Name: Usando biologia sintética para manipular células vivas que fazem interface com materiais programáveis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprenda a usar E. coli geneticamente modificada para controlar superfícies de materiais programáveis através de técnicas de modificação genética e funcionalização de superfícies. Este método oferece sensores dinâmicos para aplicações em medicina molecular e monitoramento ambiental.

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Os autores agradecem o apoio do prémio FA9550-13-1-0108 da Força Aérea Instituto de Investigação Científica dos EUA. Os autores adicionalmente reconhecer o apoio da adjudicação N00014-15-1-2502 do Office of Naval Research dos EUA, o financiamento do Instituto de Tecnologia da Critical e Ciência Aplicada na Virginia Polytechnic Institute e State University, e da Science Foundation Graduate Research Nacional Programa de bolsas, concessão número 1.607.310.

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<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+graphene+oxide+films+used+as+matrix+of+MALDI-TOF-MS+for+detection+of+octachlorodibenzo-p-dioxin%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Reduced graphene oxide films used as matrix of MALDI-TOF-MS for detection of octachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Chem. Commun. 46, 6974-6976 (2010).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Cost+Detection+of+Zika+Virus+Using+Programmable+Biomolecular+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.</a> Cell. 165, 1255-1266 (2016).</li>
<li>Bähring, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Sensing+Properties+of+a+Self-Assembled+Supramolecular+Oligomer%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">Design and Sensing Properties of a Self-Assembled Supramolecular Oligomer.</a> Chem. Eur. J. 22, 1958-1967 (2016).</li>
<li>Nicolau Jr, D. V., Armitage, J. P., Maini, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+persistence+and+the+optimality+of+run-and-tumble+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Directional persistence and the optimality of run-and-tumble chemotaxis.</a> Comp. Biol. Chem. 33, 269-274 (2009).</li>
<li>Du, J., Shao, Z., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+microbial+factories+for+synthesis+of+value-added+products%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ind.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering microbial factories for synthesis of value-added products.</a> J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 38, 873-890 (2011).</li>
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<li>Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+genetic+toggle+switch+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli.</a> Nature. 403, 339-342 (2000).</li>
<li>Heyde, K. C., Ruder, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+Host-Microbiome+Interactions+using+an+in+Silico+Model+of+Biomimetic+Robots+and+Engineered+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Exploring Host-Microbiome Interactions using an in Silico Model of Biomimetic Robots and Engineered Living Cells.</a> Sci. Rep. 5, 11988(2015).</li>
<li>Rice, M. K., Ruder, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+biological+nanomaterials+using+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Tech.+Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Creating biological nanomaterials using synthetic biology.</a> Sci. Tech. Adv. Mater. 15, 014401(2014).</li>
<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin.+3.+The+nature+of+the+biotin-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site.</a> Biochem. J. 89, 599-609 (1963).</li>
<li>Mesulam, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramethyl+benzidine+for+horseradish+peroxidase+neurohistochemistry%3A+a+non-carcinogenic+blue+reaction+product+with+superior+sensitivity+for+visualizing+neural+afferents+and+efferents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Tetramethyl benzidine for horseradish peroxidase neurohistochemistry: a non-carcinogenic blue reaction product with superior sensitivity for visualizing neural afferents and efferents.</a> J Histochem. Cytochem. 26, 106-117 (1978).</li>
<li>Litcofsky, K. D., Afeyan, R. B., Krom, R. J., Khalil, A. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+plug-and-play+methodology+for+constructing+and+modifying+synthetic+gene+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Iterative plug-and-play methodology for constructing and modifying synthetic gene networks.</a> Nat. Meth. 9, 1077-1080 (2012).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+Chemical+Synthesis%2C+Assembly%2C+and+Cloning+of+a+Mycoplasma+genitalium+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome.</a> Science. 319, 1215-1220 (2008).</li>
<li>Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biotin-%28strept%29avidin+system%3A+principles+and+applications+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology.</a> Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).</li>
<li>Nerurkar, L. S., Namba, M., Brashears, G., Jacob,, Lee, A. J., Sever, Y. J., L, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+herpes+simplex+virus+in+clinical+specimens+by+use+of+capture+biotin-streptavidin+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Micro%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of herpes simplex virus in clinical specimens by use of capture biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay.</a> J. Clin. Micro. 20, 109-114 (1984).</li>
<li>Cui, Y., Wei, Q., Park, H., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanowire+Nanosensors+for+Highly+Sensitive+and+Selective+Detection+of+Biological+and+Chemical+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanowire Nanosensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Biological and Chemical Species.</a> Science. 293, 1289-1292 (2001).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Nós apresentamos uma nova estratégia para a interface células manipuladas viver com uma superfície do material funcionalizado. Isto foi conseguido através do desenvolvimento de uma linha de células capazes de sintetizar níveis elevados de biotina quando induzido com IPTG. Os níveis elevados de biotina pode então ser utilizado para modificar a superfície funcionalizada. Os protocolos detalhados como engenheiro da linha de células E. coli e como criar duas superfícies funcionalizadas diferentes. <p class="jov...

