Polidimetilsiloxano-policarbonato microfluídicos para celular Estudos Migratórios Sob Perpendicular Chemical e gradientes de oxigênio

O objetivo geral deste experimento é estabelecer um dispositivo microfluídico de polidimetilsiloxano-policarbonato para a migração de células de mamíferos sob várias combinações de gradientes químicos e de oxigênio perpendiculares. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em estudos de migração de células de mamíferos, incluindo os efeitos desses gradientes na migração de diferentes tipos de células ou células com genes ote. A principal vantagem dessa técnica é que toda a configuração experimental pode ser conduzida em uma incubadora convencional para condições ideais de cultura de células sem configuração tediosa e instrumentação volumosa.

As implicações desta técnica se estenderam ao diagnóstico da capacidade de metástase de células cancerígenas, pois a motilidade celular e os vários gradientes fisiologicamente relacionados podem ser caracterizados usando o dispositivo microfluídico. Este método pode fornecer informações sobre a migração de células de mamíferos. Também pode ser aplicado a outros estudos celulares, como testes de drogas baseadas em células in vitro nas combinações de concentrações de drogas e tensões de oxigênio.

Transfira dois gramas de polidimetilsiloxano ou pré-polímero PDMS para o molde com os padrões de canal fluídico da camada superior para formar uma fina camada de PDMS. Em seguida, coloque o molde em uma configuração de dessecador para desgaseificar o PDMS por 60 minutos. Após a desgaseificação, coloque o molde durante a noite em um forno a 60 graus Celsius para cura PDMS.

Certifique-se de que o molde esteja em um plano horizontal. Depois de resfriar o molde à temperatura ambiente, despeje mais 13 gramas de pré-polímero PDMS no molde e, em seguida, desgaseifique o PDMS na configuração do dessecador por 60 minutos. Imbed lentamente um policarbonato de um milímetro de espessura ou filme de PC na camada PDMS fresca como uma barreira de difusão de gás.

Expulse todas as bolhas presentes. Em seguida, coloque o molde no forno a 60 graus Celsius durante a noite. Certifique-se de que o molde esteja em um plano horizontal.

Depois de resfriar o PDMS curado à temperatura ambiente, corte o dispositivo com um bisturi em uma área de aproximadamente 5.5 por cinco centímetros quadrados que pode cobrir todos os padrões de canal. Em seguida, retire o laboratório PDMS do molde. Em seguida, faça furos para entradas e saídas usando um punção de biópsia de dois milímetros de diâmetro.

Armazene a camada superior fabricada do PDMS-PC longe da poeira ambiente para montagem posterior. Para montar o dispositivo, primeiro coloque a camada superior PDMS-PC fabricada e o wafer com a membrana PDMS codificada por rotação em uma máquina de tratamento de superfície de plasma de oxigênio com as superfícies de colagem voltadas para cima. Trate as superfícies do PDMS com 90 watts de plasma de oxigênio por 40 segundos.

Cole a camada superior na membrana PDMS imediatamente após o tratamento da superfície do plasma de oxigênio. Coloque um peso no topo das camadas coladas e coloque-as em um forno a 60 graus Celsius durante a noite para promover a colagem. Depois que as camadas coladas esfriarem à temperatura ambiente, corte a membrana ligada à camada superior com um bisturi em uma área de aproximadamente 5,5 por cinco centímetros quadrados.

Retire a estrutura colada do wafer de silício e faça furos nas entradas e saídas do canal de gradiente químico usando um punção de biópsia de dois milímetros de diâmetro. Em seguida, coloque a camada superior ligada por membrana e a camada inferior PDMS fabricada na máquina de tratamento de superfície de plasma de oxigênio com as superfícies de colagem voltadas para cima. Para ativar as superfícies PDMS, use o plasma a 90 watts por 40 segundos.

Prenda as camadas superior e inferior para colagem imediatamente após o tratamento de superfície. Coloque o peso em cima de todo o dispositivo colado e deixe-o durante a noite em um forno a 60 graus Celsius. No dia seguinte, retire todo o dispositivo fabricado do forno e resfrie-o à temperatura ambiente.

Comece o ensaio de migração celular microfluídica preparando as células no dispositivo, conforme descrito no protocolo de texto. No segundo dia, aspire o meio das células que foram cultivadas desde o dia zero e lave as células com cinco mililitros de DPBS duas vezes. Aspire o DPBS e adicione dois mililitros de tripsina-EDTA, em seguida, incube as células na incubadora por cinco minutos para separar as células da superfície do frasco.

Uma vez que as células estejam destacadas e suspensas na solução, adicione oito mililitros de meio isento de soro ao frasco. Transferir todos os líquidos para um tubo cónico de 15 mililitros e centrifugar a 140 vezes G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e adicionar uma quantidade adequada de meio isento de soro para obter uma densidade celular final de um milhão de células por mililitro.

