Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

O objetivo geral deste procedimento é estudar as propriedades elétricas de células excitáveis em condições fisiológicas não invasivas, utilizando embriões de peixe-zebra juntamente com um indicador de voltagem baseado em FRET. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a biologia de células excitáveis, como os neurônios. Por exemplo, este método pode ser usado para analisar o papel da excitabilidade na patogênese de distúrbios neurológicos.

Esta abordagem utiliza embriões transparentes de peixe-zebra que expressam indicadores genéticos de voltagem baseados em FRET. O método permite a medição das propriedades elétricas das células in vivo de forma não invasiva. Assim, este método pode fornecer informações sobre a excitabilidade dos neurônios espinais em embriões de peixe-zebra.

Também pode ser aplicado a outros sistemas in vitro ou in vivo passíveis de estudos de imagem. Para iniciar este procedimento, prepare a mistura de PCR para amplificar a sequência codificadora do biossensor Mermaid. Aqueça a mistura de PCR por 15 segundos a 95 graus Celsius.

Prima por 15 segundos a 50 graus Celsius e alongue por quatro minutos a 72 graus Celsius, num total de 35 ciclos. Em seguida, purifique em gel o produto PCR rombo específico utilizando um kit comercial de purificação em gel. Então, clone o fragmento de DNA no vetor pCMV-SC rombo e linearize o plasmídeo positivo para Mermaid com a enzima de restrição SmaI para a inserção do promotor HuC.

Prepare a reação de restrição em um volume total de 20 microlitros e incube a reação a 25 graus Celsius por uma hora. Em seguida, purifique em gel o plasmídeo digerido utilizando um kit comercial de purificação em gel. Então, amplifique por PCR o promotor HuC com a DNA polimerase PFU e o DNA genômico de peixe-zebra como molde.

Prepare a mistura de PCR. Após uma etapa inicial de dois minutos a 95 graus Celsius, aqueça a mistura de PCR por 15 segundos a 95 graus Celsius. Hibilize-a por 15 segundos a 50 graus Celsius e elongue-a por quatro minutos a 72 graus Celsius, totalizando 35 ciclos.

Em seguida, purifique o produto específico da PCR em extremidade romba por eletroforese em gel. Ligue quantidades equimolares do pCMV-SC Mermaid purificado e do DNA pHuC utilizando um microlitro de ligase T4 de DNA e um microlitro do tampão específico 10x em um volume total de 10 microlitros. Incube a reação posteriormente por 16 horas a quatro graus Celsius.

Transforme uma alíquota de células competentes com cinco microlitros da reação de ligação. Selecione os clones positivos para pHuC com o promotor inserido na orientação correta por meio de digestão dupla com CEL1-EcoRV. Transfira os clones para tubos de 15 mililitros e incube-os a 37 graus Celsius durante a noite.

Em seguida, extraia o plasmídeo das células e monte a reação de dupla restrição CEL1-EcoRV, incubando-a a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, execute as reações em um gel de agarose. Neste procedimento, transfira os ovos fertilizados obtidos de peixes-zebra adultos do tipo selvagem ou sod1G93R para uma placa de Petri de 10 milímetros.

Lave os embriões em água fria para peixes. Em seguida, injete imediatamente 200 picogramas do plasmídeo pHuC-Mermaid no vitelo por microinjeção. Em seguida, transfira os embriões para uma placa de Petri e incube-os em água para peixes a 28 graus Celsius até atingirem o estágio de desenvolvimento desejado para as análises seguintes.

Para uma análise espontânea de enrolamento da cauda, transfira os embriões para uma placa de Petri redonda de 90 milímetros contendo água para peixes com 0,2% de DMSO. E remova manualmente a corion com duas pinças de ourives com pontas afiadas ou agulhas. Posteriormente, incube os embriões por cinco minutos a 28 graus Celsius.

