Name: Medir e alterando Acasalamento Drive em Male Drosophila melanogaster (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Aprenda a medir e manipular o impulso de acasalamento em machos de Drosophila melanogaster usando ensaios comportamentais de alta vazão. Este método integra ferramentas genéticas avançadas para estudar os mecanismos neurais da motivação.

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Os autores agradecem a Mike Crickmore, Dragana Rogulja e Michelle Frank pelos comentários sobre o manuscrito. Pavel Gorelik forneceu suporte técnico para a fabricação das arenas comportamentais. Este trabalho foi conduzido no laboratório de Mike Crickmore e também é apoiado pela Fundação Whitehall (Investigadora Principal: Dragana Rogulja). S.X.Z. é Stuart H.Q. e Victoria Quan Fellow na Harvard Medical School.

NOTA: Este protocolo descreve a preparação (Seções 1 - 3), execução (Seção 4), e análise (Seção 4) de ensaios de saciedade 2-D. Em seguida, utilizando estimulação dopaminérgica, como exemplo, a secção 5 mostra como combinar estimulação termogênico com ensaios de saciedade 2-D para induzir hipersexualidad. Secção 6 descreve 3 maneiras de verificar os resultados de ensaios de saciedade 2-D. Finalmente, a Seção 7 mostra como medir a recuperação da unidade de acasalamento em moscas macho. 1. Confecção de 8 e 32 câmaras Arenas Comportamentais NOTA: cada arena comportamental consiste em diversas camadas de folhas de plástico cortadas a laser mantidas juntas por meio de parafusos e porcas sextavadas polegar em cada um dos quatro cantos (Figura 1A). <ol><li> Fabricar as camadas de arena. Fabricar cada camada utilizando um cortador laser para cortar folhas de plástico acrílico com a forma adequada (ver Figura 1B, 1C pelo produto). NOTA: Muitos institutio pesquisans tem cortadores de laser em suas lojas de máquinas ou espaços fabricante. Se a instituição tem acesso a um cortador de laser, continue com as seguintes etapas. Se não, então siga as instruções na etapa 1.2, em vez. <ol><li> Para cada camada, abra o padrão de design no software do cortador a laser. NOTA: Os desenhos podem ser encontrados em arquivos PDF apropriadamente nomeado (por exemplo, 8-Câmara Arena - Layer 2 - Doors.pdf) em material suplementar 1. Este arquivo também contém anotações para o tipo de plástico a ser utilizado (por exemplo, 1 / 8 polegadas (ou seja, 3,175 mm) acrílico). A espessura exacta de cada camada não é crítica. O principal requisito é permitir que 0,12 polegadas (3 mm) ou mais de espaço livre vertical nas câmaras. </li><li> Ajuste as configurações de laser (energia, foco, etc.) para o tipo e espessura do plástico para ser usado. Coloque plástico na cama cortador de laser e executar o corte a laser. NOTA: Estas definições variam amplamente com base na cutte a laserModelo R e a força de seu laser. Encontrar as configurações adequadas com base na experiência do passado ou fazendo cortes de teste em sucata de plástico. As gravuras hexagonais profundas estão incluídas no projeto de recesso as cabeças dos parafusos hex. Este recurso permite que para o aperto de uma mão das porcas polegar e permite que as arenas para descansar plana no banco (sem salientes cabeças dos parafusos). No entanto, fazendo gravuras profundas é muitas vezes difícil de alcançar, e, usando um cortador a laser demorado. Este passo é opcional e pode ser ignorada sem afetar os resultados comportamentais. </li><li> Ao cortar a moldura da porta (Layer 2, Figura 1A), também usam as configurações de laser adequadas para a gravura os números de câmara incluídos no projeto (como na Figura 1B, 1C). </li></ol></li><li> Coloque uma ordem com um fabricante de corte a laser online. Carregar todos os arquivos de projeto em PDF para a arena 8 e / ou 32 câmaras e especificar o tipo de material (por exemplo, 1/8 de polegada (ou seja, 3,175 mm) clear acrílico) com base nas anotações nos arquivos. Os resultados aparecerão como nas Figuras 1B (arena de 8 câmaras) e 1C (arena de 32 câmaras). </li><li> Montar arenas usando quatro parafusos sextavados e quatro porcas polegar para alinhar e manter unidas as camadas de plástico (Figura 1A). As arenas aparece como na Figura 1D, 1E (8-câmara) e Figura 1F, 1G (32-câmara). NOTA: A parede de alimentos (Camada 4 na Figura 1A) é utilizado apenas para os ensaios de saciedade 2-D e é omitida em arenas 32-câmara, que são utilizados em ensaios de corte. </li></ol> 2. Preparação de Alimentos para 2-D Saciedade Assay Observação: Uma vez que um ensaio de saciedade 2-D estende por 4,5 h, mosca alimentar é usado na arena para fornecer nutrição e água. Este protocolo utiliza, mas não se restringe a, a farinha de milho-agar convencional mosca alimentos. <ol><li> Parcialmente montar o 2-D arena de saciedade (8 câmaras) com camadas 3-6(veja a Figura 1A para atribuições de camadas) e aperte-o com nozes polegar e parafusos sextavados. </li><li> Coloque os alimentos frescos fly em um frasco limpo, micro-ondas. Adicionar água suficiente para cobrir a superfície do fundo do frasco (Figura 2A). </li><li> comida de microondas em alta por 30 - 45 s. Verificar o progresso e mexa a cada 15 s até derreter (Figura 2B). CUIDADO! alimentos voar ferve facilmente sobre. </li><li> Usar um embotados-1000 uL ponta da pipeta (Figura 2C) para transferir lentamente ~ 1 mL derretido alimentos em cada uma das câmaras (Figura 2D). </li><li> Permitir que o alimento resolidify a 4 ° C durante ~ 10 min (Figura 2E), antes de montar completamente na arena (Figura 2F). </li><li> Use a arena concluída para experiências (ver Secção 4) ou armazenar a 4 ° C. </li><li> Armazenar o alimento restante a 4 ° C e reutilização. </li></ol> 3. Preparar Virgens fêmeas para ensaios comportamentais NOTA: 2-D ensaios de saciedade utilizar um grande número de moscas fêmeas virgens (~ 120 - 160 para uma arena comportamental cheio) que são difíceis de recolher, utilizando métodos convencionais. Esta seção descreve uma abordagem alternativa utilizando o transgene HS-HID no cromossoma Y 28, que tem sido utilizado com sucesso em ensaios de corte 25, 29. O estoque usado para gerar fêmeas virgens de olhos brancos tem o w1118 genótipo (X) / hs-HID (Y); + / +; + / + (Bloomington estoque número 24638). <ol><li> Virar voa em uma nova garrafa, uma vez 20 - 50% das pupas têm eclosed (veja a Figura 3A, por exemplo) e há bastante sexo masculino (5 - 10) para propagar as ações. </li><li> Choque térmico a garrafa original em um banho de água quente a 37 ° C durante 1 h para activar suficientemente HS-HID para matar os machos (Figura 3B). Após o choque térmico, a apenas fêmeas Eclose destes frascos e assim permanecerá virgem até oensaios. NOTA: Certifique-se de todos os