Polidimetilsiloxano-policarbonato microfluídicos para celular Estudos Migratórios Sob Perpendicular Chemical e gradientes de oxigênio

O objetivo geral deste experimento é estabelecer um dispositivo microfluídico de polidimetilsiloxano-policarbonato para estudar a migração de células de mamíferos sob diversas combinações de gradientes perpendiculares de substâncias químicas e oxigênio. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nos estudos de migração celular de mamíferos, incluindo os efeitos desses gradientes na migração de diferentes tipos de células ou células com outros genes. A principal vantagem desta técnica é que todo o arranjo experimental pode ser conduzido em uma incubadora convencional, proporcionando condições ideais de cultivo celular, sem a necessidade de montagens trabalhosas ou instrumentação volumosa.

As implicações desta técnica estendem-se ao diagnóstico da capacidade de metástase de células cancerígenas, uma vez que a motilidade celular e os diversos gradientes relacionados fisiologicamente podem ser caracterizados utilizando o dispositivo microfluídico. Este método pode fornecer informações sobre a migração de células de mamíferos. Também pode ser aplicado a outros estudos celulares, como testes de fármacos baseados em células in vitro com combinações de concentrações de fármacos e tensões de oxigênio.

Transfira dois gramas de polidimetilsiloxano, ou pré-polímero de PDMS, para a matriz com os padrões do canal fluidico da camada superior para formar uma camada fina de PDMS. Em seguida, coloque a matriz em um dessecador para desgaseificar o PDMS durante 60 minutos. Após a desgaseificação, deixe a matriz durante a noite em uma estufa a 60 graus Celsius para a cura do PDMS.

Certifique-se de que a matriz esteja em um plano horizontal. Após resfriar a matriz até a temperatura ambiente, despeje adicionais 13 gramas de pré-polímero de PDMS sobre a matriz e, em seguida, desgaseifique o PDMS no conjunto de dessecador por 60 minutos. Insira lentamente uma película de policarbonato, ou filme de PC, com um milímetro de espessura, na camada fresca de PDMS como barreira de difusão de gases.

Elimine todas as bolhas que estiverem presentes. Em seguida, coloque o molde no forno a 60 graus Celsius durante a noite. Certifique-se de que o molde esteja sobre um plano horizontal.

Após resfriar a PDMS curada até a temperatura ambiente, corte o dispositivo com um bisturi em uma área de aproximadamente 5,5 por cinco centímetros quadrados, suficiente para cobrir todos os padrões de canal. Em seguida, retire cuidadosamente a peça de PDMS do molde. Depois, faça furos para as entradas e saídas utilizando um furador de biópsia de dois milímetros de diâmetro.

Guarde a camada superior de PDMS-PC fabricada longe da poeira ambiente para montagem posterior. Para montar o dispositivo, coloque primeiro a camada superior de PDMS-PC fabricada e a pastilha com a membrana de PDMS spinada na máquina de tratamento superficial por plasma de oxigênio, com as superfícies de ligação voltadas para cima. Trate as superfícies de PDMS com plasma de oxigênio de 90 watts por 40 segundos.

Una a camada superior à membrana de PDMS imediatamente após o tratamento superficial com plasma de oxigênio. Coloque um peso sobre as camadas unidas e coloque-as em uma estufa a 60 graus Celsius durante a noite para promover a ligação. Depois que as camadas unidas esfriarem até a temperatura ambiente, corte a membrana ligada à camada superior com um bisturi em uma área de aproximadamente 5,5 por cinco centímetros quadrados.

Retire a estrutura ligada da lâmina de silício e faça furos nas entradas e saídas do canal de gradiente químico usando um furador de biópsia de dois milímetros de diâmetro. Em seguida, coloque a camada superior com membrana ligada e a camada inferior de PDMS fabricada na máquina de tratamento superficial por plasma de oxigênio, com as superfícies de ligação voltadas para cima. Para ativar as superfícies de PDMS, use o plasma a 90 watts por 40 segundos.

Una as camadas superior e inferior imediatamente após o tratamento superficial para promover a ligação. Coloque um peso sobre todo o dispositivo ligado e deixe-o durante a noite em um forno a 60 graus Celsius. No dia seguinte, retire todo o dispositivo fabricado do forno e deixe esfriar até a temperatura ambiente.

Inicie o ensaio de migração celular em microfluido com o preparo das células no dispositivo, conforme descrito no protocolo textual. No segundo dia, aspire o meio das células que foram cultivadas desde o dia zero e lave as células duas vezes com cinco mililitros de DPBS. Aspire o DPBS e adicione dois mililitros de tripsina-EDTA, incubando então as células no incubador por cinco minutos para destacar as células da superfície do frasco.

Uma vez que as células estejam destacadas e suspensas na solução, adicione oito mililitros de meio sem soro ao frasco. Transfira todos os líquidos para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue a 140 × g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, aspire o sobrenadante e adicione uma quantidade apropriada de meio sem soro para obter uma densidade celular final de um milhão de células por mililitro.

