Name: Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Aprenda a analisar propriedades elétricas de neurônios motores em embriões de Danio rerio usando indicadores de voltagem baseados em FRET. Este método não invasivo permite estudar a excitabilidade neural in vivo.

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Os autores gostariam de agradecer a Simona Rodighiero por seu apoio inestimável com a análise de imagens FRET.

1. pHuC_Mermaid Plasmid Generation NOTA: Mermaid é um biossensor desenvolvido emparelhando o domínio de detecção de tensão (VSD) do Ciona intestinalis (agora Ciona robusta ) 5 sensores de tensão contendo fosfatase (Ci-VSP) com os fluoróforos associados FRET Umi-Kinoko Green (mUKG: doador) e uma versão monomérica da proteína fluorescente emanada de laranja Kusabira Orange (mKOk: aceitadora). Para este biossensor, as mudanças conformacionais do domínio VSD, induzidas pela despolarização da membrana, aumentam a proximidade das proteínas fluorescentes doadoras e aceitadoras, aumentando assim a transferência de energia entre elas (aumentando a relação FRET) 3 . O VSD assegura a localização eficiente do biossensor na membrana plasmática. A expressão neuronal do biossensor (na medula espinhal, o sinal é detectável em interneurônios e neurônios motores) é conseguida pela clonagem da Mermaid opNa estrutura de leitura (ORF) sob o promotor pan-neural zebrafish HuC 6 . <ol><li> Amplificar através da reação em cadeia da polimerase (PCR) a ORF da sereia a partir do plasmídeo de sementes pCS4 + 3 com polimerase de DNA de Pfu (revisão) utilizando o iniciador de DNA T3 e o iniciador Mermaid Sma I (5&#39;TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA) de modo a inserir um sítio de restrição Sma I a montante Da Sirena ORF. <ol><li> Utilize a seguinte mistura de PCR: 0,5 μL de polimerase de Pfu, 7,5 μL do tampão 10x específico, 1 μL de dNTP 10 mM, 2,5 μL de dimetilsulfóxido (DMSO), 0,5 μL (50 ng) da preparação do plasmídeo e 1 ΜL de soluções de estoque de 20 μM de cada iniciador num volume total de 50 μL. </li><li> Aqueça a mistura de PCR durante 15 s a 95 ° C, prima-a durante 15 s a 50 ° C e alonge-a durante 4 minutos a 72 ° C durante um total de 35 ciclos. </li></ol></li><li> Gel-purifique o espancamento específicoProduto de PCR utilizando um kit comercial de purificação de gel, seguindo o protocolo do fabricante. </li><li> Clone o fragmento de DNA no vetor macio pCMV-SC seguindo o protocolo do fabricante. </li><li> Linearize o plasmídeo positivo da Sereia (chamado pCMV-SC_Mermaid) com a enzima de restrição Sma I para a seguinte inserção do promotor HuC. <ol><li> Configure a reação de restrição como se segue: 0,5 μL (10 U) de enzima de restrição Sma I, 2 μL do kit 10x tampão e 5 μg de DNA plasmídico num volume total de 20 μL. Incubar a reacção a 25 ° C durante 1 h. </li></ol></li><li> Gel-purificar o plasmídeo digerido usando um kit comercial de purificação de gel seguindo o protocolo do fabricante. </li><li> PCR-amplificar o promotor de HuC (pHuC), com polimerase de ADN de Pfu e DNA genômico de peixe-zebra como modelo, usando um par de primers específicos de HuC (HuCprom-forw1_SalI: 5&#39;-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA e HuCproM-rev1: 5&#39;-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) e abrangendo uma região de 3.150 pb a montante do ATG. <ol><li> Configure a mistura de PCR utilizando o seguinte esquema: 0,5 μL de polimerase de Pfu, 7,5 μL do tampão 10x específico, 1 μL de dNTP 10 mM, 2,5 μL de DMSO, 200 ng de ADN genómico e 1 μL de 20 μM Soluções de estoque de cada iniciador em um volume total de 50 μL. </li><li> Após um passo inicial de 2 minutos a 95 ° C, aqueça a mistura de PCR durante 15 s a 95 ° C, prima-a durante 15 s a 50 ° C e alonge-a durante 4 min a 72 ° C durante um total de 35 ciclos . </li></ol></li><li> Gel-purifique o produto de PCR sem corte específico usando um kit comercial de purificação de gel seguindo o protocolo do fabricante. </li><li> Ligar uma quantidade equimolar da pCMV-SC_Mermaid purificada (passo 1.5) e do ADN de pHuC (passo 1.7) utilizando 1 μL de ligase de ADN T4 e 1 μL do tampão específico 10X num volume total de 10 μL. Incube a reação por 16 h em4 ° C. </li><li> Transforme uma alíquota de células competentes com 5 μL da reação de ligação (etapa 1.8) seguindo as instruções do fabricante. </li><li> Selecione os clones pHuC-positivos (pHuC_Mermaid) com o promotor inserido na orientação apropriada por uma digestão dupla Sal I- Eco RV (o local de restrição Sal I foi inserido a montante do fragmento promotor no passo 1.6, enquanto o site de restrição Eco RV Está posicionado a jusante da região de poliadenilação, PolyA, do plasmídeo pCMV-SC). <ol><li> Configure a reação de restrição da seguinte maneira: 0,5 μL (10 U) das enzimas de restrição Sal I e Eco RV, 2 μL do tampão kit10X e 1 μg de DNA pHuC_Mermaid em um volume total de 20 μL. Incubar a reacção a 37 ° C durante 1 h. Execute as reações em um gel de agarose. </li></ol></li></ol> 2. Microinjecção de embriões <ol><li> Transferir fertilizado, por exemplo,Gs obtidos de tipo selvagem (AB) ou peixe-zebra adulto Sod1-G93R 4 para uma placa de Petri de 10 mm usando uma pipeta de plástico. </li><li> Enxaguar os embriões em água de peixe fria (4 ° C) e imediatamente microinjetá-los na gema com 200 pg de plasmídeo pHuC_Mermaid usando um microinjetor (para uma descrição geral e detalhada do procedimento de microinjeção, ver Referências 7 e 8). </li><li> Usando uma pipeta de plástico, transfira os