lados da garrafa são uniformemente aquecido (ver Figura 3A para a linha de água). Estender esse tempo para até 2 h se 1 h não é suficiente para sacrificar todos os homens. </li><li> Isolar fêmeas coletadas por pelo menos 3 d antes de experiências para garantir que eles são velhos o suficiente para ser sexualmente receptiva 25, 29. NOTA: os machos cromossomo Y-menos ocasionalmente surgem a partir deste estoque. Estes machos têm olhos brancos e não são afetados pelo choque térmico, porque eles não contêm o transgene hs-HID. Eles não podem produzir esperma e, portanto, não pode diminuir a receptividade em mulheres de 30, 31. </li></ol> 4. A realização e marcando 2-D saciedade Ensaios NOTA: É importante para controlar a idade do macho voa como alterações de unidade de acoplamento com a idade. Este protocolo usa machos que são 3-4 d velha 25 </sup&gt;. <ol><li> Ajuste da incubadora para a temperatura desejada (por exemplo, 23 ° C durante padrão, experiências de RT) e humidade (&gt; 30%). No caso de incubadoras sem controle de umidade, deixando um copo de água na incubadora é suficiente. </li><li> Coloque um 2-D arena de ensaio de saciedade no incubador durante ~ 30 minutos para equilibrar a temperatura e para evitar a condensação nas câmaras durante o decurso da experiência. As portas rotativas deve estar na posição aberta. </li><li> Use um aspirador de fly 32 para aspirar 15 - 20 fêmeas virgens em cada câmara da arena (Figura 4). NOTA: É importante que as fêmeas e machos não são anestesiados, no mesmo dia como o ensaio. Em nossa experiência, isso pode afetar a receptividade feminina e comportamento de acasalamento dos machos. </li><li> Aspirar 1 macho em cada câmara. </li><li> Coloque a arena carregado na incubadora sob uma câmara de vídeo de consumo normal (Figura 5) e a película durante 4,5 h. </li><li> Pontuação vídeos observando quando cada macho mosca começa e termina cada (ou seja, a cópula) acasalamento. Este passo pode ser no primeiro demorado. Com a prática, pode-se marcar os vídeos com velocidade 5x ou superior. Observação: Uma vez que as moscas acasalar para ~ 20 min a ~ 23 ° C (duração mais curto a temperaturas mais elevadas) 29, pode-se percorrer os primeiros 15 minutos de cada acoplamento. </li><li> Após o login todos os momentos de acasalamento, somar o número de acasalamentos para cada mosca (ver resultados representativos). </li><li> Use o código fornecido para gerar um etograma. Ver material suplementar para o código 2, instruções e dados de exemplo. </li><li> Use CO 2 ou temperatura fria para anestesiar as moscas antes de removê-los. </li></ol> 5. Usando a manipulação termogênico para inverter Saciedade em 2-D saciedade Ensaios NOTA: Este teste de protocolo se a estimulação termogênico de uma população neuronal definido pode superar saciedade. O FLI experimentales expressam o canal de cátions sensível ao calor TRPA1 em populações definidas de neurónios (UAS-TRPA1). As etapas a seguir aplicam-se à estimulação dos neurónios dopaminérgicos (TH-Gal4), que foram mostrados para promover a unidade de acoplamento 25. Estes passos podem ser usados ​​em conjunto com os outros condutores neuronais para descobrir outras populações que promovem a unidade de acoplamento. <ol><li> Para induzir thermogenetically comportamentos de acoplamento em moscas saciados, aumente a temperatura na incubadora (por exemplo, a partir de 23 ° C a 28,5 ° C) depois de completar um 4,5 H 2-D experimento saciedade completa. </li><li> Depois da incubadora atingir a temperatura desejada, continue a estimulação de calor e marcar os acasalamentos (ie. Cópulas) dos machos para 1 h (ver resultados representativos). NOTA: A temperatura e a duração da estimulação pode variar dependendo do genótipo por isso, é necessário solucionar as condições óptimas que impedem a sobre-estimulação dos neurónios, enquanto continua produzindo um Robufenótipo st. </li></ol> 6. Usando Courtship e locomoção para Verifique Saciedade Nota: Esta secção descreve métodos de 3 opcionais que podem ser utilizados para verificar os resultados de ensaios de saciedade 2-D. Eles não são necessários para cada ensaio. <ol><li> Use ensaios de corte para verificar a saciedade. <ol><li> Aspirar um macho e uma fêmea virgem em cada uma das câmaras 32 numa arena de corte. </li><li> Filmar as moscas para ~ 20 min, utilizando uma câmara de vídeo padrão. </li><li> Pontuação do índice de namoro (CI) para quantificar o namoro 25; esta é a fração de tempo gasto na execução de comportamento de corte (cantando, seguindo, etc.) e acasalamento (ou seja, a cópula) ao longo de uma janela de 5 min. Esta janela começa a partir da primeira instância do comportamento de corte. Se uma mosca macho não iniciar corte nos primeiros 15 min, a sua IC é 0. moscas Naive WT deve mostrar um CI superior a 0,9, ao passo que uma mosca totalmente saciado deve ter um IC below 0,2. Outras medidas de corte também pode ser considerado 23, 33. </li></ol></li><li> Marcando o namoro em ensaios de saciedade 2-D <ol><li> Conseguir a quantidade de tempo que uma mosca macho passa cortejando, ao longo de um período de tempo de um ensaio de saciedade 2-D (por exemplo, o primeiro h). O namoro é definido como o macho de executar qualquer etapa do ritual (cantando, seguindo, etc.). Ao contrário no ponto 6.1.3, este passo não inclui o tempo o macho passa o acasalamento. </li><li> Dividir o tempo de corte acima pelo tempo total do macho não foi acasalamento (ou seja, não copular) no mesmo período de tempo. Por exemplo, se um macho fazer cortes durante 15 min e companheiros durante 20 minutos ao longo da primeira hora, a proporção é de 15 min / (60 min - 20 min) = 0,375. A relação é mostrada como &quot;Fração de nonmating tempo no namoro&quot; em resultados representativos. </li></ol></li><li> Usando o ensaio de locomoção para avaliar exaustão <ol><li> Parcialmente montar o 32-Arena câmara com todas as peças, mas a folha de contraste. </li><li> Aspirar uma mosca macho (sem moscas fêmeas) em cada uma das câmaras 32 numa arena de corte. </li><li> Filmar as moscas para ~ 10 min, utilizando uma câmara de vídeo padrão. </li><li> Acompanhe as moscas com o plugin MTrack2 em ImageJ (http://valelab.ucsf.edu/~nstuurman/ijplugins/MTrack2.html). </li></ol></li></ol> 7. Recuperando Acasalamento unidade depois de 2-D Saciedade Assay <ol><li> Realizar um ensaio de saciedade 2-D, tal como descrito na secção 4, mas aspirar o moscas macho no final do ensaio. </li><li> Isolar as moscas macho a 23 ° C durante o número pretendido de dias. </li><li> Realizar um ensaio de saciedade 2-D com os machos recuperados e marcar seus cruzamentos (ou seja, cópulas) por apenas 1 h (ver resultados representativos). </li></ol>