Usando uma câmera digital acoplada a um estereomicroscópio, detecte a enrolamento da cauda à temperatura ambiente durante uma gravação de vídeo de um minuto. Em seguida, adquira a série temporal com uma resolução temporal de 30 quadros por segundo. Então, calcule a frequência dos enrolamentos espontâneos da cauda contando o número de dobras por unidade de tempo.

Para avaliar o efeito do fármaco riluzol, transfira os embriões para um novo recipiente de Petri de 90 milímetros contendo água para peixes com riluzol a cinco micromolares. Em seguida, incube os embriões por cinco minutos a 28 graus Celsius antes de gravar um vídeo de um minuto e realizar a análise comportamental. Agora, monte os embriões de 20 a 24 hpf em agarose de ponto de fusão baixo a um por cento em água para peixes dentro de um recipiente de imagem de 35 milímetros com fundo de vidro a 37 graus Celsius.

Oriente os embriões lateralmente e aguarde até que a agarose solidifique à temperatura ambiente. Em seguida, transfira a placa de imagem para a platina de um microscópio confocal. Identifique os neurônios motores que expressam o biossensor excitando a Umikinoko-Green monomérica com um laser de argônio de 488 nanômetros.

Em seguida, ajuste sua emissão entre 495 e 525 nanômetros e pressione gravar. Para uma medição de FRET, excite o mUKG, o doador do par FRET, com o laser de 488 nanômetros. Simultaneamente, utilizando dois fotomultiplicadores, detecte a fluorescência emitida pelo doador e a fluorescência emitida pelo aceptor monomérico Kusibira-Orange.

No início do experimento, otimize o ganho e o deslocamento do fotomultiplicador um, onde a fluorescência de mUKG é registrada, e mantenha-os constantes durante toda a sessão. Para ajustar o deslocamento, altere a cor da imagem para os valores de intensidade utilizando a tabela de consulta Q. Enquanto escaneia com o laser desligado, use o controle deslizante de deslocamento para que os pixels do fundo tenham uma intensidade ligeiramente superior a zero.

Usando a mesma tabela de consulta, ligue o laser. Durante a varredura, utilize o controle deslizante de ganho para maximizar a relação sinal-ruído, tomando cuidado para evitar pixels saturados. Na janela de aquisição do software, selecione o modo de aquisição xyt e um tamanho de campo de imagem de 512 por 64 pixels no menu suspenso.

Em seguida, configure a gravação das alterações na voltagem dos neurônios espinais do embrião para adquirir um único plano XY a cada 30 milissegundos durante um minuto. Para avaliar o efeito da administração de riluzol na despolarização da membrana no mesmo neurônio, adquira um novo conjunto de dados cinco minutos após a adição de água de peixe contendo riluzol a cinco micromolar. Neste filme, enrolamentos espontâneos, respostas motoras que consistem exclusivamente em uma contração completa do corpo trazendo a ponta da cauda até a cabeça, foram registrados no estágio de 20 a 24 hpf em meio de peixe comum.

Este vídeo mostra as enrolamentos espontâneos de um embrião após a incubação em riluzol a cinco micromolares. Para testar se alterações na atividade elétrica dos neurônios motores da medula espinhal estavam na base das mudanças induzidas pelo riluzol na frequência de enrolamento espontâneo, o potencial da membrana em neurônios motores espinhais de embriões foi estudado de maneira completamente não invasiva mediante a medição da razão de intensidade de fluorescência do par FRET doador-aceptor do biossensor Mermaid. Neurônios motores primários da medula espinhal expressando o biossensor foram identificados e suas atividades espontâneas basais de despolarização foram registradas.

Juntamente com a redução na frequência dos movimentos de enrolamento da cauda, a administração de riluzol reduziu a frequência dos eventos de despolarização espontânea. Uma vez dominada, esta abordagem permitirá aos pesquisadores estudar as propriedades elétricas das redes neurais de embriões intactos, preservando completamente a complexidade das interações entre as células no sistema funcional em desenvolvimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como a atividade elétrica dos neurônios da medula espinhal se correlaciona com a frequência dos enrolamentos espontâneos da cauda.