Name: Usando biologia sintética para manipular células vivas que fazem interface com materiais programáveis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprenda a usar E. coli geneticamente modificada para controlar superfícies de materiais programáveis através de técnicas de modificação genética e funcionalização de superfícies. Este método oferece sensores dinâmicos para aplicações em medicina molecular e monitoramento ambiental.

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Os autores agradecem o apoio do prémio FA9550-13-1-0108 da Força Aérea Instituto de Investigação Científica dos EUA. Os autores adicionalmente reconhecer o apoio da adjudicação N00014-15-1-2502 do Office of Naval Research dos EUA, o financiamento do Instituto de Tecnologia da Critical e Ciência Aplicada na Virginia Polytechnic Institute e State University, e da Science Foundation Graduate Research Nacional Programa de bolsas, concessão número 1.607.310.

<ol><li>Zhang, R., Heyde, K. C., Scott, F. Y., Paek, S. -H., Ruder, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+Surface+Chemistry+with+Engineered+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth.+Biol%22%5BJournal%5D)">Programming Surface Chemistry with Engineered Cells.</a> ACS Synth. Biol. , (2016).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+graphene+oxide+films+used+as+matrix+of+MALDI-TOF-MS+for+detection+of+octachlorodibenzo-p-dioxin%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Reduced graphene oxide films used as matrix of MALDI-TOF-MS for detection of octachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Chem. Commun. 46, 6974-6976 (2010).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Cost+Detection+of+Zika+Virus+Using+Programmable+Biomolecular+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.</a> Cell. 165, 1255-1266 (2016).</li>
<li>Bähring, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Sensing+Properties+of+a+Self-Assembled+Supramolecular+Oligomer%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">Design and Sensing Properties of a Self-Assembled Supramolecular Oligomer.</a> Chem. Eur. J. 22, 1958-1967 (2016).</li>
<li>Nicolau Jr, D. V., Armitage, J. P., Maini, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+persistence+and+the+optimality+of+run-and-tumble+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Directional persistence and the optimality of run-and-tumble chemotaxis.</a> Comp. Biol. Chem. 33, 269-274 (2009).</li>
<li>Du, J., Shao, Z., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+microbial+factories+for+synthesis+of+value-added+products%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ind.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering microbial factories for synthesis of value-added products.</a> J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 38, 873-890 (2011).</li>
<li>Kim, H., Kim, M. J. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/7365478/">Electric Field Control of Bacteria-Powered Microrobots Using a Static Obstacle Avoidance Algorithm.</a> IEEE Trans. Rob. 32, 125-137 (2016).</li>
<li>Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+genetic+toggle+switch+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli.</a> Nature. 403, 339-342 (2000).</li>
<li>Heyde, K. C., Ruder, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+Host-Microbiome+Interactions+using+an+in+Silico+Model+of+Biomimetic+Robots+and+Engineered+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Exploring Host-Microbiome Interactions using an in Silico Model of Biomimetic Robots and Engineered Living Cells.</a> Sci. Rep. 5, 11988(2015).</li>
<li>Rice, M. K., Ruder, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+biological+nanomaterials+using+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Tech.+Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Creating biological nanomaterials using synthetic biology.</a> Sci. Tech. Adv. Mater. 15, 014401(2014).</li>
<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin.+3.+The+nature+of+the+biotin-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site.</a> Biochem. J. 89, 599-609 (1963).</li>
<li>Mesulam, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramethyl+benzidine+for+horseradish+peroxidase+neurohistochemistry%3A+a+non-carcinogenic+blue+reaction+product+with+superior+sensitivity+for+visualizing+neural+afferents+and+efferents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Tetramethyl benzidine for horseradish peroxidase neurohistochemistry: a non-carcinogenic blue reaction product with superior sensitivity for visualizing neural afferents and efferents.</a> J Histochem. Cytochem. 26, 106-117 (1978).</li>
<li>Litcofsky, K. D., Afeyan, R. B., Krom, R. J., Khalil, A. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+plug-and-play+methodology+for+constructing+and+modifying+synthetic+gene+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Iterative plug-and-play methodology for constructing and modifying synthetic gene networks.</a> Nat. Meth. 9, 1077-1080 (2012).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+Chemical+Synthesis%2C+Assembly%2C+and+Cloning+of+a+Mycoplasma+genitalium+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome.</a> Science. 319, 1215-1220 (2008).</li>
<li>Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biotin-%28strept%29avidin+system%3A+principles+and+applications+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology.</a> Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).</li>
<li>Nerurkar, L. S., Namba, M., Brashears, G., Jacob,, Lee, A. J., Sever, Y. J., L, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+herpes+simplex+virus+in+clinical+specimens+by+use+of+capture+biotin-streptavidin+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Micro%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of herpes simplex virus in clinical specimens by use of capture biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay.</a> J. Clin. Micro. 20, 109-114 (1984).</li>
<li>Cui, Y., Wei, Q., Park, H., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanowire+Nanosensors+for+Highly+Sensitive+and+Selective+Detection+of+Biological+and+Chemical+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanowire Nanosensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Biological and Chemical Species.</a> Science. 293, 1289-1292 (2001).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Nós apresentamos uma nova estratégia para a interface células manipuladas viver com uma superfície do material funcionalizado. Isto foi conseguido através do desenvolvimento de uma linha de células capazes de sintetizar níveis elevados de biotina quando induzido com IPTG. Os níveis elevados de biotina pode então ser utilizado para modificar a superfície funcionalizada. Os protocolos detalhados como engenheiro da linha de células E. coli e como criar duas superfícies funcionalizadas diferentes. <p class="jov...

