bordas superiores. Encha a gaiola exterior com 3 cm de água ( Figura 2 ). </li></ol> 4. Coleta de carrapatos de ratos <ol><li> Os carrapatos imaturos destacam-se entre os dias 3 e 6 da alimentação. Verifique as gaiolas e fossos de água para carrapatos engorged todos os dias após o dia 3. </li><li> Colete tiques isolados da gaiola entre os dias 4 e 6. Use uma dort escova ou fórceps suaves para pegar carrapatos ingurgitadas e armazenar em frascos de cintilação limpas cobertas com pano de malha de nylon protegido com bandas de borracha. </li><li> Anestesiar e vá rato no dia 7 para qualquer restantes carrapatos anexas. </li><li> Verifique a roupa de cama, calha de alimentação, e uma garrafa de água por carrapatos ingurgitadas em ratinhos dia 7. eutanásia seguindo o processo como descrito acima. Autoclave o descartável gaiolas, cama, garrafa de água, e comida calha para evitar carrapatos em jejum escapando. </li></ol> 5. Armazenamento de Fed Carrapatos <ol><li> Manter carrapatos ingurgitadas a 90% de humidade, 20 ° C, e uma luz 0:12: escuro ciclo, num incubador de humidade e temperatura controladas até que muda ocorre. Isto pode demorar cerca de 12 a 18 semanas para ocorrer. </li><li> Enquanto humidade elevada promove a sobrevivência carrapato, que também faz com que os carrapatos propensas ao crescimento de fungos. Verificar alimentado carrapatos sob o microscópio, pelo menos, uma vez por semana para o molde. Se for detectada, lavar sobreviventes em 70% de etanol durante 5Min., Enxaguar em água, transferir para um papel de filtro para secar e transferir para novos frascos limpos. </li></ol>

<ol><li>Gleim, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+associated+with+tick+bites+and+pathogen+prevalence+in+ticks+parasitizing+humans+in+Georgia%2C+USA%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26amp%3B+Vectors%22%5BJournal%5D)">Factors associated with tick bites and pathogen prevalence in ticks parasitizing humans in Georgia, USA.</a> Parasites &amp; Vectors. 9 (125), Available from:
 <a target="_blank" href="http://doi.org/10.1186/s13071-016-1408-6">http://doi.org/10.1186/s13071-016-1408-6</a> 1-13 (2016).</li>
<li>Krober, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+feeding+assays+for+hard+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">In vitro feeding assays for hard ticks.</a> Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).</li>
<li>Kuhnert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+of+Hard+Ticks+In+Vitro%3A+New+Perspectives+for+Rearing+and+for+the+Identification+of+Systemic+Acaricides%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Feeding of Hard Ticks In Vitro: New Perspectives for Rearing and for the Identification of Systemic Acaricides.</a> ALTEX. 13 (2), 76-87 (1996).</li>
<li>Voigt, W. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8233589">In vitro feeding of instars of the ixodid tick Amblyomma variegaturn on skin membranes and its application to the transmission of Theileria mutans and Cowdria ruminantium.</a> Parasitol. 107, 257-263 (1993).</li>
<li>Gregson, J. D. Ticks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGregson%2C+JD+%22Insect+Colonization+and+Mass+Production%22">Insect Colonization and Mass Production</a>. Smith, C. N. , Academic Press. New York. 49-72 (1966).</li>
<li>Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSonenshine%2C+DE+%22Biology+of+Ticks%22">Biology of Ticks</a>. 2, Oxford University Press. New York. (1993).</li>
<li>Bouchard, K. R., Wikel, S. K. Care, maintenance, and experimental infestation of ticks in the laboratory setting. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBouchard%2C+KR+%22Biology+of+Disease+Vectors%22">Biology of Disease Vectors</a>. Marquaedt, W. C. , Elsevier. New York. 705-711 (2005).</li>
<li>Schumaker, T. S., Barros, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+cycle+of+Ornithodoros+%28Alectorobius%29+talaje.+%28Acari%3AArgasidae%29+in+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Life cycle of Ornithodoros (Alectorobius) talaje. (Acari:Argasidae) in laboratory.</a> J Med Entomol. 32, 249-254 (1995).</li>
<li>Banks, C. W., Oliver, J. H., Hopla, C. E., Dotson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+life+cycle+of+Ixodes+woodi+%28Acari%3AIxodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Laboratory life cycle of Ixodes woodi (Acari:Ixodidae).</a> J. Med. Entomol. 35, 177-179 (1998).</li>
<li>James, A. M., Oliver, J. H. Jr Feeding and host preference of immature Ixodes dammini,I.scapularis,and I.pacificus.(Acari:Ixodidae). <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Feeding+and+host+preference+of+immature+Ixodes+dammini%2CI.scapularis%2Cand+I.pacificus.(Acari%3AIxodidae)">J. Med. Entomol</a>. 27, 324-330 (1990).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Passos críticos dentro do Protocolo É importante ter vários níveis de medidas de segurança quando a criação carrapatos para evitar fuga acidental. Uso de fita adesiva e um fosso de água são fundamentais para garantir a segurança. É importante para manter o rato anestesiado em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura constante do corpo. Nós também descobrimos que raspar o mouse não fornece qualquer benefício extra para fixação do carrapato. Um ratinho individual pode ser mantida na ...