embriões para uma placa de Petri e incuba-os em água dos peixes a 28 ° C até atingir o estágio de desenvolvimento desejado (20-24 h pós-fertilização, hpf) para as seguintes análises. </li></ol> 3. Análise Espontânea de Coelagem NOTA: Avalie o comportamento espontâneo do enrolamento da cauda em embriões de 20-24 hpf com ou sem a droga riluzol. <ol><li> Transfira um embrião para uma placa de Petri redonda de 90 mm, cheia de água de peixe contendo 0,2% de DMSO (veículo de riluzole) e remova-a manualmente usando doisPinça de joalheiro com pontas afiadas. Incubar o embrião durante 5 min. </li><li> Detectar o enrolamento da cauda na RT durante uma gravação de vídeo de 1 min usando uma câmera digital montada em um estereomicroscópio. Adquira séries temporais em uma resolução de tempo de 30 quadros / s. </li><li> Calcule a frequência das bobinas de cauda espontâneas contando o número de curvas (ambos contralateral e ipsilateral) por unidade de tempo. </li><li> Para avaliar o efeito da droga riluzole, utilize com cuidado uma pipeta Pasteur de plástico para transferir o embrião para uma nova placa de Petri de 90 mm preenchida com água de peixe contendo 5 μM de riluzole. <ol><li> Incube o embrião durante 5 minutos antes de gravar um vídeo de 1 minuto e realizando a análise comportamental como acima. </li></ol></li></ol> 4. Configuração de imagem para a Visualização de Biossens da Sereia em Embriões Vivos: Detecção Simultânea de Sinais do Doador e do Aceitador <ol><li> Monte os embriões de 20 a 24 hpf em 1% de agarose de baixo ponto de fusão em água de peixe em37 ° C dentro de um prato de imagem de fundo de vidro de 35 mm. Oriente os embriões em seus lados. Aguarde até que a agarose solidifique à temperatura ambiente. </li><li> Transfira o prato de imagem para o estágio de um confocal invertido montado em um microscópio invertido. Identifique os neurônios motores que expressam o biossensor com um objetivo 20X (0,7 abertura numérica, NA) excitando o mUKG com a linha laser de argônio 488 nm e registrando sua emissão entre 495 e 525 nm. </li><li> Para uma medição de FRET, excite mUKG, o doador do par de FRET, com a linha a laser de 488 nm. Detecta simultaneamente, com um scanner ressonante operando a 8.000 Hz no modo bidirecional, a fluorescência emitida pelo doador (entre 495 e 525 nm) e a fluorescência emitida pelo aceitador mKOk (entre 550 e 650 nm, canal FRET). Se disponível, use o laser de 473 nm. NOTA: A eficiência de excitação do doador será ligeiramente reduzida (85% em vez de 93% com 488 nm), mas a excitação cruzada do aceitador seráSeja reduzido também (de 17% com 488 nm a 9% com linha laser de 473 nm). </li><li> Para reduzir a fototoxicidade e o branqueamento de fluoróforos, minimize a iluminação da amostra reduzindo a potência da linha laser (na janela do caminho do feixe do software de aquisição). </li><li> Otimize a excitação para combinar os parâmetros de ganho e deslocamento que são definidos no início do experimento e mantidos constantes ao longo da sessão. Para definir o deslocamento, altere a cor da imagem para os valores de intensidade (usando a tabela de consulta Q) e, ao digitalizar com o laser desligado, gire o botão de deslocamento (deslocamento inteligente) para que os pixels de fundo tenham uma intensidade ligeiramente Superior a zero. Com a mesma tabela de pesquisa, ligue o laser enquanto estiver digitalizando, gire o botão de ganhos (ganhos inteligentes) para maximizar a relação sinal-ruído, com o cuidado de evitar pixels saturados. </li><li> Usando um pinhole aberto (2 unidades arejadas), adquira imagens de 16 bits para fornecer um alcance dinâmico suficiente para quantitativE análises. Evite calcular a média para aumentar a velocidade de aquisição e para minimizar a fotovelagem. </li><li> Na janela de aquisição de software, selecione um tamanho de campo de imagem de 512 x 64 pixels (tamanho de pixel: 605 nm) no menu suspenso. </li><li> Na janela do modo de aquisição, selecione xyt (lapso de tempo em um único plano xy) do menu suspenso e registre as mudanças na tensão do neurônio da coluna vertebral embrionária ao adquirir um único plano xy, definindo os parâmetros de aquisição para gravar uma imagem a cada 30 Ms por 1 min. </li><li> Para avaliar o efeito da administração de riluzol na despolarização da membrana no mesmo neurônio, adquira um novo conjunto de dados 5 min após a adição de água de peixe contendo 5 μM de riluzol. </li><li> Para a análise de FRET, use a macro de ImageJ Biosensor_FRET (expressando biossensores de FRET de cadeia simples. </li><li> Avalie a relação FRET da membrana basal de cada neurônio em t 1 como ((FRET mean - FRET background) / (Donor mean - Donor background)), onde FRET e DonOu intensidade média é a intensidade média de fluorescência calculada na mesma região de interesse (ROI) desenhada em torno da célula para cada canal adquirido e o fundo FRET e Donor é a intensidade média de fluorescência calculada em um ROI do campo de visão sem a amostra fluorescente. NOTA: Uma detalhada descrição passo a passo do uso do plugin pode ser encontrada no site <a href="http://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret">www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret</a> . </li><li> Use um software gráfico para comparar a freqüência, amplitude e duração da despolarização entre diferentes paradigmas experimentais. Compare dois grupos usando um teste t de Student não compartilhado e considere os valores médios como estatisticamente diferentes quando P &lt;0,05. </li></ol>

