Name: Mesclando Ion polarização de concentração entre justapostos Troca Iônica Membranas para bloquear a propagação da Zona Polarização (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Aprenda a preconcentrar bioagentes usando polarização de concentração iônica entre membranas permutadoras de cátions. Este método permite detectar biomoléculas em baixa abundância com controle preciso da zona de ICP.

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Este trabalho foi apoiado pelo fundo interno do Instituto Coreano de Ciência e Tecnologia (2E26180) e pelo programa Next Generation Biomedical Device Platform, financiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF-2015M3A9E202888).

1. Fabricação de troca catiônica chips microfluídicos de membrana integrada <ol><li> Preparação de mestres de silício <ol><li> Design de dois tipos de mestres de silício: um para padronização uma resina de troca catiônica e outro para a construção de um microcanal com polidimetilsiloxano (PDMS). NOTA: A geometria detalhe será descrito nos passos 1.3.1 e 1.4.1. </li><li> Fabricar os mestres de silício usando um fotolitografia convencional ou de iões reactivos profunda gravura 27. </li><li> Silanizar os mestres de silício micropatterned com trichlorosilane (~ 30 mL) em um frasco de vácuo durante 30 minutos. CUIDADO: Triclorosilano é um líquido pirofórico que é inflamável e tem uma toxicidade aguda (inalação, ingestão oral). </li></ol></li><li> Preparação de moldes PDMS <ol><li> Misture uma base de elastômero de silicone com um agente de cura em uma proporção de 10: 1 e coloque o copo com este PDMS não curado(30-40 mL para a replicação de microestruturas em um 4-silício em bolacha) em um frasco de vácuo durante 30 min para remover as bolhas. NOTA: A base de silicone contém oligómeros de siloxano que terminam com grupos de vinilo e de um catalisador à base de platina. O agente de cura contém reticulação oligômeros que têm três ligações silício-hidreto 28. </li><li> Verter o PDMS não curado dos modelos de silício, remover as bolhas com um ventilador, e curar o PDMS a 80 ° C durante 2 h num forno de convecção. </li><li> Separar os PDMS curados dos mestres de silício e moldar correctamente o PDMS com uma faca (formas quadradas, como se mostra na Figura 2a-b, IV). </li></ol></li><li> Padronização das membranas de permuta catiónica <ol><li> Cortar a metade do molde PDMS perpendicularmente aos dois microcanais paralelos e perfurar orifícios nas extremidades dos canais de PDMS com um perfurador de biópsia de 2,0 mm. NOTA: O molde PDMS para padronização da membrana seletiva cação tem dois parmicrocanais ALLEL (largura: 100 mm; altura: 50 mm; Interchannel distância: 100 um; Figura 1A). A forma original do molde pode ser imaginado por espelhamento do molde cortado ao longo da linha de corte. microcanais em forma de L são recomendados para perfurar os dois buracos sem sobreposição. </li><li> Limpar uma lâmina de vidro e o molde PDMS com fita adesiva e um ventilador e colocar o molde sobre a lâmina de vidro para criar fixação reversível entre eles. </li><li> De acordo com a técnica de modelação 29 microfluxo, libertação ~ 10 mL de uma resina de permuta catiónica na extremidade aberta do canal que foi cortado no passo 1.3.1 (Figura 1B). Coloque a cabeça de seringa sobre os furos e puxar o êmbolo (setas pretas na figura 1b); uma suave pressão negativa vai puxar a resina de permuta de catiões, e a resina vai encher os dois canais. NOTA: Recomenda-se que a altura do microcanal é maior do que 1581; m, por causa da alta viscosidade da resina exige alta pressão para encher os canais. Por outro lado, é melhor do que a altura não exceda 100 um, porque a membrana selectiva de iões modelado irá tornar-se mais espessa do que 1 uM; uma membrana tal espessura pode criar um intervalo entre a membrana e o canal 13 de PDMS. </li><li> Separe o molde PDMS sem tocar na resina