Aqui, relatamos os procedimentos para o desenvolvimento de um substrato programável capaz de responder a um sinal químico a partir de uma linha celular de engenharia. 1 Fazemos isso através da criação de uma interface de biotina-estreptavidina que responde a biotina produzida pelas células Escherichia coli sinteticamente engenharia (E. coli). Anteriormente, superfícies programáveis foram projetados para uma ampla gama de aplicações de detecção de toxina 2 e point-of-care diagnóstico 3 a defesa e segurança. 4 Enquanto superfícies programáveis podem ser úteis como sensores e atuadores, eles podem ser feitos &quot;mais inteligentes&quot;, dotando-os com a capacidade de se adaptar a diferentes desafios ambientais. Em contraste, mesmo microorganismos simples, tais como E. coli, têm adaptabilidade inerente e são capazes de responder aos desafios com soluções sofisticadas e muitas vezes inesperados. Esta adaptação tem permitido E.populações coli, controladas por suas redes de genes complexos, de forma rentável para buscar recursos, 5 criar produtos de valor acrescentado, 6 e até robótica micro-escala de energia. 7, por acoplamento das vantagens adaptativas de células vivas com o uso de superfícies programáveis, podemos criar um substrato inteligente capaz de responder às diferentes condições ambientais. A biologia sintética tem dado aos pesquisadores novas habilidades para programar o comportamento de organismos vivos. Pela engenharia células para conter redes reguladoras novo gene, os pesquisadores podem criar células que exibem uma gama de comportamentos programados. 8, 9 Além pesquisa básica, esses comportamentos podem ser usados para aplicações como controle de montagem de material e biologicamente a produção de produtos de valor agregado. 10 Nisto, nós detalhe como usamos as ferramentas da biologia sintética para engenheiro uma estirpe de E. coli que sintetiza biotina após indução. Esta estirpe foi desenvolvida utilizando métodos de clonagem da enzima de restrição para montar um plasmídeo, pKE1-LACI-BIOB. Este plasmídeo, quando usado para transformar a estirpe de E. coli K-12 MG1655, dota células com a capacidade para expressar níveis elevados de BIOB, uma enzima essencial para a síntese de biotina. Quando as células transformadas foram induzidas com isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) e fornecido com um precursor de biotina, destiobiotina (DTB), níveis elevados de biotina foram produzidos. interacção de ligação da biotina com estreptavidina é um dos mais fortes ligações não covalentes encontrados na natureza. Como tal, a interacção biotina-estreptavidina é tanto bem caracterizados e altamente utilizado em biotecnologia. 11 Dentro deste manuscrito, apresentamos duas estratégias que empregam a interacção biotina-estreptavidina para detectar e detectar a biotina produzidos em células com uma superfície funcionalizada. Nósreferem-se a estas superfícies contrastantes como esquemas de controle &quot;diretos&quot; &quot;indiretas&quot; e. No esquema de controlo indirecto, biotina produzidos em células compete com biotina que foi conjugado e imobilizados numa superfície de poliestireno para locais de ligação a estreptavidina. Além disso, a estreptavidina é conjugado com peroxidase de rábano (HRP). HRP modifica 3, 3 &#39;, 5, 5&#39;-tetrametilbenzidina (TMB), para produzir um sinal óptico, 12, a qual pode ser monitorizada por quantificação da absorvância espectral (ou seja, a densidade óptica) a 450 nm (OD 450). Assim, o esquema de controle indireto permite aos pesquisadores para medir biotina produzida por células monitorando a attentuation do sinal de OD 450. O esquema de controlo directo explora o evento estreptavidina-biotina estreptavidina imobilizando directamente para uma superfície do material e permitindo biotina produzidos por células e de HRP biotinilada para competir por sítios de ligação a estreptavidina. Mais uma vez, oníveis relativos de biotina produzidos de células são monitorizados pela medição de uma sinal de OD 450. Tomadas em conjunto, as células manipuladas e superfícies funcionalizadas permitem controlar as propriedades de uma superfície programável através da indução de redes em células vivas. Em outras palavras, nós criamos um sistema que aproveita a capacidade de adaptação dos organismos vivos e a confiabilidade ea especificação de uma interface de material de engenharia, ligando estes sistemas juntos.