Em seguida, retire o dispositivo microfluídico preparado no primeiro dia conforme descrito no protocolo textual. Utilize uma seringa de um mililitro com agulha romba de 14 gauge para injetar o meio livre de soro através da saída do canal de gradiente químico até que o meio saia por ambas as agulhas nas entradas. Em seguida, injete 200 microlitros da suspensão celular pela saída do canal de gradiente químico.

Observe a câmara de cultivo celular no dispositivo sob microscópio para confirmar que as células foram introduzidas no canal microfluídico. Em seguida, coloque o dispositivo em um recipiente umidificado e mantenha-o em uma incubadora de cultivo celular por cinco horas para promover a adesão das células à superfície do dispositivo. Enquanto isso, prepare o composto químico na concentração desejada em meio sem soro.

Aspire o meio sem soro, com e sem o produto químico, para duas seringas separadas de três mililitros conectadas a um tubo de alta pureza. Em seguida, monte as seringas em uma bomba de seringa com uma taxa de fluxo de um microlitro por minuto para uso posterior. A seguir, prepare 15 mililitros de uma solução de hidróxido de sódio um molar e 15 mililitros de uma solução de pirogalol a 200 miligramas por mililitro.

Aspire a solução de hidróxido de sódio para dentro de uma seringa de 15 mililitros conectada a um tubo de PFTE de alta pureza e aspire a solução de pirogalol para dentro de uma seringa de 15 mililitros conectada a um tubo de alta pureza. Monte as seringas em uma bomba de seringa com uma taxa de fluxo de cinco microlitros por minuto para uso posterior. Após a incubação de cinco horas, retire todo o dispositivo e coloque-o em uma placa de Petri com diâmetro de 15 centímetros.

Fixe o dispositivo na placa de Petri usando massa adesiva, em seguida transfira a placa de Petri para um microscópio de imagem em tempo real com células vivas dentro de uma incubadora. Conecte as tubulações das seringas às entradas do canal de gradiente químico para a geração do gradiente químico. Depois, conecte a saída à tubulação que conduz a um reservatório de resíduos.

Ligue a bomba de seringa com as seringas para geração do gradiente químico. Em seguida, conecte a tubulação de alta pureza proveniente das seringas contendo cloreto de sódio e pirogalol às entradas do canal de gradiente de oxigênio. Conecte a tubulação à saída para coletar o resíduo e ligue a bomba de seringa com as seringas para geração do gradiente de oxigênio.

Adicione cerca de 15 mililitros de água destilada duas vezes ao recipiente de Petri para manter o dispositivo hidratado. Em seguida, configure o microscópio de imagem em células vivas para captura de imagens com lapso de tempo e tire uma imagem a cada 15 minutos. Realize a coleta e análise de dados, bem como a caracterização de gradientes, conforme descrito no protocolo do texto.

Mostrados aqui estão resultados representativos de gradientes químicos gerados dentro do dispositivo microfluídico para migração celular. O resultado da simulação numérica concorda bem com a caracterização experimental utilizando solução de fluoresceína como o composto químico. Os gradientes de outras substâncias químicas, como a quimiocina SDF-1 alpha, também podem ser estimados previamente usando a simulação.

Os gradientes de oxigênio gerados dentro do dispositivo podem ser caracterizados experimentalmente utilizando corante fluorescente sensível ao oxigênio. Geralmente, gradientes de oxigênio de 1% a montante até 16% a jusante podem ser estabelecidos de forma estável dentro do dispositivo. São mostradas aqui imagens típicas com intervalo de tempo coletadas durante os experimentos usando um microscópio de imagem em células vivas.

Após a análise da imagem, podem ser calculadas as trajetórias de migração das células A549 e seus movimentos médios. Na ausência de gradientes, as células exibem migração aleatória e o movimento médio é próximo a zero. Com apenas um gradiente do quimioatraente SDF-1 alpha, as células demonstram comportamento quimiotático e migram na direção do gradiente mais alto de quimioatraente, conforme esperado.

Com apenas um gradiente de oxigênio, as células se movem na direção de baixa concentração de oxigênio, demonstrando um comportamento aerotático que ainda não foi bem estudado em células de mamíferos. Curiosamente, na presença de gradientes de quimiocinas e de oxigênio, as células se movem em direção ao gradiente de baixo oxigênio, mostrando que o gradiente de oxigênio exerce efeitos dominantes. Essa observação exige estudos adicionais.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de nivelar bem o dispositivo durante a fabricação e eliminar bolhas de ar na montagem do dispositivo microfluídico durante o experimento de migração celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar um dispositivo microfluídico PDMS-PC e montar os experimentos para estudar a migração de células de mamíferos sob combinações de gradientes químicos e de oxigênio.