Os carrapatos são ectoparasitas hematófagos obrigatórios de vertebrados e são distribuídos em todo o mundo. Nos Estados Unidos, pelo menos 11 espécies de carrapatos são vetores de patógenos de importância para a saúde pública 1 . Ixodes scapularis é responsável pela transmissão de vários patógenos, tais como os agentes causadores da doença de Lyme ( Borrelia burgdorferi ), febre recidivante ( B. miyamotoi), anaplasmose granulocítica humana ( Anaplasma phagocytophilum ) e babesiose (Babesia spp.). Apesar da importância de I. scapularis como vetor de doença, a coleta desses aracnídeos em abundância da natureza para estudos no laboratório nem sempre é viável. Portanto, a produção de carrapatos saudáveis ​​criados em laboratório é essencial para estudos de biologia de carrapatos e interações de carrapatos-patógenos. O ciclo de vida de todos os carrapatos duros (família Ixodidae), incluindo I. scapularis, consiste no ovo e em três activE estádios: larva, ninfa e adulto. Cada estágio ativo se alimenta de um hospedeiro vertebrado. As interações complexas que ocorrem entre os carrapatos e seus hospedeiros ao longo de vários dias de apego e alimentação são quase impossíveis de replicar usando alimentadores artificiais, e é improvável que fornecem números suficientes de carrapatos alimentados para a criação em massa 2 , 3 , 4 . Portanto, ratos vivos e coelhos são usados ​​mais freqüentemente como hospedeiros para a criação de imaturos (larvas e ninfas) e estádios maduros (adultos) de carrapatos, respectivamente. A necessidade de múltiplos hospedeiros para alimentação de sangue durante cada estágio de desenvolvimento complica a criação de carrapatos e é tempo e custo intensivo 5 , 6 , 7 . A maioria dos protocolos de criação de carrapatos requerem manter os ratos em uma gaiola 7 , 8 ou em umge de tais dimensões que o animal não pode mover-se livremente e se lamber 6, 9, 10. Estas gaiolas cilíndricas são depois transferidos para uma gaiola de caixa de sapatos com uma grelha de arame. Ingurgitadas, carrapatos destacadas são depois recolhidos a partir da água por baixo. No entanto, este método resulta em expor alimentado carrapatos à água contaminada com fezes e urina que pode aumentar o crescimento de fungos e carrapatos mortalidade 9. Além disso, aumenta a possibilidade de fuga carrapato a partir da calha de água, bem como fazendo com que o stress a ratinhos. Para contornar estes problemas, que aqui demonstrar alimentação carrapato larval em ratinhos dentro de plástico do tipo caixa de sapatos gaiolas descartáveis. Este método permite que o comportamento normal dos ratos, os aumentos ingurgitadas recuperação carraça, e reduz a mortalidade carrapato devido a contaminação.

