Identificação de Proteínas de gelo Planta de ligao por meio da avaliação da Inibição de gelo-recristalização e isolamento utilizando purificação por afinidade de gelo

O objetivo geral deste protocolo é identificar novas proteínas de ligação ao gelo ou IBPs de plantas, testando a atividade de ligação ao gelo e isolando peptídeos nativos usando purificação de afinidade com o gelo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da tolerância ao congelamento de plantas, especificamente proteínas de ligação ao gelo. A principal vantagem desta técnica é que ela permite isolar proteínas de ligação ao gelo de extratos nativos sem o uso de métodos de purificação complicados.

A demonstração visual desse método é crítica, uma vez que a configuração do aparelho pode ser difícil de conceituar. Comece este protocolo com a configuração do aparelho splat conforme descrito no protocolo de texto. Para induzir a expressão de proteínas de ligação ao gelo, ou IBPs, em gramíneas tolerantes ao congelamento ou outras espécies de plantas tolerantes ao congelamento, aclimatar as plantas ao frio por até uma semana a quatro graus Celsius em condições de pouca luz.

Obtenha aproximadamente 0,1 grama de tecido foliar cortando a base do caule e depois colocando em um tubo de 1,5 mililitro. Congele imediatamente a amostra em nitrogênio líquido e armazene a 80 graus Celsius negativos até o uso. Para lisar as células, triture a amostra de tecido em um pó fino usando um almofariz e pilão sob nitrogênio líquido.

Certifique-se de que o nitrogênio líquido não evapore durante o processo de homogeneização. Coloque imediatamente as amostras moídas no gelo e deixe o nitrogênio líquido evaporar completamente. Em seguida, adicione um mililitro de um tampão de extração de proteína nativa e pipeta para misturar.

Agite suavemente as amostras durante a noite a quatro graus Celsius e conduza as etapas restantes na mesma temperatura. No dia seguinte, remova os detritos celulares centrifugando as amostras a aproximadamente 1.600 vezes G por cinco minutos. Conservar a fracção solúvel e centrifugar durante mais cinco minutos se os detritos celulares persistirem.

As amostras clarificadas podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius até o uso. Despeje 100 mililitros de hexano na câmara externa configurada com o filme polarizado e adicione cinco a seis esferas de dessecação para evitar o acúmulo de umidade nas lâminas. Em seguida, adicione uma pequena quantidade de graxa a vácuo na placa que cobre o banho e torça para garantir uma vedação firme e evitar a evaporação do hexano.

40 minutos antes de iniciar o experimento, coloque o bloco de resfriamento em uma caixa de poliestireno diretamente abaixo do tubo de plástico e cubra-o completamente com gelo seco. Antes de iniciar o ensaio, certifique-se de que o tubo esteja nivelado. Em seguida, remova o gelo seco do topo do bloco frio.

Primeiro, teste este procedimento com água para determinar onde no bloco de resfriamento a amostra cairá. Mergulhe a ponta descartável afixada a uma pipeta automática em óleo de imersão, o que permitirá que a amostra caia em vez de aderir à parte externa da pipeta. Use uma toalha de papel para remover o excesso de óleo.

Em seguida, aspire 10 microlitros de água. Coloque a pipeta diretamente sobre o tubo de plástico antes de liberar a água. Um som distinto de splat deve ser ouvido quando a água atinge o bloco de resfriamento, criando uma monocamada de cristais de gelo.

Em seguida, coloque uma lâmina de cobertura de microscópio de vidro na marca de gota que foi determinada com água. Imediatamente antes de iniciar o ensaio, ligue a fonte de luz e raspe o gelo que se formou no fundo da câmara de vidro. Em seguida, execute o ensaio de splat com a amostra, como feito para a água, liberando 10 microlitros da amostra na lâmina da tampa de vidro para criar uma monocamada de cristais de gelo.