Em seguida, retire o dispositivo microfluídico preparado no primeiro dia, conforme descrito no protocolo de texto. Use uma seringa de um mililitro com uma agulha romba de calibre 14 para injetar o meio sem soro através da saída do canal de gradiente químico até que o meio flua de ambas as agulhas nas entradas. Em seguida, injete 200 microlitros da suspensão celular da saída do canal de gradiente químico.

Observe a câmara de cultura de células no dispositivo sob um microscópio para confirmar se as células foram introduzidas no canal microfluídico. Em seguida, coloque o dispositivo em um recipiente úmido e mantenha-o em uma incubadora de cultura de células por cinco horas para promover a adesão das células na superfície do dispositivo. Enquanto isso, prepare o produto químico na concentração desejada em meio sem soro.

Desenhe o meio sem soro com e sem o produto químico em duas seringas separadas de três mililitros conectadas ao tubo de alta pureza. Em seguida, coloque as seringas em uma bomba de seringa com uma vazão de um microlitro por minuto para uso posterior. Em seguida, faça 15 mililitros de uma solução de hidróxido de sódio de um molar e 15 mililitros de 200 miligramas por mililitro de solução de pirogalol.

Aspire a solução de hidróxido de sódio em uma seringa de 15 mililitros conectada a um tubo PFTE de alta pureza e puxe a solução de pirogalol em uma seringa de 15 mililitros conectada a um tubo de alta pureza. Configure as seringas em uma bomba de seringa com vazão de cinco microlitros por minuto para uso posterior. Após a incubação de cinco horas, retire todo o dispositivo e coloque-o em uma placa de Petri de 15 centímetros de diâmetro.

Fixe o dispositivo na placa de Petri usando massa adesiva e, em seguida, transfira a placa de Petri para um microscópio de imagem de células vivas em uma incubadora. Conecte a tubulação das seringas às entradas do canal de gradiente químico para geração do gradiente químico. Em seguida, conecte a saída à tubulação que leva a um reservatório de resíduos.

Ligue a bomba da seringa com as seringas para geração de gradiente químico. Em seguida, conecte o tubo de alta pureza das seringas contendo cloreto de sódio e pirogalol às entradas do canal de gradiente de oxigênio. Conecte a tubulação à saída para coletar os resíduos e ligue a bomba da seringa com as seringas para geração de gradiente de oxigênio.

Adicione cerca de 15 mililitros de água bidestilada à placa de Petri para manter o dispositivo hidratado. Em seguida, configure o microscópio de imagem de células vivas para captura de imagem com lapso de tempo e tire uma imagem a cada 15 minutos. Realizar coleta e análise de dados, bem como caracterização de gradientes conforme descrito no protocolo de texto.

Aqui são mostrados resultados representativos de gradientes químicos gerados dentro do dispositivo microfluídico para migração celular. O resultado da simulação numérica concorda bem com a caracterização experimental usando solução de fluoresceína como produto químico. Os gradientes de outros produtos químicos, como a quimiocina SDF-1 alfa, também podem ser estimados de antemão usando a simulação.

Os gradientes de oxigênio gerados dentro do dispositivo podem ser caracterizados experimentalmente usando corante de fluorescência sensível ao oxigênio. Normalmente, gradientes de oxigênio de 1% a montante a 16% a jusante podem ser estabelecidos de forma estável dentro do dispositivo. Aqui são mostradas imagens típicas de lapso de tempo coletadas durante os experimentos usando um microscópio de imagem de células vivas.

Após a análise da imagem, as trajetórias de migração das células A549 e seus movimentos médios podem ser calculados. Sem gradientes, as células mostram migração aleatória e o movimento médio é próximo de zero. Com apenas um gradiente de quimiocina alfa SDF-1, as células mostram comportamento quimiotático e migram para a direção do gradiente de alta quimiocina conforme o esperado.

Com apenas um gradiente de oxigênio, as células se movem na direção de baixo oxigênio, mostrando um comportamento aerotático que não foi bem estudado para células de mamíferos. Curiosamente, com gradientes de quimiocina e oxigênio, as células se movem em direção ao gradiente de baixo oxigênio, mostrando que o gradiente de oxigênio tem efeitos dominantes. Esta observação requer um estudo mais aprofundado.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de nivelar bem o dispositivo durante a fabricação e eliminar bolhas de ar dentro da configuração do dispositivo microfluídico durante o experimento de migração celular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar um dispositivo microfluídico PDMS-PC e configurar os experimentos para estudar a migração de células de mamíferos sob combinações de gradientes químicos e de oxigênio.