modelado e colocar a lâmina de vidro sobre o aquecedor, a 95 ° C durante 5 minutos para evaporar o solvente na resina. NOTA: A espessura da membrana modelado é geralmente inferior a &lt;1 uM. O molde é suavemente destacada pelo que articula-se o molde para o lado aberto (linha pontilhada e seta na Figura 1b). É melhor separar o molde inferior a 1 min após o enchimento da resina. Se o molde é separado de alguns minutos mais tarde, pode ser obtido membranas mais espessas, mas teriam uma forma côncava, devido ao efeito capilar. </li><li> Retire o desnecessárioparte da membrana modelado com uma lâmina de barbear, fazendo duas separadas linha-padrões (Figura 1C). NOTA: O material de permuta de catião utilizada aqui tem grupos perfluorados, o que significa que o padrão não está fortemente ligado ao vidro. Portanto, o método de patins em linha simples pode facilmente remover a parte desnecessária da membrana. </li></ol></li><li> Integração do microcanal e o substrato-padrão membrana <ol><li> Perfurar dois buracos nas extremidades dos microcanais e mais dois furos, onde os padrões de membrana vai ser localizadas após a colagem, o canal de PDMS ao substrato modelado-membrana fabricada no passo 1.3. Nota: O microcanal o PDMS tem um canal (largura: 50-100 uM; altura: 10 mm), mas está ligado às extremidades do canal vizinho (Figura 1D). </li><li> Vínculo do microcanal PDMS ao substrato-padrão membrana imediatamente após o tratamento de plasma de oxigênio durante 40 s em 100 W e 50 mTorr. NOTA: Colocar a membrana modelado de modo perpendicular no meio do microcanal. </li></ol></li></ol> 2. ICP pré-concentração <ol><li> Preparação para o experimento <ol><li> Preparar várias soluções de teste, incluindo KCl 1-100 mM, NaCl a 1 mM (pH ~ 7), a mistura de NaCl a 1 mM e 0,2 mM HCl (pH ~ 3,7), a mistura de NaCl e 1 mM de NaOH a 0,2 mM (pH ~ 10.3), e 1 x solução salina tamponada com fosfato. </li><li> Adicionar um corante fluorescente com carga negativa (~ 1,55 mM) às soluções de teste. NOTA: A concentração do corante adicionado deve ser muito menor do que os iões de sal (&lt;10 um), de modo que os corantes carregadas não contribuem para uma corrente eléctrica 30, 31. </li><li> Carregar a solução amostra em um reservatório do canal e aplicar pressão negativa para o outro reservatório para encher o canal com a solução. Ligue os dois reservatórios hydrodynamically por releasing uma grande gota para eliminar o gradiente de pressão ao longo do canal (Figura 2a). </li><li> Encher os dois reservatórios, que são ligados aos padrões de permuta catiónica, com soluções tampão (1 M de KCl ou de NaCl 1 M) utilizando uma seringa ou uma pipeta para compensar o efeito ICP nos reservatórios. </li><li> Colocar os fios nos reservatórios, através das duas membranas estampados (ânodo sobre o reservatório de cátodo esquerda e à direita), e ligá-los com uma unidade de medição de fonte (Figura 2a). </li></ol></li><li> A visualização do fenômeno ICP e ICP pré-concentração <ol><li> Carregar o dispositivo ICP num microscópio de epifluorescência invertida. Aplicar uma tensão (0,5100 V) e medir a resposta atual com uma unidade de medida de origem. </li><li> Capturar imagens fluorescentes com uma câmara de dispositivo de carga acoplada e analisar a intensidade de fluorescência utilizando software de imagem 32. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Nós descrevemos o protocolo de fabricação e o desempenho de um preconcentrator espaço-temporalmente definida numa gama de tensão aplicada (0,5-100 V), a força iónica (1-100 mM) e pH (3,7-10,3), conseguindo um 10.000 vezes pré-concentração de corantes e proteínas dentro de 10 min. Como tal como dispositivos ICP anteriores, o desempenho pré-concentração torna-se melhor em maior tensão e na força iónica inferior. Um parâmetro adicional que pode considerar aqui é a distância entre duas membranas de permuta catiónica. Se aum...