<ol><li>Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+voltage+indicators+for+large+scale+cortical+imaging+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age.</a> Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).</li>
<li>Chemla, S., Chavane, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+dye+imaging%3A+Technique+review+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models.</a> J Physiol Paris. 104 (1-2), 40-50 (2010).</li>
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<li>Drapeau, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12450489">Development of the locomotor network in zebrafish.</a> Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).</li>
<li>Brustein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steps+during+the+development+of+the+zebrafish+locomotor+network%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Steps during the development of the zebrafish locomotor network.</a> J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).</li>
<li>Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+recording+from+identifiable+neurons+of+the+locomotor+network+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish.</a> J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).</li>
<li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2%3A+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1S7 (2007).</li>
<li>Sungmoo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Membrane+Potential+with+Two+Types+of+Genetically+Encoded+Fluorescent+Voltage+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors.</a> J Vis Exp. (108), e53566(2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo aqui apresentado permitiu explorar a associação entre as propriedades elétricas dos neurônios motores da coluna vertebral do embrião zebra eo comportamento espiral espiral, a atividade motriz estereotípica mais antiga, que aparece em torno de 17 hpf de desenvolvimento embrionário e dura até 24 hpf 10 . Nossa abordagem fornece aos pesquisadores uma ferramenta para estudar o sistema neural de embriões intactos, preservando plenamente a complexidade das inter...