<table><tbody><tr><td>Caldo LB, Miller&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-795-027</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9744500</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilina&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26481</td><td></td></tr><tr><td>M9, Sais Minimimais, 5x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td></td></tr><tr><td>Casamino Acids&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1424-100</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Magnésio, Anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio, Dihidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (D-Glicose), Anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>NEB Turbo Linha Celular</td><td>New England Biolabs</td><td>C2984l</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotídeo Primers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>25N síntese, purificação DSL</td></tr><tr><td>Q5 Polimerase de alta fidelidade</td><td>New England Biolabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 tampão de reação</td><td>New England Biolabs</td><td>B9027S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Solution Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioexpress</td><td>E-3120-125</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Brometo, 1%</td>Kits de Extração de Gel <td>Fisher Scientific</td><td>BP1302-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Epoch Biolabs</td><td>2260250</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit</td><td>Epoch Biolabs</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>AatII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0117S</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Cutsmart Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>ColiRolle Glass Plating Beads&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>7101-3</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td></td></tr><tr><td>NHS-Desthiobiotin (DTB)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16129</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidil Trans-4-(maleimidilmetil) Ciclohexano-1-Carboxilato (SMCC)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S1534</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido (DMSO)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidil 3-(2-piridilditio) Propionato (SPDP)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S1531</td><td></td></tr><tr><td>NHS-LC-LC-biotina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21343</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase de Rábano (HRP)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31490</td><td></td></tr><tr><td>Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS), Solução 10x</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin (SA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21145</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminoacético (EDTA)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164-500</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de Hidrogênio</td><td>Fisher</td><td>Scientific H325-4</td><td></td></tr><tr><td>3, 3', 5, 5'-tetrametilbenzidina (TMB)</td><td>Concentradores</td> Centrífugos <td>Fisher Scientific AC229280050</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 500&nbsp;</td><td>Viva Products</td><td>VS0192</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Sódio, Placas de</td> Poliestireno <td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Anidro 96-Well</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>266120</td><td></td></tr></tbody></table>

usando biologia sintética para manipular células vivas que fazem interface com materiais programáveis

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

Nós desenvolvemos uma interface abiótico-bióticos que permite que as células manipuladas para controlar as propriedades do material de uma superfície funcionalizada. Este sistema é feito através da criação de dois módulos: um sinteticamente estirpe de células de E. coli e uma interface de material funcionalizado. Dentro deste artigo, detalhamos um protocolo para a engenharia genética de comportamentos selecionados dentro de uma estirpe de E. coli utilizando estratégias de clonagem molecular. Uma vez desenvolvidas, esta estirpe produz níveis elevados de biotina quando exposta a um indutor químico. Adicionalmente, protocolos para a criação de detalhe duas superfícies funcionalizadas diferentes, cada um dos quais é capaz de responder a biotina sintetizado por células. Tomados em conjunto, apresentamos uma metodologia para a criação de um sistema ligado, abiótico-biótico que permite que as células para controlar a composição do material e montagem em substratos inanimados engenharia.

Os resultados representativos são apresentados nas figuras em anexo cinco. Em primeiro lugar, é apresentado o processo de clonagem graficamente (Figura 1), de modo que o leitor pode acompanhar visualmente os passos críticos para criar a estirpe de E. coli sinteticamente. A fim de caracterizar a dinâmica das populações de células, que proporcionam uma curva de crescimento (Figura 2) gerado pela medição da densidade óptica a 600 nm (DO600)</s...

Este artigo apresenta uma série de protocolos para o desenvolvimento de células manipuladas e superfícies funcionalizadas que permitem sinteticamente engenharia E. coli para controlar e manipular superfícies de materiais programáveis.

Usando biologia sintética para manipular células vivas que fazem interface com materiais programáveis

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...