<ol><li>Sturtevant, A. H., Bridges, C. B., Morgan, T. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16576369">The spatial relations of genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 5 (5), 168-173 (1919).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+Embryonic+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Embryonic Development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (1985).</li>
<li>Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+Approaches+to+Biological+Rhythms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Systems Approaches to Biological Rhythms in Drosophila.</a> Methods in Enzymology. 393, 61-185 (2005).</li>
<li>Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases in neuronal morphogenesis.</a> Nature reviews. Neuroscience. 1 (3), 173-180 (2000).</li>
<li>Schmucker, D., Clemens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Dscam+Is+an+Axon+Guidance+Receptor+Exhibiting+Extraordinary+Molecular+Diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila Dscam Is an Axon Guidance Receptor Exhibiting Extraordinary Molecular Diversity.</a> Cell. 101 (6), 671-684 (2000).</li>
<li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLH+proteins%2C+fly+neurogenesis%2C+and+vertebrate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HLH proteins, fly neurogenesis, and vertebrate myogenesis.</a> Cell. 75 (5), 827-830 (1993).</li>
<li>Stockinger, P., Kvitsiani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuitry+that+governs+Drosophila+male+courtship+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior.</a> Cell. 121 (5), 795-807 (2005).</li>
<li>Yu, J. Y., Kanai, M. I., Demir, E., Jefferis, G. S. X. E., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Organization+of+the+Neural+Circuit+that+Drives+Drosophila+Courtship+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%22%5BJournal%5D)">Cellular Organization of the Neural Circuit that Drives Drosophila Courtship Behavior.</a> Current biology. 20 (18), 1602-1614 (2010).</li>
<li>Zhou, C., Pan, Y., Robinett, C. C., Meissner, G. W., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+Brain+Neurons+Expressing+doublesex+Regulate+Female+Receptivity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Central Brain Neurons Expressing doublesex Regulate Female Receptivity in Drosophila.</a> Neuron. 83 (1), 149-163 (2014).</li>
<li>Rideout, E. J., Dornan, A. J., Neville, M. C., Eadie, S., Goodwin, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+sexual+differentiation+and+behavior+by+the+doublesex+gene+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Control of sexual differentiation and behavior by the doublesex gene in Drosophila melanogaster.</a> Nature neuroscience. 13 (4), 458-466 (2010).</li>
<li>Manoli, D. S., Foss, M., Villella, A., Taylor, B. J., Hall, J. C., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-specific+fruitless+specifies+the+neural+substrates+of+Drosophila+courtship+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Male-specific fruitless specifies the neural substrates of Drosophila courtship behaviour.</a> Nature. 436 (7049), 395-400 (2005).</li>
<li>Kimura, K. I., Ote, M., Tazawa, T., Yamamoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruitless+specifies+sexually+dimorphic+neural+circuitry+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fruitless specifies sexually dimorphic neural circuitry in the Drosophila brain.</a> Nature. 438 (7065), 229-233 (2005).</li>
<li>Cachero, S., Ostrovsky, A. D., Yu, J. Y., Dickson, B. J., Jefferis, G. S. X. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism in the fly brain.</a> Current biology. 20 (18), 1589-1601 (2010).</li>
<li>Clowney, E. J., Iguchi, S., Bussell, J. J., Scheer, E., Ruta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+Chemosensory+Circuits+Controlling+Male+Courtship+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multimodal Chemosensory Circuits Controlling Male Courtship in Drosophila.</a> Neuron. 87 (5), 1036-1049 (2015).</li>
<li>Kallman, B. R., Kim, H., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation+and+inhibition+onto+central+courtship+neurons+biases+Drosophila+mate+choice%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Excitation and inhibition onto central courtship neurons biases Drosophila mate choice.</a> eLife. 4, e11188(2015).</li>
<li>von Philipsborn, A. C., Liu, T., Yu, J. Y., Masser, C., Bidaye, S. S., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+control+of+Drosophila+courtship+song%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal control of Drosophila courtship song.</a> Neuron. 69 (3), 509-522 (2011).</li>
<li>Zhou, C., Franconville, R., Vaughan, A. G., Robinett, C. C., Jayaraman, V., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+neural+circuitry+mediating+courtship+song+perception+in+male+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Central neural circuitry mediating courtship song perception in male Drosophila.</a> eLife. 4, e08477(2015).</li>
<li>Kohatsu, S., Koganezawa, M., Yamamoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+contact+activates+male-specific+interneurons+that+trigger+stereotypic+courtship+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Female contact activates male-specific interneurons that trigger stereotypic courtship behavior in Drosophila.</a> Neuron. 69 (3), 498-508 (2011).</li>
<li>Kohatsu, S., Yamamoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visually+induced+initiation+of+Drosophila+innate+courtship-like+following+pursuit+is+mediated+by+central+excitatory+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Visually induced initiation of Drosophila innate courtship-like following pursuit is mediated by central excitatory state.</a> Nature Communications. 6, 6457(2015).</li>
<li>Fan, P., Manoli, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+neural+mechanisms+that+inhibit+Drosophila+from+mating+with+other+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic and neural mechanisms that inhibit Drosophila from mating with other species.</a> Cell. 154 (1), 89-102 (2013).</li>
<li>Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+class+of+olfactory+neurons+mediates+behavioural+responses+to+a+Drosophila+sex+pheromone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone.</a> Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).</li>
<li>Ejima, A., Smith, B. P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalization+of+Courtship+Learning+in+Drosophila+Is+Mediated+by+cis-Vaccenyl+Acetate%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Generalization of Courtship Learning in Drosophila Is Mediated by cis-Vaccenyl Acetate.</a> Current Biology. 17, 599-605 (2007).</li>