Aqui, relatamos os procedimentos para o desenvolvimento de um substrato programável capaz de responder a um sinal químico a partir de uma linha celular de engenharia. 1 Fazemos isso através da criação de uma interface de biotina-estreptavidina que responde a biotina produzida pelas células Escherichia coli sinteticamente engenharia (E. coli). Anteriormente, superfícies programáveis foram projetados para uma ampla gama de aplicações de detecção de toxina 2 e point-of-care diagnóstico 3 a defesa e segurança. 4 Enquanto superfícies programáveis podem ser úteis como sensores e atuadores, eles podem ser feitos &quot;mais inteligentes&quot;, dotando-os com a capacidade de se adaptar a diferentes desafios ambientais. Em contraste, mesmo microorganismos simples, tais como E. coli, têm adaptabilidade inerente e são capazes de responder aos desafios com soluções sofisticadas e muitas vezes inesperados. Esta adaptação tem permitido E.populações coli, controladas por suas redes de genes complexos, de forma rentável para buscar recursos, 5 criar produtos de valor acrescentado, 6 e até robótica micro-escala de energia. 7, por acoplamento das vantagens adaptativas de células vivas com o uso de superfícies programáveis, podemos criar um substrato inteligente capaz de responder às diferentes condições ambientais. A biologia sintética tem dado aos pesquisadores novas habilidades para programar o comportamento de organismos vivos. Pela engenharia células para conter redes reguladoras novo gene, os pesquisadores podem criar células que exibem uma gama de comportamentos programados. 8, 9 Além pesquisa básica, esses comportamentos podem ser usados para aplicações como controle de montagem de material e biologicamente a produção de produtos de valor agregado. 10 Nisto, nós detalhe como usamos as ferramentas da biologia sintética para engenheiro uma estirpe de E. coli que sintetiza biotina após indução. Esta estirpe foi desenvolvida utilizando métodos de clonagem da enzima de restrição para montar um plasmídeo, pKE1-LACI-BIOB. Este plasmídeo, quando usado para transformar a estirpe de E. coli K-12 MG1655, dota células com a capacidade para expressar níveis elevados de BIOB, uma enzima essencial para a síntese de biotina. Quando as células transformadas foram induzidas com isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) e fornecido com um precursor de biotina, destiobiotina (DTB), níveis elevados de biotina foram produzidos. interacção de ligação da biotina com estreptavidina é um dos mais fortes ligações não covalentes encontrados na natureza. Como tal, a interacção biotina-estreptavidina é tanto bem caracterizados e altamente utilizado em biotecnologia. 11 Dentro deste manuscrito, apresentamos duas estratégias que empregam a interacção biotina-estreptavidina para detectar e detectar a biotina produzidos em células com uma superfície funcionalizada. Nósreferem-se a estas superfícies contrastantes como esquemas de controle &quot;diretos&quot; &quot;indiretas&quot; e. No esquema de controlo indirecto, biotina produzidos em células compete com biotina que foi conjugado e imobilizados numa superfície de poliestireno para locais de ligação a estreptavidina. Além disso, a estreptavidina é conjugado com peroxidase de rábano (HRP). HRP modifica 3, 3 &#39;, 5, 5&#39;-tetrametilbenzidina (TMB), para produzir um sinal óptico, 12, a qual pode ser monitorizada por quantificação da absorvância espectral (ou seja, a densidade óptica) a 450 nm (OD 450). Assim, o esquema de controle indireto permite aos pesquisadores para medir biotina produzida por células monitorando a attentuation do sinal de OD 450. O esquema de controlo directo explora o evento estreptavidina-biotina estreptavidina imobilizando directamente para uma superfície do material e permitindo biotina produzidos por células e de HRP biotinilada para competir por sítios de ligação a estreptavidina. Mais uma vez, oníveis relativos de biotina produzidos de células são monitorizados pela medição de uma sinal de OD 450. Tomadas em conjunto, as células manipuladas e superfícies funcionalizadas permitem controlar as propriedades de uma superfície programável através da indução de redes em células vivas. Em outras palavras, nós criamos um sistema que aproveita a capacidade de adaptação dos organismos vivos e a confiabilidade ea especificação de uma interface de material de engenharia, ligando estes sistemas juntos.