O objetivo geral desses procedimentos é utilizar E. coli geneticamente modificadas sinteticamente para controlar e manipular superfícies de materiais programáveis, combinando estratégias de modificação genética e funcionalização de superfícies. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em áreas como medicina molecular e monitoramento ambiental. Ao usar células geneticamente programadas para interpretar um ambiente local e modificar um material funcionalizado de acordo, estamos fornecendo uma ferramenta modular para uma ampla variedade de aplicações.A principal vantagem dessa técnica é que células vivas são capazes de atuar como sensores dinâmicos, podendo ler, processar e registrar as condições ao seu redor por meio de interfaces funcionalizadas. Após preparar as soluções e coletar o sobrenadante enriquecido em biotina de E.coli produtora de biotina de acordo com o protocolo descrito, adicione 1,4 microlitro de solução de SPDP a 20 microlitros de solução de estreptavidina ou SA. Envolva o tubo com papel alumínio e incube-o à temperatura ambiente por uma hora e meia para permitir que o conector cruzado SPDP se ligue à SA por meio de um grupo amino, formando uma SA ativada com piridilditio. Após a incubação, adicione 2,4 microlitros de solução de DTT ao tubo e incube a amostra à temperatura ambiente por uma hora para permitir uma clivagem da piridina-2-tiona, resultando em uma SA ativada com sulfidrila. Em seguida, adicione 7,5 microlitros de solução de SCC a 72 microlitros de solução de HRP, envolva com papel alumínio e incube à temperatura ambiente por uma hora e meia.Isso resulta em uma HRP ativada por maleimida ligada por um grupo amino. Misture 17 microlitros da solução de biotina LC-LC com 200 microlitros da solução de BSA, envolva o tubo em papel alumínio e incube a amostra à temperatura ambiente por uma hora e meia. Este passo permite que a biotina se conjuge à BSA por meio de uma ligação amida.Transfira a solução de SA-SPDP, a HRP-SMCC e a solução de biotina conjugada com BSA para concentradores centrífugos separados em tubos de centrífuga. Centrifugue o SA-SPDP a 10.000 vezes g até que o volume do tubo atinja 100 microlitros ou por 16 minutos, depois complete o tubo de centrífuga com 500 microlitros usando PBS-EDTA antes de repetir a centrifugação e a adição de PBS-EDTA mais cinco vezes. Após centrifugar a solução até 100 microlitros, armazene o estoque a quatro graus Celsius.Para a HRP SMCC, centrifugue os tubos a 10.000 vezes g até que o volume atinja 25 microlitros ou por 16 minutos. Complete o tubo de centrifugação até 4500 microlitros usando PBS antes de repetir a centrifugação e a adição de PBS mais cinco vezes. Após centrifugar a solução até 100 microlitros, armazene o estoque a quatro graus Celsius.Para a biotina de BSA, centrifugue a amostra a 10.000 vezes g até que o volume atinja 100 microlitros ou por 12 minutos, depois complete o tubo de centrifugação até 500 microlitros usando PBS. Após repetir a centrifugação e a adição de PBS mais quatro vezes, centrifugue o tubo até que o volume atinja 100 microlitros ou por 12 minutos, então adicione 100 microlitros de PBS ao tubo e armazene o estoque a quatro graus Celsius. Em seguida, combine 25 microlitros da HRP de 10 miligramas por mililitro com 25 microlitros da solução de SA de 10 miligramas por mililitro e armazene o tubo a quatro graus Celsius durante a noite, depois prepare duas alíquotas de biotina de BSA em PBS adicionando 10 microlitros do estoque de biotina de BSA a 490 microlitros de PBS.Pipete 100 microlitros da solução em cada poço de uma placa de 96 poços. Envolva a placa com papel alumínio e incube-a a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, adicione 200 microlitros de Tween 80 a 0,5% e BPS aos poços.Incube a placa em temperatura ambiente por dois minutos, depois aspire e descarte o líquido. Após repetir a lavagem três vezes, adicione 200 microlitros da solução de revestimento a 0,5% a cada um dos poços e, em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por uma hora. Após nova rodada de lavagens como antes, misture 12 mililitros da solução de revestimento a 0,5% com 7,5 microlitros de Tween 80 a 0,5% e, então, use esta solução para diluir a solução estoque de SA-HRP na proporção de um para 10.000.Pipete 80 microlitros da SA-HRP diluída em cada poço de uma placa de 96 poços, em seguida adicione 20 microlitros da amostra de biotina preparada em cada poço da placa. Incube a placa a 37 graus Celsius por uma hora. Esta etapa permite a ligação competitiva entre biotina livre e