<li>Keleman, K., Vrontou, E., Krüttner, S., Yu, J. Y., Kurtovic-Kozaric, A., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neurons+modulate+pheromone+responses+in+Drosophila+courtship+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dopamine neurons modulate pheromone responses in Drosophila courtship learning.</a> Nature. 489 (7414), 145-149 (2012).</li>
<li>Pan, Y., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Identification+and+Separation+of+Innate+and+Experience-Dependent+Courtship+Behaviors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic Identification and Separation of Innate and Experience-Dependent Courtship Behaviors in Drosophila.</a> Cell. 156 (1-2), 236-248 (2014).</li>
<li>Zhang, S. X., Rogulja, D., Crickmore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+Circuitry+Underlying+Mating+Drive%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic Circuitry Underlying Mating Drive.</a> Neuron. 91 (1), 168-181 (2016).</li>
<li>Bowers, M. B., Van Woert, M., Davis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+behavior+during+L-dopa+treatment+for+Parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+psychiatry%22%5BJournal%5D)">Sexual behavior during L-dopa treatment for Parkinsonism.</a> The American journal of psychiatry. 127 (12), 1691-1693 (1971).</li>
<li>Sacks, O. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSacks%2C+OW+%22Awakenings%22">Awakenings</a>. , Vintage Books. New York. (1999).</li>
<li>Dietzl, G., Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).</li>
<li>Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+dopaminergic+and+GABAergic+neurons+control+the+duration+and+persistence+of+copulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Opposing dopaminergic and GABAergic neurons control the duration and persistence of copulation in Drosophila.</a> Cell. 155 (4), 881-893 (2013).</li>
<li>Peng, J., Chen, S., Busser, S., Liu, H., Honegger, T., Kubli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradual+Release+of+Sperm+Bound+Sex-Peptide+Controls+Female+Postmating+Behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%22%5BJournal%5D)">Gradual Release of Sperm Bound Sex-Peptide Controls Female Postmating Behavior in Drosophila.</a> Current biology. 15 (3), 207-213 (2005).</li>
<li>Yapici, N., Kim, Y. J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+receptor+that+mediates+the+post-mating+switch+in+Drosophila+reproductive+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour.</a> Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).</li>
<li>Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Sensillum+Recordings+in+the+Insects+Drosophila+melanogaster+and+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae.</a> Journal of Visualized Experiments. 36 (36), 1-5 (2010).</li>
<li>Cook, R., Cook, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Attractiveness+to+males+of+female+Drosophila+melanogaster%3A+effects+of+mating%2C+age+and+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+behaviour%22%5BJournal%5D)">The Attractiveness to males of female Drosophila melanogaster: effects of mating, age and diet.</a> Animal behaviour. 23, 521-526 (1975).</li>
<li>Toates, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aToates%2C+FM+%22Motivational+Systems+%28Problems+in+the+Behavioural+Sciences%29%22">Motivational Systems (Problems in the Behavioural Sciences)</a>. , (1986).</li>
<li>Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mating+of+a+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The mating of a fly.</a> Science. 264 (5166), 1702-1714 (1994).</li>
<li>Simpson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+manipulating+neural+circuits+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+genetics%22%5BJournal%5D)">Mapping and manipulating neural circuits in the fly brain.</a> Advances in genetics. 65 (9), 79-143 (2009).</li>
<li>Venken, K. J. T., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Manipulation+of+Genes+and+Cells+in+the+Nervous+System+of+the+Fruit%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic Manipulation of Genes and Cells in the Nervous System of the Fruit.</a> Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).</li>
<li>Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Bellen, H. J., Levis, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BDGP+gene+disruption+project%3A+single+transposon+insertions+associated+with+40%25+of+Drosophila+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The BDGP gene disruption project: single transposon insertions associated with 40% of Drosophila genes.</a> Genetics. 167 (2), 761-781 (2004).</li>
<li>Spradling, A. C., Stern, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Berkeley+Drosophila+Genome+Project+gene+disruption+project%3A+Single+P-element+insertions+mutating+25%25+of+vital+Drosophila+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes.</a> Genetics. 153 (1), 135-177 (1999).</li>
<li>Parks, A. L., Cook, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+generation+of+high-resolution+deletion+coverage+of+the+Drosophila+melanogaster+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome.</a> Nature genetics. 36 (3), 288-292 (2004).</li>
<li>Matthews, K. A., Kaufman, T. C., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+resources+for+Drosophila%3A+the+expanding+universe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Research resources for Drosophila: the expanding universe.</a> Nature reviews. Genetics. 6 (3), 179-193 (2005).</li>
<li>Ni, J. Q., Liu, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+resource+of+transgenic+RNAi+lines+for+neurogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics.</a> Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).</li>
<li>Ni, J. Q., Zhou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-scale+shRNA+resource+for+transgenic+RNAi+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila.</a> Nature. 8 (5), 405-407 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Estados motivacionais pode ser saciado, mantidos e recuperados 34. Nós apresentamos um ensaio de saciedade 2-D que rapidamente e de forma robusta mede todos esses aspectos do acasalamento unidade na mosca. Este ensaio abre-se a possibilidade de utilizar mosca avançada manipulações genéticas para estudar os componentes moleculares e um circuito de comportamento motivado. O ensaio de saciedade confia na capacidade do homem para o tribunal com sucesso e copular, e para t...