<table><tbody><tr><td>Caldo LB, Miller&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-795-027</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9744500</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilina&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26481</td><td></td></tr><tr><td>M9, Sais Minimimais, 5x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td></td></tr><tr><td>Casamino Acids&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1424-100</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Magnésio, Anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio, Dihidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (D-Glicose), Anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>NEB Turbo Linha Celular</td><td>New England Biolabs</td><td>C2984l</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotídeo Primers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>25N síntese, purificação DSL</td></tr><tr><td>Q5 Polimerase de alta fidelidade</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 tampão de reação</td><td>New England Biolabs</td><td>B9027S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioexpress</td><td>E-3120-125</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Brometo, 1%</td>Kits de Extração de Gel <td>Fisher Scientific</td><td>BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Epoch Biolabs</td><td>2260250</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit</td><td>Epoch Biolabs</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>AatII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0117S</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Cutsmart Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>ColiRolle Glass Plating Beads&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>7101-3</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Desthiobiotin (DTB)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16129</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidil Trans-4-(maleimidilmetil) Ciclohexano-1-Carboxilato (SMCC)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S1534</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido (DMSO)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidil 3-(2-piridilditio) Propionato (SPDP)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S1531</td><td></td></tr><tr><td>NHS-LC-LC-biotina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21343</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase de Rábano (HRP)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31490</td><td></td></tr><tr><td>Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS), Solução 10x</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin (SA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21145</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminoacético (EDTA)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de Hidrogênio</td><td>Fisher</td><td>Scientific H325-4</td><td></td></tr><tr><td>3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidina (TMB)</td><td>Concentradores</td> Centrífugos <td>Fisher Scientific AC229280050</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 500&nbsp;</td><td>Viva Products</td><td>VS0192</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Sódio, Placas de</td> Poliestireno <td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Anidro 96-Well</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>266120</td><td></td></tr></tbody></table>

usando biologia sintética para manipular células vivas que fazem interface com materiais programáveis

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Nós desenvolvemos uma interface abiótico-bióticos que permite que as células manipuladas para controlar as propriedades do material de uma superfície funcionalizada. Este sistema é feito através da criação de dois módulos: um sinteticamente estirpe de células de E. coli e uma interface de material funcionalizado. Dentro deste artigo, detalhamos um protocolo para a engenharia genética de comportamentos selecionados dentro de uma estirpe de E. coli utilizando estratégias de clonagem molecular. Uma vez desenvolvidas, esta estirpe produz níveis elevados de biotina quando exposta a um indutor químico. Adicionalmente, protocolos para a criação de detalhe duas superfícies funcionalizadas diferentes, cada um dos quais é capaz de responder a biotina sintetizado por células. Tomados em conjunto, apresentamos uma metodologia para a criação de um sistema ligado, abiótico-biótico que permite que as células para controlar a composição do material e montagem em substratos inanimados engenharia.

Os resultados representativos são apresentados nas figuras em anexo cinco. Em primeiro lugar, é apresentado o processo de clonagem graficamente (Figura 1), de modo que o leitor pode acompanhar visualmente os passos críticos para criar a estirpe de E. coli sinteticamente. A fim de caracterizar a dinâmica das populações de células, que proporcionam uma curva de crescimento (Figura 2) gerado pela medição da densidade óptica a 600 nm (DO600)</s...

Este artigo apresenta uma série de protocolos para o desenvolvimento de células manipuladas e superfícies funcionalizadas que permitem sinteticamente engenharia E. coli para controlar e manipular superfícies de materiais programáveis.

Usando biologia sintética para manipular células vivas que fazem interface com materiais programáveis

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

O objetivo geral desses procedimentos é utilizar E. coli geneticamente modificadas sinteticamente para controlar e manipular superfícies de materiais programáveis, combinando estratégias de modificação genética e funcionalização de superfícies. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em áreas como medicina molecular e monitoramento ambiental. Ao usar células geneticamente programadas para interpretar um ambiente local e modificar um material funcionalizado de acordo, estamos fornecendo uma ferramenta modular para uma ampla variedade de aplicações.A principal vantagem dessa técnica é que células vivas são capazes de atuar como sensores dinâmicos, podendo ler, processar e registrar as condições ao seu redor por meio de interfaces funcionalizadas. Após preparar as soluções e coletar o sobrenadante enriquecido em biotina de E.coli produtora de biotina de acordo com o protocolo descrito, adicione 1,4 microlitro de solução de SPDP a 20 microlitros de solução de estreptavidina ou SA. Envolva o tubo com papel alumínio e incube-o à temperatura ambiente por uma hora e meia para permitir que o conector cruzado SPDP se ligue à SA por meio de um grupo amino, formando uma SA a

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Protocolos para implementação de uma Escherichia coli Com base TX-TL Expression System-Free Cell para Biologia Sintética

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