A análise de componentes sistêmicos in vivo permite que os cientistas investigem o comportamento celular da maneira mais confiável. Isto é particularmente verdadeiro quando a atividade sob escrutínio é fortemente influenciada pelas interações célula-célula (dependentes de contato e não contato), como no sistema nervoso, onde as mudanças de tensão da membrana conduzem a comunicação entre células excitáveis. A compreensão das informações codificadas por esses sinais elétricos é a chave para entender o funcionamento do sistema nervoso em estados fisiológicos e de doenças. Para estudar as propriedades elétricas das células nas condições fisiológicas mais não-invasivas, vários indicadores de voltagem codificados geneticamente foram desenvolvidos recentemente 1 . Ao contrário das gerações anteriores de sensores de tensão óptica (principalmente corantes sensíveis à voltagem) 2 , os GEVIs permitem análises in vivo do sistema neural intacto eSua expressão pode ser limitada a tipos ou populações específicas de células. O embrião de peixe-zebra é o &quot;substrato&quot; in vivo de escolha para aproveitar o grande potencial atribuído aos GEVIs. De fato, graças à sua clareza óptica e seu sistema nervoso simplificado mas evolutivamente conservado, o modelo zebrafish permite a identificação e manipulação direta de cada componente celular em uma rede. De fato, o emprego da GEVI Mermaid 3 baseada em FRET levou à identificação de alterações pré-sintomáticas no comportamento do neurônio motor espinhal em um modelo de esclerose lateral amiotrófica (ALS) 4 . O seguinte protocolo in vivo descreve como monitorar as propriedades elétricas dos neurônios motores da coluna vertebral em embriões de peixe-zebra intactos que expressam a Sereia de maneira específica neuronal. Além disso, demonstra como chan induzido farmacologicamenteEssas propriedades elétricas podem ser associadas a alterações na freqüência de bobinas espontâneas embrionárias, a atividade motriz estereotípica que caracteriza o comportamento do movimento do peixe zebra em estágios de desenvolvimento muito iniciais.