Trabalho em Drosophila tem proporcionado uma visão profunda e pioneira em muitos fenómenos biológicos, incluindo a natureza do gene 1, os princípios do desenvolvimento embrionário 2, ritmos circadianos 3, bem como o desenvolvimento e a fiação do sistema nervoso 4, 5, 6. A motivação permanece bastante menos conhecidas do que estes fenómenos, talvez por causa das limitações dos sistemas que foram estudados até agora. A motivação da mosca é estudado principalmente no contexto de fome, que apresenta diversos desafios devido a sua ingestão de alimentos muito pequeno por ataque de alimentação e impede que exoesqueleto sinais evidentes de deposição de gordura. Por conseguinte, existe uma necessidade de expandir os sistemas utilizados para estudar a motivação em tempo real. Nós descrevemos um quadro comportamental para o estudo da unidade de acasalamento emDrosophila. Este sistema tira vantagem das ferramentas neurogenéticos em tempo real, bem como a acessibilidade 7, 8, 9, 10, 11, 12 e o putativo conectoma de seus circuitos dimorfismo sexual 8, 13. Além disso, grande parte da inata 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 e aprendeu 22, 23, 24 circuito sensório-motor namoro controle foi elaborado em detalhes, proporcionando uma rara oportunidadepara localizar o nó de circuito exato em que a motivação colide. Recentemente, relatou que, em tempo real, como nos seres humanos, os níveis de dopamina são centrais para a unidade de acoplamento 25, 26, 27. Ganhamos o acesso genética para o nível do circuito molecular-e detalhada e recebimento de neurônios na mosca, facilitando produtoras de dopamina relevantes análises deste fenómeno conservada utilizando os ensaios aqui descrita 25. Nós adicionar aos ensaios comportamentais em Zhang et ai. 25 uma nova arena comportamental plana que permite pontuação de vídeo, que chamamos de um ensaio de saciedade 2-dimensional (2-D), uma importante melhoria em relação aos métodos anteriores. Consequentemente, o novo ensaio é mais escalável e quantificável e, portanto, mais adequado para telas genéticas de genes e de neurônios envolvidas na motivação. Usamos este novo ensaio, juntamente com ensaios de namoro e neurogemanipulações magnética, para demonstrar como medir e alterar unidade de acasalamento na mosca.

