Name: Identificação de progenitores eritromoelóides e sua progênie no embrião de mouse por citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Aprenda a caracterizar progenitores hematopoéticos do saco vitelino e sua progênie em embriões de mouse usando um sistema de mapeamento de destino induzido por tamoxifeno e citometria de fluxo. Este método permite rastrear macrófagos residentes durante o desenvolvimento.

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Os autores agradecem ao Prof. Frederic Geissmann e ao Prof. Christian Schulz por discussões perspicazes; Dr. Hannah Garner para a leitura crítica do manuscrito, o Dr. Xavier Montagutelli e o Dr. Jean Jaubert e os funcionários da unidade animal do Instituto Pasteur para apoio à criação de camundongos; E Pascal Dardenne e Vytaute Boreikaite, um Amgen Scholar, por sua assistência técnica. A pesquisa no laboratório EGP é financiada pelo Instituto Pasteur, o CNRS, o Cercle FSER (FRM e um pacote de partida do Institut Pasteur e do consórcio REVIVE. LI é apoiado por uma bolsa de doutorado do consórcio REVIVE.

Os procedimentos em animais foram realizados de acordo com o comité institucional aprovado de cuidados e uso animal do Institut Pasteur (CETEA). 1. Na rotulagem de pulso Utero em embriões Csf1r MeriCreMer Rosa LSL-YFP <ol><li> Prepare a solução-mãe de 4-hidroxitoxifen (OH-TAM, 50 mg / mL). <ol><li> Sob a flexibilidade, abra o frasco de 25 mg de OH-TAM e adicione 250 μL de etanol (100%). </li><li> Transfira a solução OH-TAM para um tubo de microcentrífuga de 2 mL com uma ponta truncada e vortex na velocidade máxima durante 10 min. </li><li> Sonicate 30 min em um banho sonicador. </li><li> Adicione 250 μL de óleo de ricino PEG-35 sob o fumo para obter uma solução de reserva de 50 mg / mL. NOTA: O óleo de mamona PEG-35 é um solvente com propriedades anfifílicas que liga moléculas hidrofóbicas e as solubiliza em solventes aquosos. </li><li> Vortex por aproximadamente 5 minutosNa velocidade máxima e sonicate 30 min em um banho de sonicador. </li><li> Alíquota 90 μL (4,5 mg) por tubo de microcentrífuga (1 alíquota por injeção). </li><li> Armazenar a 4 ° C durante 1 semana ou a -20 ° C por longo prazo como descrito anteriormente 13 . </li></ol></li><li> Prepare a solução-mãe da Progesterona (10 mg / mL) <ol><li> Adicione 250 μL de 100% de etanol a 25 mg de progesterona para preparar uma suspensão de 10 mg / 100 μL sob o fumo. Vortex suavemente. </li><li> Adicione 2250 μL de óleo de girassol autoclavado para formar 10 mg / ml de solução de progesterona sob o capô. </li><li> Vortex por aproximadamente 5 min a velocidade máxima, alíquota e armazene a 4 ° C. Observe que a solução é clara quando armazenada. </li></ol></li><li> Administração de tamoxifeno NOTA: O desenvolvimento embrionário foi estimado considerando o dia da formação do tampão vaginal como dia embrionário (E) 0,5. A recombinação é induzida por injeção única em E8.5Em fêmeas grávidas Csf1r MeriCreMer 12 . Suplementar OH-TAM com 37,5 μg por g de Progesterona para reduzir as taxas de aborto após a administração de tamoxifeno. Injetar às 13 horas (para conexão vaginal observada pela manhã). <ol><li> Na manhã da injeção, sonicar uma alíquota da solução de OH-TAM durante 10 min (ou até ressuspensa completamente). </li><li> Adicione 360 ​​μL de NaCl 0,9% sob o fumo para obter uma solução de OH-TAM de 10 mg / mL e vorteie completamente. Sonicate até a solução ficar limpa e completamente ressuspensa (pelo menos 30 min). </li><li> Progesterona pré-quente à temperatura ambiente. </li><li> Misture 450 μL de OH-TAM e 225 μL de progesterona em um tubo de microcentrífuga. Vórtice. </li><li> Sonicate pelo menos 10 min e carregue para uma seringa de 1 mL com uma agulha 25G. </li><li> Na instalação animal, pesa a fêmea grávida (as fêmeas Csf1r MeriCreMer estão em um fundo genético FVB inata e pesam tipicamente entre elesEm 25 e 33 g). </li><li> Realize uma injeção intraperitoneal injetando lentamente o volume calculado no mouse. Depois de retirar a agulha, pressione suavemente a ferida da punção e massageie o abdômen para distribuir o OH-TAM. NOTA: A dose de injecção de OH-TAM é de 75 mg / kg e a dose de Progesterona é de 37,5 mg / kg. A Tabela 1 fornece o volume para injetar em fêmeas grávidas. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Peso do mouse (g) </td><td> Volume total a injetar da mistura (μL) </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 281 </td></tr><tr><td> 26 </td><td> 292 </td></tr><tr><td> 27 </td><td> 303 </td></tr><tr><td> 28 </td><td> 315 </td></tr><tr><td> 29 </td><td> 326 </td></tr><tr><td> 30 </td><td> 338 </td></tr><tr><td> 31 </td><td> 348 </td></tr><tr><td> 32 </td><td> 360 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> 33 </td><td> 371 </td></tr><tr><td> 34 </td><td> 382 </td></tr><tr><td> 35 </td><td> 394 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Volume de injeção de 4-OH-tamoxifeno (OH-TAM). Volume necessário para uma única injecção a E8,5 de 75 μg por g (peso corporal) de OH-TAM suplementado com 37,5 μg por g de progesterona. 2. Dissecção do saco de gema (YS) e Fetal Liver (FL) NOTA: Não são necessárias técnicas estéreis rigorosas na manipulação de embriões, a não ser que sejam usadas para cultura de longo prazo. No entanto, a área de trabalho deve ser limpa e coberta de papel alumínio em papel absorvente. <ol><li> Preparar solução salina tamponada com fosfato gelada (PBS) e mistura de digestão (PBS contendo 1 mg / mL de colagenase D, 100 U / mL Deoxyribonuclease I (DNase I) e 3% de soro bovino fetal). </li><li> Sacrifique mulheres grávidas por cerDeslocamento físico no dia de gestação requerido ( por exemplo, estágio embrionário E10.5). </li><li> Aperte a pele por cima dos genitais e faça uma pequena incisão na linha média com tesoura. Puxe a pele em direção à cabeça para expor completamente a parede do corpo sem pele. Corte os músculos abdominais para expor os órgãos internos e empurre o intestino para expor os dois chifres uterinos. </li><li> Com pinças contundentes de tamanho médio, pegue a almofada gorda anexada ao ovário e puxe suavemente o útero. Corte no nível cervical dos chifres uterinos e levante os chifres da cavidade peritoneal. Remova a almofada de gordura para libertar completamente os chifres uterinos e cortar os chifres do ovário de cada lado. </li><li> Coloque os chifres em PBS gelados em uma placa de Petri de 10 mm. Agarre rapidamente as camadas do útero em uma extremidade (extremidade cervical) e deslize as tesouras finas entre a camada muscular e o tecido decual para liberar os embriões com o tecido decente circundante. NOTA: Os músculos tendem a se contrair rapidamenteA extração, então esse passo deve ser o mais rápido possível. </li><li> Use um par de pinças finas para cortar a membrana de Reichert e a placenta. </li><li> Remova cuidadosamente o saco vitelino e coloque-o em uma placa de cultura de tecido de 24 po com 0,5 mL de mistura de digestão. NOTA: Nesta etapa, o sangue embrionário pode ser coletado. <ol><li> Imediatamente após a separação dos vasos umbilical e vitelline, transfira o embrião para uma placa de cultura de tecidos de 12 poços contendo 10 mM de ácido etilenodiaminotetracético gelado (EDTA). Decapite o embrião usando tesouras afiadas e finas, tentando limitar o máximo possível de dilaceração do tecido. Incube no gelo por 10 a 15 minutos e colete o EDTA contendo o sangue. </li></ol></li><li> Remova o amnio que rodeia o embrião. </li><li> Para os estágios &lt;E11.5, conte o número de pares de somite para melhor encenação de embriões e uma melhor resolução de tempo (cada par somite se desenvolve em ~ 1 h 30 min). </li><li> Corte a cabeça do embrião nósFórceps ou tesoura fina. Transfira a cabeça para uma placa de 24 poços com 0,5 mL de mistura de digestão. NOTA: O neuroectodermo eo cérebro nos estágios