<table><tbody><tr><td>Pomada veterinária Puralube</td><td>Amazon</td><td></td><td>Disponível em qualquer loja de animais ou loja online</td></tr><tr><td>Gaiola de rato descartável</td><td>&nbsp; Innovive, San Diego, Califórnia</td><td>Conjunto de fundo e tampa</td> <td>MV 2</td></tr><tr><td>Roupa de cama Alpha dri branca&nbsp;</td><td>Lab Supply, Fort Worth, TX</td><td>&nbsp; ALPHA-Dri&trade;</td><td></td></tr></tbody></table>

criação<em&gt; ixodes scapularis,</em&gt; o ticked black-legged: alimentando estágios imaturos em ratos

Rearing Ixodes scapularis, the Black-legged Tick: Feeding Immature Stages on Mice

Ixodes scapularis , o vetor da doença de Lyme, é um dos vetores de doenças mais importantes no Leste e no Centro-Oeste dos Estados Unidos. Esta espécie é um carrapato de três hospedeiros que requer uma refeição de sangue de um hospedeiro vertebrado para cada estágio de desenvolvimento, e as fêmeas adultas requerem uma refeição de sangue para reprodução. Os carrapatos larvalos ligam-se ao seu hospedeiro durante 3-5 dias para alimentação e deixam o hospedeiro quando totalmente engorgado. Esta dependência de vários hospedeiros diferentes e o tempo de ligação prolongado para ingurgitamento complica a criação de carraças no ambiente laboratorial. No entanto, para entender a biologia das carraças e as interações do carrapato-patógeno, a produção de carrapatos saudáveis ​​criados em laboratório é essencial. Aqui, demonstramos um protocolo simples e econômico para a alimentação de carrapatos imaturos em camundongos. Modificamos os protocolos existentes para diminuição do estresse em camundongos e aumento do sucesso e sobrevivência da alimentação de carrapatos usando gaiolas descartáveis ​​sem fundo de malha para evitar o contato de carrapatos.Água contaminada com urina e fezes de ratos.

Modificamos os protocolos existentes de criação de carrapatos 6 , 10 para melhorar a eficiência alimentar e reduzir o estresse no hospedeiro do mouse. Os resultados demonstram que as gaiolas padrão de mouse estilo estilo sapato são bem adequados para a criação de carrapatos. A roupa branca forneceu um bom contraste para fácil coleta de carrapatos alimentados. A maioria dos carrapatos subiu as paredes dos recipientes após a alimen...

A produção de carrapatos criadas em laboratório saudáveis ​​é essencial para estudos sobre a biologia carrapato, e carrapato-patógeno interações. Aqui demonstramos um protocolo simples para a alimentação carrapato imaturo que é rentável e menos stressante para ratinhos.

Criação<em&gt; Ixodes scapularis,</em&gt; O Ticked Black-legged: Alimentando estágios imaturos em ratos

Ixodes scapularis, the vector of Lyme disease, is one of the most important disease vectors in the eastern and Midwestern United States. This species is a ...