<table><tbody><tr><td>Acrílico transparente de 1/16 polegada</td><td>McMaster-Carr</td><td>8589K12</td><td>Usado para fazer arenas; veja Material Suplementar 1 para designs.</td></tr><tr><td>Acrílico transparente de 1/8 de polegada</td><td>McMaster-Carr</td><td>8589K42</td><td>Usado para fazer arenas; veja Material Suplementar 1 para designs.</td></tr><tr><td>Acrílico transparente de 3/16 polegada</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K219</td><td>Usado para fazer arenas; veja Material Suplementar 1 para designs.</td></tr><tr><td>1/32 polegada preto delrin</td><td>McMaster-Carr</td><td>8575K132</td><td>Usado para fazer arenas; veja Material Suplementar 1 para designs.</td></tr><tr><td>Parafusos hexagonais, 1 polegada de comprimento (50x)</td><td>McMaster-Carr</td><td>92314A115&nbsp;</td><td>Usado para fazer arenas. Pode ser substituído por parafusos de 3/4 de polegada (92314A113, McMaster-Carr) para arenas de 32 câmaras.</td></tr><tr><td>Porcas de polegar (25x)</td><td>McMaster-Carr</td><td>92741A100</td><td>Usado para fazer arenas. Pode ser substituído por porcas sextavadas regulares (90480A005, McMaster-Carr).</td></tr><tr><td>Filmadora</td><td>Canon</td><td>Vixia HF R700</td><td>Pode ser substituída por qualquer câmera de consumo.</td></tr></tbody></table>