biotina BSA imobilizada pelos sítios de ligação da SA-HRP.Em seguida, após lavar a placa três vezes como antes, prepare uma solução de 20 mililitros de acetato de sódio 50 milimolar, 1% de TMB e 3% de peróxido de hidrogênio numa proporção de 1.000 para 10 para um. Adicione 200 microlitros da solução a cada poço da placa, envolva-a em papel alumínio e incube-a à temperatura ambiente por 15 minutos. Pipete 50 microlitros de ácido sulfúrico 2 molar para cada poço para interromper a reação, depois use um leitor de placas para medir a OD 450.Após o preparo das soluções de acordo com o protocolo descrito no texto, adicione 7,5 microlitros de biotina LC-LC a 72 microlitros de HRP. Envolva a solução com papel alumínio e incube a amostra à temperatura ambiente por uma hora e meia com agitação. Este passo faz com que a biotina se conjuge à HRP por meio de uma ligação amídica.Transfira a solução para um concentrador centrífugo dentro de um tubo de centrifugação e centrifugue a solução a 10.000 vezes g até que o volume atinja 100 microlitros ou por 12 minutos, depois use PBS para completar o tubo de centrifugação até 500 microlitros e repita a centrifugação e a adição de tampão quatro vezes. Em seguida, adicione 100 microlitros de 0,17 microgramas por mililitro de SA em PBS a cada poço de uma placa de 96 poços. Envolva a placa com papel alumínio e incube-a a 37 graus Celsius por uma hora.Para lavar as cavidades da placa, pipete 200 microlitros de Tween 80 a 0,5% em cada cavidade. Incube a placa à temperatura ambiente por dois minutos e despreze o líquido. Após repetir a lavagem mais três vezes, adicione 200 microlitros da solução de capeamento a 0,5% às cavidades.Incube a placa a 37 graus Celsius por uma hora antes de lavar as cavidades três vezes como antes. Usando a solução concentrada e lavada de biotina HRP previamente preparada, dilua a solução estoque de biotina HRP na proporção de um para 10.000, depois adicione 80 microlitros da solução às cavidades de uma placa de 96 poços. Adicione 20 microlitros da amostra de biotina preparada a cada cavidade da placa e incube a placa a 37 graus Celsius por uma hora para permitir a ligação competitiva entre biotina livre e biotina HRP pelos sítios de ligação de SA imobilizados.Após lavar as placas três vezes como antes, prepare uma solução de 20 mililitros de acetato de sódio 50 milimolar, 1% de TMV e 3% de peróxido de hidrogênio numa proporção de 1.000 para 10 para um. Adicione 200 microlitros da solução a cada poço da placa, cubra com papel alumínio e incube em temperatura ambiente por 15 minutos; em seguida, adicione 50 microlitros de ácido sulfúrico 2 molar a cada poço para interromper a reação. Por fim, utilize um leitor de placas para medir a DO 450.As células selvagens do tipo E.coli MG1655 modificadas foram cultivadas e monitoradas em meio mínimo, bem como em meio mínimo suplementado com DTB e/ou IPTG. Esses gráficos mostram as leituras de OD 600 medidas a cada cinco minutos durante 24 horas. Neste experimento, a proteína fluorescente mCherry foi utilizada no lugar do gene bioB, de modo que o perfil de indução pudesse ser medido quando as células modificadas foram induzidas com IPTG.Esses resultados demonstram a eficácia da rede gênica induzível. Estão representados aqui os sinais ópticos em OD 450 em resposta a concentrações variáveis de biotina, para ambos os esquemas de superfície funcionalizada indireta e direta. Neste experimento, produtos de células geneticamente modificadas induzidas foram utilizados para modificar quimicamente a superfície funcionalizada.As diferentes concentrações de biotina são apresentadas conforme medidas pela superfície funcionalizada com o esquema de controle indireto para células selvagens, células não induzidas contendo o plasmídeo pKE1-lacI-bioB e células induzidas contendo o plasmídeo pKE1-lacI-bioB. Uma vez dominado, o engenho genético de células pode ser realizado em dois dias, enquanto as técnicas de funcionalização superficial direta e indireta podem ser realizadas cada uma em cinco horas, se forem executadas corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar a contaminação do cultivo celular bacteriano e cobrir as superfícies durante a funcionalização para evitar o clareamento fotográfico.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como funcionalizar superfícies para esquemas de controle direto e indireto. Não se esqueça de que o trabalho com brometo de etídio pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de luvas, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Bioengineering

