Identificação de progenitores eritromoelóides e sua progênie no embrião de mouse por citometria de fluxo

O objetivo geral deste experimento é caracterizar os progenitores hematopoiéticos do saco vitelino e sua progênie in vivo, utilizando um sistema de mapeamento de linhagem induzido por tamoxifeno em camundongos e citometria de fluxo. Isso pode ajudar a responder questões fundamentais no campo da imunologia sobre o desenvolvimento e a diferenciação de progenitores hematopoiéticos distintos das células-tronco hematopoiéticas. A principal vantagem desta técnica é que os progenitores hematopoiéticos marcados dentro de uma janela de tempo limitada, bem como sua progênie, como macrófagos residentes, podem ser monitorados durante o desenvolvimento e na vida adulta.

De modo geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido à quantidade de células no tecido embrionário e ao grande volume das amostras tratadas simultaneamente. Para iniciar o experimento, transfira primeiro os cornos uterinos de camundongo dissecados para uma placa de Petri de 10 milímetros contendo aproximadamente 30 mililitros de PBS gelado. Imediatamente após, segure as camadas musculares do útero na extremidade cervical do corno e deslize uma tesoura fina entre a camada muscular e o tecido deciduial para liberar os embriões.

Em seguida, com pinça fina, remova a membrana de Reichert e retire a placenta. Disseque cuidadosamente o saco vitelino e transfira-o para uma placa de cultura tecidual de 24 poços contendo 0,5 mililitros da solução de digestão. Após seccionar os vasos umbilical e vitelino, transfira imediatamente o embrião para uma placa de cultura tecidual de 12 poços contendo 2 mililitros de EDTA 10 milimolar gelado.

Após remover a cabeça do embrião com uma tesoura fina e afiada, incube o corpo e a cabeça no gelo por 10 a 15 minutos e, em seguida, remova o embrião e colete o EDTA contendo o sangue. Em seguida, remova o âmnio que envolve o embrião. Depois disso, remova as patas traseiras e membros estranhos do embrião.

Usando um par de pinças finas, abra o tórax. Em seguida, segure a parte anterior do coração e puxe suavemente o tecido, soltando os órgãos internos do corpo com um segundo par de pinças. Sob um microscópio estereoscópico, separe o fígado fetal do coração e do intestino.

E transfira o órgão para uma placa de 24 poços contendo 0,5 mililitros da solução de digestão. A conexão anatômica com o sistema cardiovascular é essencial para a identificação do fígado fetal. O fígado fetal ainda está nesse estágio de desenvolvimento, e quanto mais jovens forem os embriões, mais difícil pode ser a dissecação.

Para preparar suspensões primárias de células, incubar os órgãos coletados na solução de digestão a 37 graus Celsius por 30 minutos. Adicionar o tecido na solução enzimática para um filtro de 10 micrômetros colocado sobre uma das cavidades de uma placa de cultura tecidual de seis cavidades contendo 1 mililitro de tampão FACS. Utilizar um êmbolo de borracha preto de uma seringa de 2 mililitros para dissociar o tecido, esmagando suavemente a fim de obter uma suspensão simples de células.

Em seguida, aspire a suspensão celular com uma pipeta de Pasteur e transfira-a para um tubo de 15 mililitros. Centrifugue a suspensão a 320 ×g a 4 °C por 7 minutos. Após a centrifugação, aspire e descarte o sobrenadante.

Em seguida, prepare um tampão de bloqueio Fc fresco e ressuspenda o pellet em 60 microlitros. Então, transfira 50 microlitros da suspensão de células individuais para um poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços. Incube a placa no gelo por pelo menos 15 minutos.

Em seguida, transfira os 10 microlitros restantes da suspensão para um tubo FACS de poliestireno de 5 mililitros para obter um pool de amostras derivadas de diferentes tecidos. Transfira 50 microlitros do pool para controles FMO de cada fluorocromo para a placa de 96 poços. Para prosseguir com a marcação de superfície antigênica, utilize um conjunto de seis anticorpos fluorocromos para preparar uma solução de anticorpos e tampão FACS.

Em seguida, prepare seis soluções de anticorpos e o tampão FACS utilizado para a coloração de controle FMO. Depois, adicione 50 microlitros das soluções de anticorpos às amostras na placa de 96 poços. Misture as amostras por pipetagem suave dupla e, em seguida, incube a placa no gelo por 30 minutos.

Centrifugue a placa de 96 poços a 320 × g a 4 graus Celsius por 7 minutos e remova o sobrenadante. Lave as células com 200 microlitros de tampão FACS e centrifugue a placa mais uma vez. Deve-se ter cuidado especial ao remover o sobrenadante por inversão da placa.

A placa de 96 poços deve ser virada de cabeça para baixo com um único movimento brusco do punho para evitar o desprendimento das células. Por fim, utilizando um filtro de 70 micrômetros, filtre as amostras de tecido e controle em tubos de poliestireno de 6 milímetros. A análise por citometria de fluxo pode agora ser realizada.

Uma população de células únicas citicas não eritrócitas vivas foi analisada quanto à expressão do marcador de progenitor kit e do marcador de células hematopoéticas CD45. Dentro da população-alvo, foram distinguidas três subpopulações celulares diferentes: KIT positivo CD45 negativo, KIT positivo CD45 baixo e KIT negativo CD45 positivo.

Entre os progênitos positivos para o kit do saco vitelino, as populações celulares CD45 negativas e CD45 baixas continham células positivas para AA4.1 que expressam a proteína fluorescente amarela ou YFP, indicando que os progênitos imaturos positivos para KIT expressam inicialmente AA4.1 independentemente da expressão de CD45. Células positivas para AA4.1 e positivas para YFP no fígado e no cérebro foram encontradas apenas na população de progênitos positivos para KIT e com baixa expressão de CD45, correspondendo muito provavelmente a progênitos circulantes originados dos progênitos do saco vitelino. Macrófagos foram encontrados na população negativa para o kit e positiva para CD45, sendo identificados como células F480 brilhantes e positivas para CD11B.

Macrófagos no saco vitelino, fígado e cérebro foram rotulados eficientemente por uma única administração de 4-hidroxi-tamoxifeno, o que pode indicar sua origem a partir de EPNs. Uma vez dominado, o procedimento de isolamento e coloração celular pode ser realizado em três a quatro horas, se for executado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter sempre as amostras em gelo assim que forem coletadas.

Os tampones FACS frescos devem ser preparados diariamente e filtrados. Após este procedimento, outras linhagens repórter de mosaico ou de fluxo, como as linhagens Rosa MTMG ou Rosa confetti, podem ser utilizadas para responder a questões adicionais sobre o potencial de indiferenciação e fase proto das células marcadas posteriormente.