medir e alterando acasalamento drive em male<em&gt; drosophila melanogaster</em

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Apesar de décadas de investigação, as bases neuronais e moleculares de estados motivacionais permanecem misteriosas. Recentemente, desenvolvemos um romance, reducionista e sistema escalável para investigação aprofundada de motivação usando a unidade de acasalamento dos machos Drosophila melanogaster (Drosophila), os métodos para as quais detalhes aqui. O paradigma comportamental centra-se na constatação de que a unidade de acasalamento dos machos diminui ao lado de fertilidade ao longo de cópulas repetidas e recupera mais ~ 3 d. Neste sistema, as poderosas ferramentas neurogenéticos disponíveis na mosca convergir com a acessibilidade genética e esquema de ligação putativo disponíveis para o comportamento sexual. Esta convergência permite o isolamento rápido e interrogatório de pequenas populações neuronais com funções motivacionais específicos. Aqui nós detalhe a concepção e execução do ensaio saciedade que é usado para medir e alterar a motivação corte na mosca masculino. usando esteensaio, que também demonstram que a baixa unidade de acasalamento dos machos pode ser superado através da estimulação neurónios dopaminérgicos. O ensaio de saciedade é simples, acessível e robusto às influências de fundo genético. Esperamos que o ensaio de saciedade para gerar muitos novos insights sobre a neurobiologia de estados motivacionais.

Para caracterizar unidade de acoplamento de Drosophila, de 3 dias de idade, Canton WT-S machos foram testados num ensaio de saciedade 2-D. Durante o curso do ensaio (4,5 h), machos acasalam uma média de 4,8 ± 0,3 (média ± erro padrão da média, SEM) vezes. Acasalamentos iniciar principalmente nas primeiras 2 h (78%) (Figura 6A, 6B) e tornam-se menos frequentes como o ensaio avança (Figura 6A, 6B). Esta redução não é devido à falta de parceiros de...

Este artigo descreve um ensaio comportamental que utiliza a unidade de acasalamento dos machos em Drosophila melanogaste r para estudar motivação. Usando este método, os pesquisadores podem utilizar técnicas neurogenéticos mosca avançada para descobrir os mecanismos genéticos, moleculares e celulares que fundamentam essa motivação.

Medir e alterando Acasalamento Drive em Male<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, ...