<table><tbody><tr><td>Baixo ponto de fusão Agarose&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>Riluzol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R116</td><td></td></tr><tr><td>Pfu Ultra HQ DNA polimerase&nbsp;</td><td>Agilent Technologies - Divisão de Produtos Stratagene</td><td>600389</td><td></td></tr><tr><td>T3 Primer universal&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel e PCR Clean-Up system</td><td>Promega</td><td>A9280</td><td></td></tr><tr><td>Universal SmaI primer&nbsp;</td><td>Sistema de</td> Vetor de Expressão de Mamíferos Eurofins <td></td><td></td></tr><tr><td>StrataClone / pCMV-SC vetor rombudo&nbsp;</td><td>Agilent Technologies - Divisão de Produtos Stratagene</td><td></td><td></td>240228</tr><tr><td>SmaI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Promega</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England Biolabs</td><td>R0195S</td><td></td></tr><tr><td>35 mm, prato de imagem com fundo de vidro&nbsp;</td><td>Fórceps Ibidi</td><td>81151</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Leica Microsystems</td><td>M10 F</td><td></td></tr><tr><td>Câmera digital</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC 310 FX</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite 4.7.1 software&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuickTime Player, v10.4</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal (invertido)</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Microinjetor&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ macro Biosensor_FRET&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6.0c&nbsp;</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Os protocolos descritos aqui são projetados para permitir que os pesquisadores estudem a comunicação celular sem alterar a integridade do ambiente em que as células estão localizadas. Especificamente, eles foram desenvolvidos para analisar a atividade elétrica de células excitáveis, como os neurônios espinhais. Nesse cenário, é crucial preservar a integridade da célula espinhal, mas também é importante preservar a anatomia e a forma fisiológica dos sistemas envolvidos. De fato, a compreensão da maneira como o sistema nervoso - e outros sistemas complexos - funciona deve ser baseada em uma abordagem sistêmica. Por esse motivo, o embrião vivo de peixe-zebra foi escolhido como sistema modelo, e as alterações de voltagem da membrana do neurônio espinhal foram avaliadas sem interferir nas condições fisiológicas dos embriões. 
Aqui, é descrita uma abordagem que combina o emprego de embriões de peixe-zebra com um biossensor baseado em FRET. Os embriões de peixe-zebra são caracterizados por um sistema nervoso muito simplificado e são particularmente adequados para aplicações de imagem graças à sua transparência, permitindo o emprego de indicadores de voltagem baseados em fluorescência na membrana plasmática durante o desenvolvimento do peixe-zebra. A sinergia entre esses dois componentes permite analisar a atividade elétrica das células em organismos vivos intactos, sem perturbar o estado fisiológico. Finalmente, essa abordagem não invasiva pode coexistir com outras análises (por exemplo, registros de movimento espontâneo, como mostrado aqui).

Um vetor de expressão que transporta a sequência de codificação de biossensor Mermaid baseada em FRET sob o controle do promotor pan-neuronal pHuC, que conduz a síntese da proteína exclusivamente no sistema nervoso, foi entregue em ovos fertilizados de uma única célula por meio de uma microinjeção em Para obter embriões transgênicos transitórios ( Figura 1 , Painel esquerdo). Depois de dominar a técnica de microinjecção, a porcentagem de embriões posit...

Os protocolos descritos aqui permitem o estudo das propriedades elétricas de células excitáveis nas condições fisiológicas mais não invasivas, empregando embriões de peixe-zebra em um sistema in vivo, juntamente com um indicador de voltagem geneticamente codificado (GEVI) baseado em transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) seletivamente expresso no tipo de célula de interesse.

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar as propriedades elétricas de células excitáveis em condições fisiológicas não invasivas, utilizando embriões de peixe-zebra juntamente com um indicador de voltagem baseado em FRET. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a biologia de células excitáveis, como os neurônios. Por exemplo, este método pode ser usado para analisar o papel da excitabilidade na patogênese de distúrbios neurológicos.Esta abordagem utiliza embriões transparentes de peixe-zebra que expressam indicadores genéticos de voltagem baseados em FRET. O método permite a medição das propriedades elétricas das células in vivo de forma não invasiva. Assim, este método pode fornecer informações sobre a excitabilidade dos neurônios espinais em embriões de peixe-zebra.Também pode ser aplicado a outros sistemas in vitro ou in vivo passíveis de estudos de imagem. Para iniciar este procedimento, prepare a mistura de PCR para amplificar a sequência codificadora do biossensor Mermaid. Aqueça a mistura de PCR por 15 segundos a 95 graus Celsius.Prima por 15 segundos a 50 graus Celsius e alongue por quatro minutos a 72 graus Celsius, num total de 35 ciclos. Em

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Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Neste vídeo, demonstramos um método pelo qual para analisar o cérebro em desenvolvimento em embriões vertebrados zebrafish viver em resolução única célula por microscopia confocal. Isso inclui o método pelo qual injetamos o embrião do zebrafish de uma única célula e, posteriormente, montar e imagem do cérebro em desenvolvimento.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

Este protocolo descreve imagens de neurônios individuais ou de células da crista neural em embriões vivos zebrafish. Este método é usado para examinar comportamentos e localização celular actina microscopia de fluorescência usando lapso de tempo confocal.