posteriores são mais dissecados para análise de citometria de fluxo; Remova cuidadosamente o plexo vascular circundante. </li><li> Corte o embrião acima do membro posterior e remova os membros anteriores. </li><li> Para isolar o fígado, abra o tórax usando um par de pinças finas. Aperte antes do coração e puxe suavemente enquanto usa a segunda pinça para libertar os órgãos do corpo. <ol><li> Separa cuidadosamente o fígado fetal do coração e do intestino. Transfira o fígado fetal para uma placa de 24 poços com 0,5 mL de mistura de digestão. Acompanhe cuidadosamente a transferência sob o microscópio de dissecação. </li></ol></li><li> Recolher a região da cauda (ou qualquer outra parte do embrião) para a genotipagem por meio do ensaio de reação em cadeia da polimerase (PCR). NOTA: Outros tecidos e órgãos podem ser colhidos de embriões E10.5 para uma análise similar usando citometria de fluxo. Sangue, cabeça de esquiN, região de aorta-gonad-mesonefros (AGM), coração e neuroectoderma podem ser coletadas em E10.5. Em estágios posteriores, o pulmão, rim, baço e pâncreas também podem ser coletados. Uma descrição detalhada da dissecação da AGM em diferentes estágios de desenvolvimento foi descrita anteriormente 14 . </li></ol> 3. Processamento de Tecidos Embrionários para Citometria de Fluxo <ol><li> Incubar os órgãos (colocados na mistura de digestão) durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Transfira o tecido e a solução enzimática para um filtro de 100 μm colocado numa placa de cultura de tecido de 6 poços preenchida com 6 ml de tampão FACS (albumina de soro bovino a 0,5% (BSA) e EDTA 2 mM em 1x PBS). Dissocie-se mecanicamente suavemente com o pistão de borracha preto de uma seringa de 2 mL para obter uma suspensão de célula única. NOTA: A partir de agora, todas as etapas devem ser realizadas a 4 ° C. </li><li> Recolher a suspensão celular com uma pipeta Pasteur e transferir para um tubo de 15 mL. </li><li> SpiN durante 7 min a 320 xg a 4 ° C. Descarte o sobrenadante por aspiração. </li><li> Ressuspender o sedimento em 60 μL de tampão bloqueador de Fc (anticorpo de bloqueio CD16 / CD32 diluído 1/50 em tampão FACS). <ol><li> Transfira 50 μL da suspensão de célula única por poço em uma placa de 96 poços múltiplos de fundo redondo. Incube durante pelo menos 15 minutos no gelo. NOTA: A coloração também pode ser realizada em tubos FACS de poliestireno de 5 mL ao manusear um pequeno número de amostras. </li><li> Transfira os 10 μL restantes para um tubo FACS de poliestireno de 5 mL para obter um conjunto das amostras de cada tecido. Este conjunto servirá como controles ( ou seja, amostras não coradas e controles fluorescentes menos um (FMO) para cada fluorochrome). Transfira 50 μL da piscina para cada controle fluorescente menos um (FMO) (um por fluorochrome) para a placa 96 multi-well. NOTA: Cada controle de FMO contém todos os anticorpos acoplados com fluorochrome do painel de anticorpos, exceto peloQue está sendo medido. Os FMOs são usados ​​para identificar os limites do portão e para controlar a sobreposição espectral em painéis multicoloridos. Para corrigir corretamente as variações de fundo e autofluorescência entre diferentes tecidos, é importante preparar esses controles a partir do conjunto de amostras de cada tecido. O controle apropriado para a expressão de YFP serão as amostras de embriões Cre-negativos, que são confirmados pela genotipagem por PCR. </li></ol></li></ol> 4. Coloração de antigénio de superfície <ol><li> Prepare a mistura de anticorpos no tampão FACS (Tabela 2). Prepare 50 μL de mistura de anticorpos por amostra. <ol><li> Use os seguintes anticorpos acoplados a fluorochrome: anti-CD45.2 (clone 104); Anti-CD11b (clone M1 / ​​70); Anti-F4 / 80 (clone BM8); Anti-AA4.1 (clone AA4.1); Anti-kit (clone 2B8); E anti-Ter119 (clone Ter119). </li><li> Prepare seis misturas de anticorpos para os controles FMO no tampão FACS. Prepare 50 μL de mistura de anticorpos por amostra de controle. NÃOTE: A diluição do anticorpo na mistura de anticorpos é duas vezes mais concentrada do que a concentração final indicada na tabela de materiais. Para um painel com seis anticorpos acoplados a fluoroquromo, são preparados 6 controles de FMO. A Tabela 2 fornece a composição da mistura de anticorpos e os controlos de FMO para um tubo. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="7"> Volume (μL) de anticorpo (Volume final 50 μL) </td></tr><tr><td> Anticorpo </td><td> Clone </td><td> Mistura de anticorpos </td><td> FMO CD45.2 </td><td> FMO CD11b </td><td> FMO F4 / 80 </td><td> FMO AA4.1 </td><td> Kit FMO </td><td> FMO Ter119 </td></tr><tr><td> Anti-CD45.2 </td><td> 104 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Anti-CD11b </td><td> M1 / 70 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> Anti-F4 / 80 </td><td> BM8 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Anti-AA4.1 </td><td> AA4.1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Anti-kit </td><td> 2B8 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> Anti-Ter119 </td><td> Ter119 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="2"> Buffer FACS </td><td> 45,5 </td><td> 46,5 </td><td> 46 </td><td> 46,5 </td><td> 46,5 </td><td> 46 </td><td> 46 </td></tr></tbody></table>Tabela 2: Volume de anticorpos usando para coloração e controles Fluorescente menos um (FMO). Volume (μL) de anticorpo necessário para um volume final de 50 μL. <ol start="2"><li> Adicione 50 μL da mistura de anticorpos às amostras na placa 96-multiwell (o volume final durante a coloração é de 100 μL). Gentilmente, pipetar para cima e para baixo duas vezes e incubar em gelo durante 30 min. </li><li> Gire a placa de 96 poços múltiplos durante 7 minutos a 320 xg a 4 ° C e descarte o sobrenadante. Ressuspender em 200 μL de tampão FACS. </li><li> Repita o procedimento de lavagem (passo 4.3) duas vezes com 150 μL de tampão FACS. </li><li> Filtre as amostras e os controles (FMOs e amostras de pool não mantidas) em 5 ml de tubos de poliestireno através de um filtro de 70 μm. Armazene no gelo até a aquisição. </li></ol> 5. Identificação de EMPs e de macrófagos derivados de YS por citometria de fluxo NOTA: Este protocolo foi otimizado usando uma eq de citometro de fluxo laser 4Extraído com um laser Violet de 405 nm, um laser azul de 488 nm, um laser amarelo de 562 nm e um laser vermelho de 638 nm. <ol><li> Prepare contas de compensação para cada anticorpo acoplado de acordo com as instruções do fabricante. Use amostras não mantidas e contas de compensação para otimizar as intensidades do laser. </li><li> Para identificar os limites do portão, use controles FMO (Fluorescência menos um) para cada anticorpo. </li><li> Para excluir células mortas, adicione 1 μL de DAPI (1 mg / ml) ao tubo (contendo 200 μL de suspensão de células coradas) 1 min antes da aquisição. Use o forte sinal DAPI e o parâmetro espalhado para frente (FSC) para executar a exclusão de células mortas e detritos. NOTA: Use o software do citómetro de fluxo para desenhar portas durante a aquisição. A matriz de compensação e a análise podem ser realizadas após a aquisição da amostra usando outro software comercialmente disponível. </li><li> Use a dispersão direta e lateral (FSC vs SSC) para executar a discriminação de células vivas e dupla de eventos totais. </li><li> Crie parcelas de pontos de fluorescência no eixo da escala de registro e desenhe os portões da filha para, primeiro, excluir os eritrócitos (Ter119 + ) e, então, identificar células progenitoras (Kit + ) e células hematopoiéticas (CD45 + Kit neg ) (Ver Figura 1 ). </li><li> Crie histogramas de fluorescência para quantificar a eficiência de rotulagem do YFP entre as diferentes populações identificadas no YS ( Figura 2 ), fígado fetal ( Figura 3 ) e cérebro ( Figura 4 ). </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