O objetivo geral deste protocolo de alimentação de carrapatos é aprimorar os padrões existentes ao aumentar a sobrevivência de carrapatos alimentados com sangue, ao mesmo tempo que reduz o estresse ao hospedeiro roedor. Além de simplificar a criação de colônias de carrapatos, este método oferece uma maneira mais fácil de coletar um número maior de carrapatos alimentados em um único dia de coleta, o que é essencial para responder perguntas biológicas fundamentais nas áreas de macrobiologia. A principal vantagem desta técnica é que os carrapatos não são expostos à água contendo excretas de camundongo, reduzindo assim a mortalidade de carrapatos.Além disso, os carrapatos podem ser coletados em um único dia, o que reduz o estresse do camundongo. Para acondicionar os frascos de carrapatos durante a contagem, prepare um recipiente que permita mínima fuga. Cole fita adesiva dupla-face em toda a borda superior de um recipiente plástico.Em seguida, encha o recipiente com cerca de dois centímetros de água. Depois, coloque outra caixa pequena ou recipiente centralmente dentro do recipiente e encha-o com cerca de um centímetro de água, para que afunde e permaneça em posição. Armazene os frascos com larvas ou ninfas de carrapatos dentro dessa caixa ou recipiente.Para contar os carrapatos em uma infestação, use um microscópio e um pincel fino para remover larvas ou ninfas do frasco. Transfira 50 larvas ou 25 ninfas para um frasco de cintilação. Assim que o frasco estiver completamente cheio, cubra-o com uma tela de nylon ou musselina e fixe a tampa com elásticos firmes.Destine um quarto separado para acomodar camundongos infestados por carrapatos. Para evitar a fuga acidental de carrapatos, coloque um tapete adesivo ou fita adesiva dupla-face do lado de fora do quarto e coloque outro tapete do lado de dentro da porta do quarto. Primeiro, prepare uma área para manipular os carrapatos próximo aos camundongos.Use uma bancada branca ou de cor clara. Faça uma borda de fita adesiva dupla face ao redor do perímetro da área de trabalho na bancada. Agora, anestesie um camundongo com isoflurano.Quando pronto, transfira o camundongo para uma placa aquecida coberta com papel toalha e fixe um cone nasal para fornecer isoflurano continuamente. Verifique o nível de anestesia utilizando o aperto no dedo do pé. Ajuste o anestésico com base no padrão respiratório.De 80 a 230 respirações por minuto é normal. Reduza o isoflurano se a respiração estiver mais lenta. Além disso, aplique uma pomada oftálmica à base de pomada de parafina nos olhos.Agora, pegue um frasco com 50 larvas ou 25 ninfas e, usando um pincel, transfira os carrapatos para o camundongo. Coloque os carrapatos sob a pelagem na cabeça, entre as orelhas. Após posicionar o último carrapato, mantenha o camundongo anestesiado por 20 minutos, para que os carrapatos possam se fixar antes que o camundongo tente removê-los.Após 20 minutos, devolva o camundongo a uma nova gaiola com cama de cor branca para melhorar a visibilidade dos carrapatos. Inclua alguns brinquedos e forneça acesso ad libitum a água e alimento. Utilize caixas descartáveis com tampas bem ajustadas.Em seguida, coloque a gaiola domiciliar dentro de uma gaiola maior para rato ou rato-toupeira que tenha fita adesiva dupla-face ao redor da borda interna superior das paredes. Depois, preencha o espaço entre as gaiolas com cerca de três centímetros de água. Carrapatos imaturos se desprenderão após três a seis dias de alimentação.A partir do terceiro dia em diante, verifique diariamente as gaiolas e a água ao redor em busca de carrapatos ingurgitados. Colete os carrapatos desprendidos usando um pincel ou pinça macia e transfira-os para frascos cintiladores limpos tampados com tecidos de malha de náilon fixados com elásticos. No sétimo dia, anestesie o camundongo como antes e verifique a presença de quaisquer carrapatos ainda fixados.Além disso, verifique cuidadosamente a cama, o comedouro e a água. Em seguida, eutanazie o camundongo e autóclave as gaiolas descartáveis, a cama, a garrafa de água e o comedouro para eliminar qualquer carrapato remanescente. Mantenha os carrapatos ingurgitados em uma incubadora controlada.Entre 12 e 18 semanas, os carrapatos devem mudar de exoesqueleto. Pelo menos uma vez por semana, verifique os carrapatos ao microscópio em busca de mofo. Caso algum mofo seja detectado, lave os carrapatos sobreviventes com etanol 70% durante cinco minutos.Em seguida, lave os sobreviventes em água e transfira-os para um papel de filtro para secar. Uma vez limpos e secos, transfira as carrapatos para novos frascos limpos e continue seu ciclo de vida. A maioria dos carrapatos subiu pelas paredes dos recipientes após se alimentar e foi fácil de coletar.As carrapatos raramente escapavam das gaiolas dos camundongos. A cama branca proporcionava um bom contraste para detectar carrapatos alimentados. Durante as coletas, a maioria dos carrapatos se desprendia até o quarto dia.Alguns esperaram até o quinto dia para soltar, e no sétimo dia, nenhum camundongo estava carregando carrapatos. Cerca de 2/3 dos carrapatos conseguiram se fixar e se alimentar até a ingurgitação. Todos os camundongos permaneceram saudáveis e não apresentaram quaisquer sinais de desconforto.Uma vez dominado, este método pode fornecer centenas de carrapatos alimentados com sangue em um único dia de coleta. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de usar EPI completo para prevenir a fixação acidental de carrapatos.

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