O objetivo geral deste ensaio é medir e manipular a motivação reprodutiva de machos de Drosophila para examinar a motivação em um sistema reducionista. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no estudo da motivação, como quais genes e neurônios controlam a motivação reprodutiva, revelando potencialmente a lógica subjacente aos circuitos motivacionais. A principal vantagem deste método é que ele fornece um ensaio de alto rendimento para medir a motivação reprodutiva, que pode ser usado em conjunto com as poderosas ferramentas genéticas disponíveis na mosca-das-frutas.Pelo menos três dias antes de um ensaio de saciedade em 2-D, prepare moscas fêmeas a partir de um frasco de estoque de moscas brancas 11 18 com choque térmico hid. Assim que 20 a 50% das pupas tiverem emergido e houver pelo menos cinco machos para propagar o estoque, transfira as moscas para um novo frasco. Em seguida, submeta o frasco original a choque térmico em banho-maria a 37 graus Celsius por uma hora para ativar suficientemente o choque térmico hid e eliminar larvas e pupas machos.Após o choque térmico, apenas fêmeas emergirão desses frascos. Para preparar a arena para os experimentos, monte pa

measuring-and-altering-mating-drive-in-male-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Diferencial esperma capacidade competitiva...

Avaliar as diferenças na capacidade competitiva do esperma em<em&gt; Drosophila</em

Este protocolo descreve uma maneira simples e econômica de identificar individualmente Drosophila ou outros insetos. Dados de demonstração que investigam o sucesso do acasalamento em três espécies de Drosophila mostram que este método é comparável ou melhor do que o uso de anestesia com CO2.

Tingimento Insetos para Comportamentais Ensaios: o comportamento de acasalamento dos anestesiado<em&gt; Drosophila</em

O efeito dos genes e do ambiente no espaço social de Drosophila melanogaster pode ser quantificado por meio de um paradigma analítico poderoso, mas direto. Mostramos aqui diferentes fatores que podem afetar esse espaço social e, portanto, precisam ser levados em consideração ao projetar experimentos nesse paradigma.

Condições que afetam Espaço Social em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Durante mosca de fruta lutas, os padrões comportamentais observados, luta dinâmica e aprendizagem e memória associada são influenciadas pelas condições experimentais. O protocolo aqui apresentado descreve um novo procedimento que elimina totalmente a manipulação de moscas durante as experiências. Isso melhora a dinâmica de luta e permite a formação de efeitos fortes "loser".

Uma nova abordagem que elimina a manipulação de Estudos de Agressão e Efeito &quot;perdedor&quot; em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Este protocolo descreve um ensaio de alto rendimento para testar as preferências de postura de ovos de Drosophila melanogaster em resolução de um único animal.  Este ensaio fornece uma plataforma simples, eficiente e escalável para identificar genes e componentes de circuitos que controlam um processo simples de tomada de decisão.

High Throughput Ensaio para examinar Preferências de postura de Pessoa<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Nós descrevemos um protocolo para induzir gratificante e nonrewarding experiências em moscas da fruta (Drosophila melanogaster), utilizando o consumo de etanol voluntária como uma medida de mudanças nos estados de recompensa.

Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Demonstramos um ensaio para analisar as pistas ambientais e genéticas que influenciam o comportamento de acasalamento na mosca da fruta Drosophila melanogaster .

Um método para testar o efeito de sugestões ambientais no comportamento de acoplamento em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Este protocolo descreve um ensaio de aprendizagem e memória de Drosophila chamado condicionamento de namoro. Este ensaio clássico baseia-se numa redução do comportamento do namoro masculino após a rejeição sexual por uma mulher pré-administrada não receptiva. Essa forma natural de plasticidade comportamental pode ser usada para testar aprendizado, memória de curto prazo e memória de longo prazo.

Drosophila Courtship Acondicionamento Como Medida de Aprendizagem e Memória

O objetivo geral desses procedimentos é para estabelecer, manter e atualizar uma população em cativeiro de Eristalis tenax em um ambiente de pesquisa.

Criação e manutenção de longo prazo de Eristalis tenax Hoverflies para estudos de investigação

Este protocolo é projetado avaliar a viabilidade de Drosophila em cada estágio desenvolvente, do embrião ao adulto. O método pode ser utilizado para determinar e comparar a viabilidade de diferentes genótipos ou condições de crescimento.

Um método direto e simples para avaliar a viabilidade da Drosophila melanogasterdo embrião ao adulto

Aprenda a medir e manipular o impulso de acasalamento em machos de Drosophila melanogaster usando ensaios comportamentais de alta vazão. Este método integra ferramentas genéticas avançadas para estudar os mecanismos neurais da motivação.

Medir e alterando Acasalamento Drive em Male

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