As diferentes ondas de células precursoras hematopoiéticas se sobrepõem parcialmente dentro de um curto período de tempo, o que torna a análise da contribuição de cada onda de hematopoiese de desenvolvimento para células imunes tecnicamente muito desafiadora. Os sistemas Cre induzíveis de tamoxifeno oferecem a oportunidade de marcar células específicas de forma temporariamente indutível e realizar análises de linhagem em embriões ou adultos, sem a necessidade de cultura ou transplante ex...

Existem várias ondas sucessivas mas sobrepostas de progenitores hematopoiéticos durante o desenvolvimento, cuja progenitura mielóide permanece na idade adulta. Em primeiro lugar, os progenitores &quot;primitivos&quot; unipotentes emergem no saco vitelino 1 , 2 entre E7.5-E8.25 e dão origem a macrófagos embrionários sem qualquer intermediário monocítico. Se os macrófagos derivados de progenitores primitivos persistem no cérebro adulto, uma vez que a microglia continua sendo objeto de investigação ativa. Em segundo lugar, os precursores eritemo-mieloides (EMPs) surgem no saco vitelino em E8.5, entram na corrente sanguínea e colonizam o embrião. EMPs emergem do endotélio hemogênico do saco vitelino em uma transição endotelial a hematopoiética dependente de Runx1 3 , 4 . Enquanto a EMP pode se diferenciar em macrófagos dentro do saco vitelino, eles também colonizam o fígado fetal do dia embrionário (E) 9 5 e diferemEm eritrócitos, megacariócitos, macrófagos, granulócitos de monócitos e mastócitos 6 . Os macrófagos que derivam de EMP exibem capacidade proliferativa em tecidos de desenvolvimento e adultos. Se os macrófagos derivados de EMP ignoram o estágio de diferenciação de monócitos ainda são controversos, como muito pouco se sabe sobre sua via de diferenciação 7 , 8 . Finalmente, as células estaminais hematopoiéticas (HSCs) emergem em E10.5 dentro do embrião próprio da região aorta-gonad-mesonephros e migram para o fígado fetal. Os HSCs com capacidade de repovoamento a longo prazo só são detectados após E11 (no estágio de 42 pares de somites) 9 . Lá, eles se expandem e diferenciam de E12.5 até a hematopoiese definitiva começa a se deslocar para a medula óssea, o que se torna o local predominante de produção de células sangüíneas durante a vida pós-natal 10 . O spA sobreposição temporal e temporal no surgimento, bem como os marcadores imunofotípicos compartilhados, até agora dificultaram a nossa capacidade de distinguir as contribuições específicas dessas ondas de progenitores hematopoiéticos embrionários. Enquanto tanto o EMP quanto o HSC são gerados de forma dependente do Runx1 e expressam o fator de transcrição Myb e o receptor do fator de crescimento Csf1r (Receptor do Factor Estimulante da Colônia 1, também conhecido como Receptor do Fator de Estimulação da Colônia de Macrófagos) entre outros, os EMPs podem ser distinguidos de HSCs pela falta de potencial linfóide, tanto in vitro como in vivo , a falta de potencial de repovoamento a longo prazo e a falta de expressão superficial do marcador de linhagem Sca-1 11 . Os modelos de mapeamento do destino genético são necessários para caracterizar a ontogenia dos macrófagos, uma vez que permitem alvejar progenitores embrionários de uma maneira específica de cada célula e específica do tempo. Aqui apresentamos o protocolo de mapeamento do destino usado em nosso laboratório para discriminar entre os dois linhagensS de macrófagos encontrados na maioria dos tecidos adultos: macrófagos infiltrados derivados de HSC e macrófagos residentes independentes de HSC. Os macrófagos residentes de tecido foram rastreados de acordo com células precursoras independentes de Myb expressando o receptor de citoquinas Csf1r 12 e estão presentes no embrião em E8.5-E10.5 usando três estratégias complementares de mapeamento de destino 6 . Para estudar a hematopoiese do saco vitelino sem rotulagem de HSC fetal, utilizamos uma cepa transgênica, Csf1r MeriCreMer , expressando uma proteína de fusão induzível por tamoxifeno de Cre recombinase &quot;melhorada&quot; e dois receptores de estrogênio de mouse (Mer-iCre-Mer) sob o controle de O promotor Csf1r. Assim, a Cre recombase estará ativa em células Csf1r -expressing durante uma janela de tempo limitada. Quando usado com uma estirpe repórter contendo uma proteína fluorescente a jusante de uma cassete lox-STOP-lox (Rosa26 LSL-eYFP ), isso levará ao permanenteEtiquetagem genética das células presentes no momento da indução, mas também da sua progênie. A administração em E8.5 da forma ativa de tamoxifeno, 4-hidroxitoxififeno (OH-TAM), rotula EMPs e macrófagos, sem rotulagem de progenitores &quot;primitivos&quot; unipotentes de vira-lata ou HSC fetal. Deste modo, caracterizamos o imunofenotipo de EMPs e sua progênie durante o desenvolvimento embrionário, bem como avaliaram a contribuição dos macrófagos derivados do saco de gema para os grupos de macrófagos adultos. São necessários mais trabalhos para caracterizar se os macrófagos primários progenitoros derivados também são rotulados usando essa abordagem e se eles podem contribuir para grupos de macrófagos adultos.