Ion concentração polarização (ICP) refere-se a um fenómeno que ocorre durante o enriquecimento de iões e depleção iónica numa membrana de permeabilidade selectiva, o que resulta numa queda de potencial adicional com gradientes de concentração de iões de 1, 2. Este gradiente de concentração é linear, e torna-se mais acentuada como uma tensão mais alta é aplicada (regime óhmica) até que a concentração de iões na membrana se aproxima de zero (regime limitante). Neste estado limitada pela difusão, o gradiente (e correspondente fluxo de iões) tem sido conhecido por ser maximizada / 1 saturado. Para além deste entendimento convencional, quando a tensão (ou corrente) é aumentada ainda mais, uma corrente overlimiting é observado, com zonas de depleção planas e gradientes de concentração muito afiadas no limite da zona 1, 3. A zona plana tem uma concentração muito baixa de iões, mas condução de superfície, electro-osmoti<html> C fluxo (EOF), e / ou instabilidade electro-osmótico promover o fluxo de iões e induzir uma corrente overlimiting 3, 4, 5. Curiosamente, a zona de depleção plana serve como uma barreira electrostática, que filtra 6, 7, 8, 9 e / ou pré-concentrados de alvo 10, 11. Uma vez que há uma quantidade insuficiente de íons para examinar as cargas de superfície de partículas carregadas (por eletroneutralidade satisfatória), as partículas não podem passar por esta zona de depleção e, portanto, alinhar a sua fronteira. Este efeito não-linear ICP é um fenômeno genérico em vários tipos de membranas 10, 11, 12, 13,&gt; 14 e geometrias 6, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21; é por isso que os pesquisadores foram capazes de desenvolver vários tipos de filtração 6, 7, 8, 9 e pré-concentração 10, 11 dispositivos usando o ICP não-linear. Mesmo com essa alta flexibilidade e robustez, ainda é um desafio prático para esclarecer as condições de funcionamento dos dispositivos ICP não-lineares. O regime não-linear do ICP rapidamente remove catiões através de uma membrana de permuta de catiões, o que faz com que o deslocamento dos aniões que se deslocam em direcção ao ânodo. Como umresultado, a zona de depleção plana se propaga rapidamente, o que é uma reminiscência de propagação de choque 22. Mani et al. chamado esta dinâmica da deionização (ou esgotamento) chocar 23. Para pré-concentrado para alvos a uma posição de detecção designado, evitando a expansão da zona de depleção de ião é necessária, por exemplo, através da aplicação de EOF ou fluxo orientado a pressão contra a zona de expansão 24. Zangle et ai. 22 clarificados os critérios para propagação ICP num modelo unidimensional, e é altamente dependente da mobilidade electroforética 17, 18 a força iónica, pH 25, e assim por diante. Isto indica que as condições de funcionamento apropriadas serão alterados de acordo com as condições da amostra. Aqui, apresentamos o projeto detalhado e protocolos experimentais para uma plataforma nova ICP que prï¿½concentrados alvos dentro de um spatiotemporalmente posição 26 definida. A expansão da zona de depleção de iões é bloqueada pela zona de enriquecimento de iões, deixando um tampão de pré-concentração estacionária numa posição atribuído, independentemente do tempo de funcionamento, a tensão aplicada, a força iónica e pH. Este protocolo de vídeo detalhada destina-se a mostrar o método mais simples para integrar membranas de permuta catiónica em dispositivos de microfluidos e para demonstrar o desempenho de pré-concentração da nova plataforma ICP em comparação com o convencional.