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

Larval zebrafish representar o sistema primeiro modelo vertebrados para permitir a gravação simultânea patch clamp um músculo do neurônio motor e alvo espinhal esquelético. Este vídeo demonstra os métodos microscópicos utilizados para identificar uma CaP segmentar do neurônio motor e células do músculo-alvo, bem como as metodologias para a gravação de cada tipo de célula.

Gravações patch emparelhado Grampo da Motor-neurônio e músculo alvo ósseas em Zebrafish

Este vídeo descreve técnicas optogenéticas ativando neurônios somatossensoriais geneticamente modificados e registrando a resposta comportamental provocada com uma câmera de vídeo de alta velocidade.

Optogenética do peixe-zebra: ativando neurônios somatossensoriais geneticamente modificados para estudar respostas comportamentais larvais

Este vídeo demonstra um ensaio não invasivo para estudar a eletrofisiologia dos neurônios motores em embriões de peixe-zebra. Ao medir o enrolamento da cauda nos embriões como resultado da despolarização espontânea dos neurônios motores da medula espinhal, um bloqueador dos canais de sódio é aplicado para reduzir a frequência de enrolamento Em seguida, os embriões são imobilizados em agarose e colocados sob um microscópio de fluorescência. Os neurônios motores geneticamente modificados...

Uma abordagem não invasiva para estudar a eletrofisiologia dos neurônios motores em embriões de peixe-zebra

Este vídeo demonstra a gravação de sinais elétricos dos neurônios aferentes em uma larva de peixe-zebra paralisada, posicionando uma micropipeta perto do gânglio da linha lateral e formando uma vedação solta para captura de sinal. A solução extracelular mantém a viabilidade neuronal durante esse processo.

Monitorando sinais elétricos dos neurônios aferentes em uma larva de peixe-zebra imobilizada

Processos de desenvolvimento, tais como a proliferação, a modelagem, diferenciação, e a orientação do axónio pode ser facilmente modelada na medula espinal do peixe-zebra. Neste artigo, nós descrevemos um procedimento de montagem para os embriões de peixe-zebra, que otimiza a visualização destes eventos.

Dissecção e montagem lateral de embriões Zebrafish: Análise de Desenvolvimento da Medula Espinhal

Este manuscrito descreve métodos para registos electrofisiolicos de neurónios espinais de embriões de peixe-zebra e larvas. A preparação mantém neurónios in situ e muitas vezes envolve a dissecção mínima. Estes métodos permitem o estudo electrofisiológico de uma variedade de neurónios espinais, a partir da aquisição inicial excitabilidade eléctrica através dos primeiros estádios larvares.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons

Aqui, mostramos o processo de criação de uma linha de zebrafish do repórter de tensão elétrica celular para visualizar o desenvolvimento embrionário, movimento, e células de tumor de peixe em vivo.

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Descrevemos um protocolo para monitorar mudanças na atividade de neurônios diferentes durante comandos motores em um sistema de células ciliadas vertebrados modelo.

Atividade da Linha Lateral Posterior Neurônios Diferentes durante a Natação em Zebrafish

A junção neuromuscular larval do peixe-zebra é um modelo atraente para o estudo da fisiologia sináptica. É passível de muitas técnicas experimentais, incluindo eletrofisiologia e imagens ópticas. Aqui, descrevemos um protocolo para transmissão sináptica de imagem usando uma sonda baseada em pHluorina sob um microscópio de epifluorescência vertical.

Imagens ao vivo da reciclagem de vesículas sinápticas na junção neuromuscular de larvas dissecadas de peixe-zebra

Aprenda a analisar propriedades elétricas de neurônios motores em embriões de Danio rerio usando indicadores de voltagem baseados em FRET. Este método não invasivo permite estudar a excitabilidade neural in vivo.

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

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