<table><tbody><tr><td>#5 Pinça Reta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>MC19/B Tesoura de Mola Pascheff-Wolff&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15371-92</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura reta de 8,5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553355</td><td>diluição de 1/200 em FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104)</td><td>Sony</td><td>1149120</td><td>diluição de 1/100 em FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1)</td><td>eBioscience</td><td>17-5892</td><td>Diluição de 1/100 em FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119)</td><td>Biolegend</td><td>560512</td><td>diluição de 1/200 em FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8)</td><td>BD Pharmingen</td><td>123137</td><td>diluição de 1/100 em FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70)</td><td>BD Pharmingen</td><td>552850</td><td>Diluição de 1/200 em FACs Buffer</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Fischer Scientific</td><td>12559069</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Soro Bovino</td><td>Fischer Scientific</td><td>11570506</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D&nbsp;</td><td>Placa</td><td>de</td> cultura de tecidos de 6 poços Roche 11088882001 <td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I</td><td>Sigma</td><td>D4527-20KU</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dutscher Dominique</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de tecidos de 12 poços</td><td>Dutscher Dominique</td><td>353224</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de tecidos de 24 poços</td><td>Fischer Scientific</td><td>11874235</td><td></td></tr><tr><td>96 poços de cultura de tecidos de fundo em forma de U prato</td><td>Dutscher Dominique</td><td>353227</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Seringa Plastipak 2 mL&nbsp;</td><td>Dutscher Dominique</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>Grade de Nylon 100 &micro; filtros de células m</td><td>Dutscher Dominique</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Grade de nylon 70 &micro; filtros de células m</td><td>Dutscher Dominique</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>tubos Falcon de 15 ml</td><td>Dutscher Dominique</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Stericup GP Kit de filtração Millipore, 0.2 &mu; m</td><td>Dutscher Dominique</td><td>51246</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>(Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg</td><td>Sigma</td><td>H7904-25MG Deve-se</td><td>tomar cuidado especial ao preparar e trabalhar com tamoxifeno e seus derivados. Sempre use equipamento de proteção individual apropriado</td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma</td><td>P3972</td><td>Sempre use equipamento de proteção individual apropriado</td></tr><tr><td>Óleo de rícino PEG-35 (Kolliphor/Cremophor EL)</td><td>Sigma</td><td>C5135</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de girassol</td><td>Sigma</td><td>S5007-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>24103-1L-R-D</td><td>Sempre use equipamento de proteção individual adequado e use sob a capela</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884-500G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI, 1 ML (1 MG/ML EM ÁGUA)Fischer</td> <td>Scientific</td><td>10116287</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4</td><td>Beckman Coulter</td><td>B75408</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroesferas Diárias CytoFLEX QC Beckman</td><td>Coulter&nbsp;</td><td>B53230</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Esferas de Captura de Anticorpo VersaComp (2x5 mL)</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>B22804</td><td></td></tr><tr><td>FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J</td><td>O laboratório Jackson</td><td>19098</td><td></td></tr><tr><td>B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td><td>O laboratório Jackson</td><td>6148</td><td></td></tr></tbody></table>

