Usando biologia sintética para manipular células vivas que fazem interface com materiais programáveis

O objetivo geral desses procedimentos é utilizar E. coli geneticamente modificadas sinteticamente para controlar e manipular superfícies de materiais programáveis, combinando estratégias de modificação genética e funcionalização de superfícies. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em áreas como medicina molecular e monitoramento ambiental. Ao usar células geneticamente programadas para interpretar um ambiente local e modificar um material funcionalizado de acordo, estamos fornecendo uma ferramenta modular para uma ampla variedade de aplicações.

A principal vantagem dessa técnica é que células vivas são capazes de atuar como sensores dinâmicos, podendo ler, processar e registrar as condições ao seu redor por meio de interfaces funcionalizadas. Após preparar as soluções e coletar o sobrenadante enriquecido em biotina de E.coli produtora de biotina de acordo com o protocolo descrito, adicione 1,4 microlitro de solução de SPDP a 20 microlitros de solução de estreptavidina ou SA. Envolva o tubo com papel alumínio e incube-o à temperatura ambiente por uma hora e meia para permitir que o conector cruzado SPDP se ligue à SA por meio de um grupo amino, formando uma SA ativada com piridilditio. Após a incubação, adicione 2,4 microlitros de solução de DTT ao tubo e incube a amostra à temperatura ambiente por uma hora para permitir uma clivagem da piridina-2-tiona, resultando em uma SA ativada com sulfidrila. Em seguida, adicione 7,5 microlitros de solução de SCC a 72 microlitros de solução de HRP, envolva com papel alumínio e incube à temperatura ambiente por uma hora e meia.

Isso resulta em uma HRP ativada por maleimida ligada por um grupo amino. Misture 17 microlitros da solução de biotina LC-LC com 200 microlitros da solução de BSA, envolva o tubo em papel alumínio e incube a amostra à temperatura ambiente por uma hora e meia. Este passo permite que a biotina se conjuge à BSA por meio de uma ligação amida.

Transfira a solução de SA-SPDP, a HRP-SMCC e a solução de biotina conjugada com BSA para concentradores centrífugos separados em tubos de centrífuga. Centrifugue o SA-SPDP a 10.000 vezes g até que o volume do tubo atinja 100 microlitros ou por 16 minutos, depois complete o tubo de centrífuga com 500 microlitros usando PBS-EDTA antes de repetir a centrifugação e a adição de PBS-EDTA mais cinco vezes. Após centrifugar a solução até 100 microlitros, armazene o estoque a quatro graus Celsius.

Para a HRP SMCC, centrifugue os tubos a 10.000 vezes g até que o volume atinja 25 microlitros ou por 16 minutos. Complete o tubo de centrifugação até 4500 microlitros usando PBS antes de repetir a centrifugação e a adição de PBS mais cinco vezes. Após centrifugar a solução até 100 microlitros, armazene o estoque a quatro graus Celsius.

Para a biotina de BSA, centrifugue a amostra a 10.000 vezes g até que o volume atinja 100 microlitros ou por 12 minutos, depois complete o tubo de centrifugação até 500 microlitros usando PBS. Após repetir a centrifugação e a adição de PBS mais quatro vezes, centrifugue o tubo até que o volume atinja 100 microlitros ou por 12 minutos, então adicione 100 microlitros de PBS ao tubo e armazene o estoque a quatro graus Celsius. Em seguida, combine 25 microlitros da HRP de 10 miligramas por mililitro com 25 microlitros da solução de SA de 10 miligramas por mililitro e armazene o tubo a quatro graus Celsius durante a noite, depois prepare duas alíquotas de biotina de BSA em PBS adicionando 10 microlitros do estoque de biotina de BSA a 490 microlitros de PBS.

Pipete 100 microlitros da solução em cada poço de uma placa de 96 poços. Envolva a placa com papel alumínio e incube-a a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, adicione 200 microlitros de Tween 80 a 0,5% e BPS aos poços.

Incube a placa em temperatura ambiente por dois minutos, depois aspire e descarte o líquido. Após repetir a lavagem três vezes, adicione 200 microlitros da solução de revestimento a 0,5% a cada um dos poços e, em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por uma hora. Após nova rodada de lavagens como antes, misture 12 mililitros da solução de revestimento a 0,5% com 7,5 microlitros de Tween 80 a 0,5% e, então, use esta solução para diluir a solução estoque de SA-HRP na proporção de um para 10.000.

Pipete 80 microlitros da SA-HRP diluída em cada poço de uma placa de 96 poços, em seguida adicione 20 microlitros da amostra de biotina preparada em cada poço da placa. Incube a placa a 37 graus Celsius por uma hora. Esta etapa permite a ligação competitiva entre biotina livre e biotina BSA imobilizada pelos sítios de ligação da SA-HRP.