Bioengenharia

Este protocolo de cinco dias descreve todos os passos, equipamentos e software suplementar necessário para a criação e execução de um Escherichia coli endógena eficiente baseado TX-TL livre de células sistema de expressão a partir do zero. Com reagentes, o protocolo leva 8 horas ou menos para configurar uma reação, coletar e processar dados.

Protocolos para implementação de uma Escherichia coli Com base TX-TL Expression System-Free Cell para Biologia Sintética

Aqui, um fluxo de trabalho automatizado para realizar a montagem de "dispositivo" modular do DNA usando um método de montagem clonagem de DNA modular em robôs de manipulação de líquido é apresentado. O protocolo usa uma ferramenta de software intuitivo para gerar picklists líquido manipulador para combinatória DNA dispositivo biblioteca geração, que demonstramos usando duas plataformas de manipulação de líquidos.

Robótico líquido manipulação montagem de dispositivos modulares DNA automática

Descrevemos um procedimento simples de litografia para a imobilização de moléculas de DNA do gene-comprimento sobre uma superfície, que pode ser usada para realizar experiências de expressão do gene sem célula em biochips.

Superfície-imobilização funcional dos Genes usando várias etapas Strand deslocamento litografia

Descreve-se o processo de fabricação de um dispositivo microfluídico baseado em PDMS, multicamada, que permite a realização de reações in vitro de transcrição e tradução (IVTT) durante períodos prolongados. Além disso, uma visão geral abrangente do hardware e software necessários para automatizar e manter essas reações para durações prolongadas é fornecida.

Uma plataforma Microfluídico multicamada para a condução de expressão gênica sem células prolongada

Este protocolo descreve o método, materiais, equipamentos e etapas para a preparação de baixo para cima de RNA e proteína susceptíveis de produzir células sintéticas. O compartimento aquoso interno das células sintéticas continha o lisato bacteriano S30 encapsulado dentro de uma bicamada lipídica (ou seja, lipossomos estáveis), utilizando um método de transferência de emulsão de água no óleo.

Preparando proteínas que produzem células sintéticas usando extratos bacterianos livres de células, liposomos e transferência de emulsão

Partes genéticas bem caracterizadas são necessárias para o projeto de novos circuitos genéticos. Aqui descrevemos um método econômico e de alto rendimento para caracterizar rapidamente as partes genéticas. Nosso método reduz o custo e o tempo combinando lisatos livres de células, DNA linear para evitar a clonagem e manuseio de líquidos acústicos para aumentar o rendimento e reduzir os volumes de reação.

Caracterização Rápida de Partes Genéticas com Sistemas Livres de Células

Este protocolo descreve o sistema de Síntese de Proteínas Livres de Células (CFPS) usado na construção de células sintéticas. Ele descreve os principais estágios com resultados representativos em diferentes microcompartimentos. O protocolo visa estabelecer as melhores práticas para diversos laboratórios na comunidade de células sintéticas, promovendo o progresso no desenvolvimento de células sintéticas.

Sistema de síntese de proteínas livres de células para a construção de células sintéticas

Aqui, é apresentado um protocolo para projetar, construir e fornecer circuito sintético induzível baseado em tetraciclina controlado. O efeito dos circuitos sintéticos na eliminação do parasita e na expressão de citocinas pode ser estudado canalizando o pipeline apresentado. Este protocolo é relevante para pesquisadores que estudam a terapêutica baseada em circuitos sintéticos em doenças infecciosas.

Circuitos imunometabólicos na infecção para o avanço das terapias direcionadas ao hospedeiro

Este artigo descreve uma abordagem biofabrication: deposição de estímulos responsivos polissacáridos, na presença de eléctrodos enviesados ​​para criar filmes biocompatíveis que podem ser funcionalizados com células ou proteínas. Nós demonstramos uma estratégia de bancada para a geração dos filmes assim como as suas utilizações básicas para criar superfícies interactivos biofunctionalized para lab-on-a-chip aplicações.

Colmatar a interface Bio-eletrônico com Biofabrication

Este documento revela um protocolo para caracterizar as propriedades mecânicas de células vivas por meio de microindentação utilizando um microscópio de força atómica (AFM).

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Aprenda a usar E. coli geneticamente modificada para controlar superfícies de materiais programáveis através de técnicas de modificação genética e funcionalização de superfícies. Este método oferece sensores dinâmicos para aplicações em medicina molecular e monitoramento ambiental.

Usando biologia sintética para manipular células vivas que fazem interface com materiais programáveis

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