identificação de progenitores eritromoelóides e sua progênie no embrião de mouse por citometria de fluxo

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Os macrófagos são fagócitos profissionais do braço inato do sistema imunológico. Em estado estacionário, os macrófagos sésseis são encontrados em tecidos adultos, onde atuam como sentinelas de linha de frente e danos nos tecidos. Enquanto outras células imunes são continuamente renovadas a partir de células hematopoiéticas e progenitoras (HSPC) localizadas na medula óssea, uma linhagem de macrófagos, conhecida como macrófagos residentes, mostrou-se auto-mantida em tecidos sem a entrada de HSPC de medula óssea. Esta linhagem é exemplificada por microglia no cérebro, células de Kupffer no fígado e células de Langerhans na epiderme entre outros. A lâmina própria do intestino e do cólon são os únicos tecidos adultos desprovidos de macrófagos residentes independentes da HSPC. Pesquisas recentes identificaram que os macrófagos residentes são originários da hematopoiese do saco de gema extra-embrionária do (s) progenitor (es) distinto (s) das células estaminais hematopoiéticas do feto (HSC). Entre a hematopoiese definitiva do saco vitelino, eOs progenitores ritromoeloides (EMP) dão origem a células eritróides e mielóides, em particular macrófagos residentes. EMP só são gerados dentro do saco vitelino entre E8.5 e E10.5 dias de desenvolvimento e eles migram para o fígado fetal logo que a circulação está conectada, onde eles se expandem e diferenciam até pelo menos E16.5. Sua progênie inclui eritrócitos, macrófagos, neutrófilos e mastócitos, mas apenas os macrófagos derivados de EMP persistem até a idade adulta nos tecidos. A natureza transitória do surgimento do EMP e a sobreposição temporal com a geração de HSC tornam difícil a análise desses progenitores. Nós estabelecemos um protocolo de mapeamento de destino induzível por tamoxifeno com base na expressão do promotor Csf1r do receptor de citoquina de macrófagos para caracterizar células derivadas de EMP e EMP in vivo por citometria de fluxo.

O mapeamento do destino genético foi conseguido por administração em E8.5 de OH-TAM em fêmeas Csf1r-Mer-iCre-Mer acasaladas com machos portadores de um repórter Rosa26-LSL-eYFP. Na presença de OH-TAM, a excisão da cassete de parada leva à expressão permanente de YFP nas células que expressam Csf1r . Recolhemos dois tecidos hematopoiéticos: o saco vitelino e o fígado fetal e um tecido não hematopoiético, o neuroectoderma, dos embriões em E10.5. As suspensões de célula única foram...

Enquanto os macrófagos infiltrativos são continuamente recrutados para tecidos adultos a partir de precursores circulantes, os macrófagos residentes semeiam seu tecido durante o desenvolvimento, onde são mantidos sem mais entrada de progenitores. Os progenitores para macrófagos residentes foram identificados recentemente. Aqui, apresentamos métodos para o mapeamento do destino genético dos progenitores de macrófagos residentes.

Identificação de progenitores eritromoelóides e sua progênie no embrião de mouse por citometria de fluxo

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

O objetivo geral deste experimento é caracterizar os progenitores hematopoiéticos do saco vitelino e sua progênie in vivo, utilizando um sistema de mapeamento de linhagem induzido por tamoxifeno em camundongos e citometria de fluxo. Isso pode ajudar a responder questões fundamentais no campo da imunologia sobre o desenvolvimento e a diferenciação de progenitores hematopoiéticos distintos das células-tronco hematopoiéticas. A principal vantagem desta técnica é que os progenitores hematopoiéticos marcados dentro de uma janela de tempo limitada, bem como sua progênie, como macrófagos residentes, podem ser monitorados durante o desenvolvimento e na vida adulta.De modo geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido à quantidade de células no tecido embrionário e ao grande volume das amostras tratadas simultaneamente. Para iniciar o experimento, transfira primeiro os cornos uterinos de camundongo dissecados para uma placa de Petri de 10 milímetros contendo aproximadamente 30 mililitros de PBS gelado. Imediatamente após, segure as camadas musculares do útero na extremidade cervical do corno e deslize uma tesoura fina entre a camada muscular e o tecido deciduial para

identification-erythromyeloid-progenitors-their-progeny-mouse-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Um método de citometria de fluxo para a identificação e análise molecular da diferenciação estágio específico progenitores eritróides murino e precursores, diretamente na medula recém-colhidas do mouse óssea, baço ou o fígado fetal. O ensaio baseia-se na superfície celular marcadores CD71, Ter119 e tamanho da célula.