<table><tbody><tr><td>Kit de elastômero de silicone Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triclorossilano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175552</td><td></td></tr><tr><td>Resina perfluorada Nafion altamente tóxica, 20</td>% <td>em peso Sigma Aldrich</td><td>527122</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71394</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60121</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ácido carboxílico, éster succinimidílico</td><td>Invitrogen</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>Albumina conjugada com isotiocianato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9771</td><td></td></tr><tr><td>Tampão fosfato salino, 1x</td><td>Wengene</td><td>LB004-02</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de epifluorescência</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>Acoplado com carga câmera do dispositivo</td><td>Hamamtsu Co.</td>Unidade de medida de fonte <td>ImageEM X2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Keithley Instruments</td><td>2635A</td><td></td></tr><tr><td>Covance-MP</td><td>Femto Science</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mesclando ion polarização de concentração entre justapostos troca iônica membranas para bloquear a propagação da zona polarização

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

O fenômeno de polarização concentração de íons (ICP) é um dos métodos mais prevalentes para prï¿½concentrado amostras biológicas baixa abundância. O ICP induz uma região não-invasivo para biomoléculas carregadas (isto é, a zona de depleção de íons), e as metas podem ser preconcentrados nesta limite da região. Apesar das elevadas performances de pré-concentração com ICP, é difícil encontrar as condições de funcionamento de zonas não-propagação de depleção de íons. Para superar esta janela operacional estreita, que recentemente desenvolveu uma nova plataforma para pré-concentração espaço-temporalmente fixo. Ao contrário dos anteriores métodos que utilizam apenas o esgotamento de iões, esta plataforma também utiliza a polaridade oposta da ICP (ou seja, o enriquecimento de iões) para parar a propagação da zona de depleção de iões. Ao confrontar a zona de enriquecimento com a zona de depleção, as duas zonas se fundem e parar. Neste trabalho, nós descrevemos um protocolo detalhado experimental para construir este platf ICP espaço-temporalmente definidaORM e caracterizar a dinâmica pré-concentração da nova plataforma, comparando-os com os do dispositivo convencional. perfis de concentração de iões qualitativos e respostas em tempo atual capturar com sucesso as diferentes dinâmicas entre o ICP resultante da concentração e do ICP stand-alone. Em contraste com o convencional que pode fixar a localização pré-concentração em apenas ~ 5 V, a nova plataforma pode produzir um plug-condensado alvo num local específico nas amplas gamas de condições de operação: tensão (0,5-100 V), a força iónica (1-100 mM) e pH (3,7-10,3).

As etapas de fabrico esquemático de um preconcentrator microfluidos integrado à membrana são mostrados na Figura 1. Uma descrição detalhada da invenção é dada no protocolo. Os desenhos e imagens de dispositivos do preconcentrator espaço-temporalmente definido 26 são contrastados com os de um convencional preconcentrator 11 (Figura 2). O fenómeno ICP na preconcentrator espaço-temporalmente definido foi inves...

O protocolo para uma plataforma nova polarização da concentração de iões (ICP) que pode parar a propagação da zona de ICP, independentemente das condições de funcionamento é descrito. Esta capacidade única da plataforma encontra-se na utilização de fusão depleção de iões e de enriquecimento, que são duas polaridades do fenómeno ICP.

Mesclando Ion polarização de concentração entre justapostos Troca Iônica Membranas para bloquear a propagação da Zona Polarização

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

O objetivo geral deste experimento é pré-concentrar bioagentes confinando a zona de polarização da concentração iônica entre duas membranas idênticas de troca iônica. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área, como a detecção de biomoléculas de baixa abundância quando sua concentração é inferior ao limite de detecção do sensor. A principal vantagem desta técnica é que podemos gerar uma zona de ICP e pré-concentrar o bioagente em uma colisão muito específica, independentemente das condições de operação.Para iniciar este procedimento, utilize fotolitografia convencional ou gravura a plasma reativa profunda para fabricar moldes de silício para os microcanais de polidimetilsiloxano e as membranas seletivas a cátions. Coloque os moldes de silício em um dessecador a vácuo com cerca de 30 microlitros de triclorosilano. Feche o dessecador e silanize os moldes de silício por 30 minutos.Em seguida, misture uma base de elastômero de silicone e um agente de cura na proporção de 10 para 1 em peso para obter PDMS não curado. Desgaseifique a mistura sob vácuo por 30 minutos. Em seguida, despeje o PDMS não curado desgaseificado sobre os moldes de silício.Remova as bolhas d

merging-ion-concentration-polarization-between-juxtaposed-ion

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Bicamadas lipídicas planas, também chamado de bicamadas lipídicas artificiais, permitem a realização de estudo de iões de canais em um ambiente bem definido. Aqui, demonstramos os passos individuais necessários para preparar a câmara de bicamada, os eletrodos e como testar se a bicamada é adequado para um único canal de medições.

Preparação de Bicamadas Artificial para Experimentos Eletrofisiologia

Isotachophoresis (ITP) é uma separação eletrocinética robusto e técnica de pré-concentração com aplicações que vão desde a detecção da toxina da preparação da amostra. Revemos os princípios físicos de ITP ea metodologia de aplicar esta técnica para dois exemplos de aplicações específicas: separação e detecção de moléculas pequenas e purificação de ácidos nucleicos a partir de lisados ​​de cultura de células.

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Aprenda a preconcentrar bioagentes usando polarização de concentração iônica entre membranas permutadoras de cátions. Este método permite detectar biomoléculas em baixa abundância com controle preciso da zona de ICP.

Mesclando Ion polarização de concentração entre justapostos Troca Iônica Membranas para bloquear a propagação da Zona Polarização (Vídeo) | JoVE Journal

Mesclando Ion polarização de concentração entre justapostos Troca Iônica Membranas para bloquear a propagação da Zona Polarização

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