Medir e alterando Acasalamento Drive em Male Drosophila melanogaster

O objetivo geral deste ensaio é medir e manipular o impulso de acasalamento da Drosophila macho para examinar a motivação em um sistema reducionista. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no estudo da motivação, como quais genes e neurônios controlam o impulso de acasalamento, potencialmente revelando a lógica por trás do circuito motivacional. A principal vantagem deste método é que ele fornece um ensaio de alto rendimento para medir a unidade de acasalamento que pode ser usado em conjunto com as poderosas ferramentas genéticas disponíveis na mosca.

Pelo menos três dias antes de um ensaio de saciedade 2-D, prepare moscas fêmeas de uma garrafa de branco 11 18 sobre o choque térmico escondeu o estoque de moscas. Uma vez que 20 a 50% das pupas tenham fechado e haja pelo menos cinco machos para propagar o estoque, vire as moscas para uma nova garrafa. Em seguida, choque térmico a garrafa original em um banho de água quente a 37 graus Celsius por uma hora para ativar suficientemente o choque térmico escondido para matar larvas e pupas masculinas.

Após o choque térmico, apenas as fêmeas se fecharão dessas garrafas. Para preparar a arena para experimentos, monte parcialmente a arena de saciedade 2-D e aperte-a com porcas de aperto manual e parafusos sextavados. Em seguida, coloque a comida fresca para moscas em uma garrafa limpa e segura para micro-ondas e adicione água apenas o suficiente para cobrir a superfície inferior.

Leve os alimentos ao micro-ondas por 30 a 45 segundos. Verifique visualmente o progresso e mexa os alimentos a cada 15 segundos até derreter. Assim que o alimento derreter, use uma ponta de pipeta de 1000 microlitros embotada para transferir lentamente cerca de 1 mililitro de alimento derretido para cada câmara.

Deixe a comida solidificar novamente a quatro graus Celsius por 10 minutos antes de montar completamente a arena. A arena concluída pode ser usada para experimentos. Armazene os restos de comida a quatro graus Celsius para reutilização.

Antes de iniciar o ensaio de saciedade 2-D, defina a incubadora para 23 graus Celsius para experimentos de temperatura ambiente padrão e certifique-se de que a umidade seja superior a 30%Deixe um copo de água na incubadora se a incubadora não tiver controle de umidade. Coloque a arena de ensaio de saciedade 2-D na incubadora por 30 minutos para equilibrar a temperatura e evitar a condensação nas câmaras durante o curso do experimento. Mantenha as portas giratórias na posição aberta.

Em seguida, use um aspirador de moscas para aspirar de 15 a 20 fêmeas virgens em cada câmara da arena. Depois que as moscas fêmeas forem transferidas, aspire um macho para cada câmara. Em seguida, coloque a arena carregada na incubadora sob uma filmadora padrão e filme as moscas por 4,5 horas.

Após as filmagens, use CO2 ou temperatura fria para anestesiar as moscas antes de removê-las da arena. Marque os vídeos observando quando cada mosca macho começa e termina cada acasalamento. Use o código fornecido para gerar um etograma.

Depois de registrar todos os tempos de acasalamento, some o número de acasalamentos para cada mosca. Aspire um macho para cada uma das 32 câmaras em uma arena de namoro. Em seguida, aspire uma fêmea em cada câmara.

Filme as moscas por vinte minutos usando uma filmadora de consumo padrão. Pontue o índice de namoro para quantificar o namoro em uma janela de cinco minutos. Se uma mosca macho não iniciar o namoro nos primeiros quinze minutos, o índice de namoro é zero.

moscas ingênuas do tipo selvagem devem mostrar um índice de namoro superior a 0,9 Enquanto uma mosca totalmente saciada deve ter um índice de namoro abaixo de 0,2. Depois de realizar um ensaio de saciedade 2-D, aspire as moscas machos das câmaras para frascos de comida. Isole as moscas machos das fêmeas a 23 graus Celsius pelo número desejado de dias.

Em seguida, realize um ensaio de saciedade 2-D com os machos recuperados e marque seus acasalamentos ao longo de apenas uma hora. Para caracterizar o impulso de acasalamento de Drosophila, machos Canton-S do tipo selvagem de três dias de idade foram testados em um ensaio de saciedade 2-D. Ao longo de 4,5 horas, os machos acasalam em média 4,8 vezes.

78% dos acasalamentos começam nas primeiras duas horas. Os acasalamentos tornam-se menos frequentes à medida que o ensaio progride. Esse declínio no comportamento de acasalamento também é visto quando os machos são testados em ensaios de namoro com novas fêmeas e é recuperado depois que os machos foram isolados das fêmeas por três dias.

No final dos ensaios de saciedade 2-D, a estimulação dopaminérgica aumentou o namoro e a cópula. Os efeitos de reversão não são observados com genótipos controlados pelos pais. Uma vez dominado, este ensaio pode ser preparado em 30 minutos e pontuado em uma hora e meia.

Este ensaio pode ser realizado em conjunto com manipulações genéticas e neuronais, como knockdown de RNAi e optogenética, para determinar quais genes e neurônios controlam o impulso de acasalamento.