Identificação e Análise de Progenitores rato Eritróides usando o CD71/TER119 Assay citometria de fluxo-

Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

O presente protocolo descreve um novo método para a identificação de uma população de enuclear eritroblastos ortocromaticos pelo fluxo de imagem multi-espectral citometria, proporcionando uma visualização do processo de enucleação dos eritroblastos.

Identificação de um Murino eritroblasto subpopulação enriquecido em enucleação Eventos da Multi-espectral de imagem de Citometria de Fluxo

Demonstramos como identificar e isolar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de murino medula óssea usando uma combinação de magnética e fluorescência classificação (MACS e FACS). Este protocolo pode ser usado para ensaios em vitro cultura (culturas metilcelulose ou líquido), na vivo experiências de transferência adotiva e análises de RNA/proteína.

Identificação e isolamento de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores da medula óssea de rato

Descrevemos aqui uma simples análise da heterogeneidade do compartimento de células B imunes da murina nos tecidos peritônio, baço e medula óssea por citometria de fluxo. O protocolo pode ser adaptado e estendido a outros tecidos do mouse.

Caracterização citométrica de fluxo do desenvolvimento de células B murinas

Aqui, descrevemos um protocolo simples para o isolamento e coloração de células murinas da medula óssea para fenótipo de células-tronco hemopoéticas e progenitoras, juntamente com células-tronco endoteliais e mesenquimais de nicho de suporte. Um método para enriquecer células localizadas em áreas endosteal e medula óssea central também é incluído.

Análise por Citometria de Fluxo de Medula Óssea Purina, Células-Tronco e Progenitoras Hematopoéticas e Células de Nicho Estromal

Aqui, descrevemos um novo método citométrico de fluxo para isolamento prospectivo de progenitores eritróides de unidade formadora de explosão precoce (BFU-e) e eritróides de unidade formadora de colônias (UFC-e) diretamente da medula óssea e do baço frescos de camundongos. Este protocolo, desenvolvido com base em dados transcriptômicos de célula única, é o primeiro a isolar todos os progenitores eritróides do tecido com alta pureza.

Identificação e Isolamento de Progenitores Eritróides da Unidade Formadora de Explosão e da Unidade Formadora de Colônias de Tecido de Camundongo por Citometria de Fluxo

Este artigo descreve a metodologia in vivo e in vitro para caracterizar os progenitores de decantação tímica pela análise da cinética de geração, fenótipo e número de suas progênies de células T.

Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Os ensaios

Aqui, apresentamos um protocolo de cultura de arcos faríngeos para estudar a biologia das células progenitoras do coração e do músculo e seu microambiente.

Ex Cultura Vivo de Pharyngeal Arcos para estudo do coração e do músculo Progenitores e seu nicho

Descrevemos uma estratégia de classificação para espermátides de camundongos usando citometria de fluxo. As espermátides são classificadas em quatro populações altamente puras, incluindo espermogênese redonda (etapas 1-9 da espermiogênese), alongamento precoce (etapas 10-12 da espermiogênese), alongamento tardio (etapas 13-14 da espermiogênese) e espermátides alongadas (etapas 15-16 da espermiogênese). A coloração, o tamanho e a granulosidade do DNA são usados como parâmetros de seleção.

Passo-específico Seleção de mouse Espermátides por citometria de fluxo

Aprenda a caracterizar progenitores hematopoéticos do saco vitelino e sua progênie em embriões de mouse usando um sistema de mapeamento de destino induzido por tamoxifeno e citometria de fluxo. Este método permite rastrear macrófagos residentes durante o desenvolvimento.

Identificação de progenitores eritromoelóides e sua progênie no embrião de mouse por citometria de fluxo

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