Em seguida, após lavar a placa três vezes como antes, prepare uma solução de 20 mililitros de acetato de sódio 50 milimolar, 1% de TMB e 3% de peróxido de hidrogênio numa proporção de 1.000 para 10 para um. Adicione 200 microlitros da solução a cada poço da placa, envolva-a em papel alumínio e incube-a à temperatura ambiente por 15 minutos. Pipete 50 microlitros de ácido sulfúrico 2 molar para cada poço para interromper a reação, depois use um leitor de placas para medir a OD 450.

Após o preparo das soluções de acordo com o protocolo descrito no texto, adicione 7,5 microlitros de biotina LC-LC a 72 microlitros de HRP. Envolva a solução com papel alumínio e incube a amostra à temperatura ambiente por uma hora e meia com agitação. Este passo faz com que a biotina se conjuge à HRP por meio de uma ligação amídica.

Transfira a solução para um concentrador centrífugo dentro de um tubo de centrifugação e centrifugue a solução a 10.000 vezes g até que o volume atinja 100 microlitros ou por 12 minutos, depois use PBS para completar o tubo de centrifugação até 500 microlitros e repita a centrifugação e a adição de tampão quatro vezes. Em seguida, adicione 100 microlitros de 0,17 microgramas por mililitro de SA em PBS a cada poço de uma placa de 96 poços. Envolva a placa com papel alumínio e incube-a a 37 graus Celsius por uma hora.

Para lavar as cavidades da placa, pipete 200 microlitros de Tween 80 a 0,5% em cada cavidade. Incube a placa à temperatura ambiente por dois minutos e despreze o líquido. Após repetir a lavagem mais três vezes, adicione 200 microlitros da solução de capeamento a 0,5% às cavidades.

Incube a placa a 37 graus Celsius por uma hora antes de lavar as cavidades três vezes como antes. Usando a solução concentrada e lavada de biotina HRP previamente preparada, dilua a solução estoque de biotina HRP na proporção de um para 10.000, depois adicione 80 microlitros da solução às cavidades de uma placa de 96 poços. Adicione 20 microlitros da amostra de biotina preparada a cada cavidade da placa e incube a placa a 37 graus Celsius por uma hora para permitir a ligação competitiva entre biotina livre e biotina HRP pelos sítios de ligação de SA imobilizados.

Após lavar as placas três vezes como antes, prepare uma solução de 20 mililitros de acetato de sódio 50 milimolar, 1% de TMV e 3% de peróxido de hidrogênio numa proporção de 1.000 para 10 para um. Adicione 200 microlitros da solução a cada poço da placa, cubra com papel alumínio e incube em temperatura ambiente por 15 minutos; em seguida, adicione 50 microlitros de ácido sulfúrico 2 molar a cada poço para interromper a reação. Por fim, utilize um leitor de placas para medir a DO 450.

As células selvagens do tipo E.coli MG1655 modificadas foram cultivadas e monitoradas em meio mínimo, bem como em meio mínimo suplementado com DTB e/ou IPTG. Esses gráficos mostram as leituras de OD 600 medidas a cada cinco minutos durante 24 horas. Neste experimento, a proteína fluorescente mCherry foi utilizada no lugar do gene bioB, de modo que o perfil de indução pudesse ser medido quando as células modificadas foram induzidas com IPTG.

Esses resultados demonstram a eficácia da rede gênica induzível. Estão representados aqui os sinais ópticos em OD 450 em resposta a concentrações variáveis de biotina, para ambos os esquemas de superfície funcionalizada indireta e direta. Neste experimento, produtos de células geneticamente modificadas induzidas foram utilizados para modificar quimicamente a superfície funcionalizada.

As diferentes concentrações de biotina são apresentadas conforme medidas pela superfície funcionalizada com o esquema de controle indireto para células selvagens, células não induzidas contendo o plasmídeo pKE1-lacI-bioB e células induzidas contendo o plasmídeo pKE1-lacI-bioB. Uma vez dominado, o engenho genético de células pode ser realizado em dois dias, enquanto as técnicas de funcionalização superficial direta e indireta podem ser realizadas cada uma em cinco horas, se forem executadas corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar a contaminação do cultivo celular bacteriano e cobrir as superfícies durante a funcionalização para evitar o clareamento fotográfico.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como funcionalizar superfícies para esquemas de controle direto e indireto. Não se esqueça de que o trabalho com brometo de etídio pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de luvas, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.