Remova rápida e cuidadosamente a lâmina do microscópio do bloco frio usando uma pinça e coloque no banho de hexano em cima do filme polarizador. Olhando sob o microscópio, coloque a lâmina do microscópio no campo de visão e ajuste a lente objetiva para que a polarização cruzada permita a visualização de cristais de gelo de alto contraste. Conecte a câmera ao microscópio e ajuste as configurações para macro para permitir a visualização clara de cristais de gelo e capturar a imagem.

Repita essas etapas para todas as amostras. Normalmente, coloque até seis lâminas com uma amostra diferente na câmara hexana. Quando terminar, desligue a fonte de luz.

Em seguida, coloque uma placa de plástico sobre o banho de hexano, garantindo uma vedação hermética, e deixe os cristais de gelo recozerem durante a noite. Após a incubação, capture imagens dos filmes de gelo como antes. Depois de aclimatar o tecido vegetal a frio como antes, colete aproximadamente 100 a 150 gramas da biomassa moída em tubos de 20 mililitros.

Congele imediatamente as amostras e mantenha-as a menos 80 graus Celsius antes de usar. Prepare a amostra como antes, usando uma proporção de um para um para ressuspensão do tecido foliar. Use comprimidos inibidores de protease adicionais para evitar a degradação de IBPs por proteases endógenas.

Para remover os detritos celulares, peneire o lisado através de duas camadas de gaze três vezes. Pulverizar os detritos por centrifugação a 30.000 vezes G durante 40 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, aumente o volume da amostra para 120 mililitros usando tampão de extração de proteína nativa e use a lisada imediatamente para purificação por afinidade com o gelo para evitar qualquer perda de atividade de ligação ao gelo.

Depois de resfriar o dedo de gelo a menos 0,5 graus Celsius, submerja-o em um tubo de 50 mililitros contendo água destilada fria. Adicione algumas lascas de gelo para facilitar a nucleação do gelo e permitir que uma fina camada de gelo se forme no dedo. Esse processo normalmente leva entre 20 e 30 minutos.

Coloque a amostra em um copo de vidro de 150 mililitros contendo uma pequena barra de agitação magnética, que é colocada em um recipiente de poliestireno em cima do agitador magnético. Certifique-se de que o dedo de gelo esteja centralizado e abaixado pelo menos até a metade da amostra líquida. Em seguida, feche o recipiente.

Permita que o programa seja executado por aproximadamente dois dias, verificando a cada 24 horas. Assim que 50% da amostra estiver congelada, pare o programa. A incorporação de IBPs no hemisfério de gelo resultará em corrosão de gelo.

Para remover o hemisfério de gelo, aqueça a sonda a quatro graus Celsius. Em seguida, enxágue o hemisfério com água destilada para remover a proteína não ligada e descongele a quatro graus Celsius. Se o hemisfério de gelo ainda contiver pigmento, ou para aumentar a purificação da amostra, repita as etapas de purificação duas a três vezes.

Aqui são mostrados extratos coletados de um controle tampão sem IBPs e extratos de Arabidopsis thaliana do tipo selvagem que não contêm IBPs. Após 18 horas, o controle tampão e os extratos de A.thaliana são incapazes de restringir o crescimento de cristais de gelo. Em contraste, os pequenos cristais de gelo vistos com extratos de A.thaliana transgênico expressando IBPs de Lolium perenne aclimatado ao frio restringem substancialmente o crescimento de cristais de gelo.

Após a primeira rodada de purificação, o alto grau de corrosão do gelo na superfície do hemisfério indica que os IBPs adsorveram no gelo e modificaram o crescimento dos cristais de gelo. Para remover solutos, pigmentos e proteínas contaminantes adicionais, uma segunda rodada de afinidade com o gelo foi usada, resultando em um hemisfério de gelo mais claro. Após este procedimento, a modelagem do gelo e a histerese térmica podem ser avaliadas usando um osmômetro de nanolitro para caracterizar ainda mais as proteínas de ligação ao gelo.

Além disso, frações isoladas podem ser enviadas para espectrometria de massa, a fim de identificar as sequências peptídicas.