A escala do Engineered enxertos vasculares Usando 3D Impresso Guides and the Ring método de empilhamento

O objetivo geral deste método é gerar de forma robusta e consistente vasos sanguíneos projetados de qualquer tamanho. Esta técnica permite a engenharia confiável e eficaz de vasos sanguíneos. A principal vantagem dessa técnica é que vasos de qualquer tamanho podem ser fabricados de maneira fácil e confiável.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando estávamos discutindo como projetar um tubo de tecido e comparamos nosso método à construção de túneis rodoviários, um segmento de cada vez. Para preparar as inserções impressas em 3D, primeiro adicione uma fina camada de dois, quatro ou seis mL de silicone não curado no fundo de uma placa de Petri de 35, 60 ou 100 milímetros, respectivamente. Para criar postes para as placas de 35 mm, despeje o PDMS em uma placa diferente de 100 mm a uma altura de sete mm e aqueça o PDMS em uma placa de aquecimento a 60 graus Celsius por duas a três horas.

Quando o PDMS estiver curado, use um punção de biópsia de cinco mm para criar pinos cilíndricos. Usando uma pequena quantidade de PDMS não curado para prender os cilindros ao centro de cada placa de 35 mm. Coloque um invólucro externo impresso em 3D com cerca de 66,7 mm de diâmetro equidistante do poste nas placas de 100 mm.

Antes de o PDMS na parte inferior das placas de 60 e 100 mm ser curado, coloque postes impressos em 3D de 10 e 20 mm de diâmetro centralmente em cada placa de 60 e 100 mm, respectivamente. Deixe os pratos curarem ao ar livre na placa de aquecimento a 60 graus Celsius por duas a três horas, seguido de dezoito horas de desgaseificação do polímero. No final da desgaseificação, esterilize o interior de todas as placas com etanol a 70% e cubra cada placa por 30 minutos.

Em seguida, aspire cuidadosamente o etanol de cada placa para permitir a secagem ao ar. Quando as placas estiverem secas, transfira-as para um armário de segurança biológica próximo às tampas voltadas para cima correspondentes. e exponha os materiais à luz ultravioleta por 30 minutos para completar a esterilização.

Para preparar o hidrogel de fibrina, adicione primeiro 0,5, 1,1 e 1,81 mL de meio de crescimento suplementado com gel de fibrina e TGF Beta 1 a placas de cultura de 35, 60 e 100 mm, respectivamente. Em seguida, adicione 40, 88,4 e 145 microlitros de trombina às placas de 35, 60 e 100 mm, respectivamente, e gire suavemente cada placa com a mão. Quando a trombina estiver uniformemente distribuída, adicione 160, 354 e 580 microlitros de fibrinogênio com um movimento circular gota a gota à mistura do meio de trombina nas placas de 35, 60 e 100 mm, respectivamente, e gire suavemente as placas para distribuir uniformemente o hidrogel.

Deixe o hidrogel curar por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, tripsinizar as células musculares lisas de interesse, expandidas em placas de cultura de células de 150 mm, e coletar as células destacadas por centrifugação. Ressuspenda os pellets em três ml de meio de diferenciação e use uma pipeta de dois mL para triturar vigorosamente as células para quebrar quaisquer aglomerados de células.

Após a contagem, dividir as células em 2/10 10 elevado à 6ª, 1/10 10 elevado à 7ª e 1,4 x 10 elevado à 7ª células por alíquotas de mL em tubos cônicos de 50 ml, marcados de acordo com suas placas de cultura correspondentes. Adicione meio de diferenciação a cada tubo para obter volumes finais de semeadura de dois, quatro e cinco mL para cada placa de 35, 60 e 100 mm, respectivamente Em seguida, adicione cuidadosamente as soluções celulares gota a gota no hidrogel preparado em cada placa correspondente para expansão na incubadora de cultura de células. Depois de dois a quatro dias, os anéis terão se contraído completamente em direção aos seus postes.

Portanto, adicione 10, 20 ou 35 mL de TGF Beta 1 a cada anel de 35, 60 e 100 mm, respectivamente. Para montar a construção vascular para o vaso de 35 mm, corte uma seção de duas polegadas do topo de 50 mL de um tubo cônico de policarbonato E o PDMS cole a borda superior em uma placa de 35 mm para criar uma placa alta para empilhamento de anéis. Para as placas de empilhamento de anéis altos de 60 e 100 mm, corte um tubo de policarbonato de 1,75 polegadas de diâmetro em seções de 2,5 polegadas no sentido do comprimento para servir como paredes de placas altas.

Para os fundos de placas altas, corte uma folha de policarbonato de 0,125 polegada de espessura em pedaços circulares de duas polegadas de diâmetro. Usando cimento solvente acrílico, ligue as seções do tubo de policarbonato às peças circulares cortadas. Imprima em 3D postes de cinco, dez e 20 mm de diâmetro com 50 mm de comprimento.

Em seguida, adicione 10 mL de silicone não curado a cada recipiente, colocando centralmente cada pino impresso em 3D em cada recipiente de 35, 60 e 100 mm antes que o PDMS esteja completamente curado. E coloque os pratos em uma placa de aquecimento a 60 graus Celsius por duas a três horas. Quando o PDMS estiver curado, esterilize as placas com etanol a 70% como acabamos de demonstrar, seguido pela exposição dos recipientes esterilizados com etanol seco à luz ultravioleta por 30 minutos.

Agora, use dois pares de pinças muito finas para levantar cuidadosamente primeiro um lado e depois o outro de um anel de hidrogel de músculo liso bem enrolado de seu poste. Em seguida, deslize cuidadosamente um lado do anel e depois o outro no poste alto do recipiente maior do tamanho seguinte correspondente. Trabalhando circunferencialmente, com movimentos suaves e graduais, empurre lentamente o anel para baixo no poste, empilhando anéis de tecido adicionais até que o comprimento desejado do vaso seja obtido.

Quando todos os anéis estiverem empilhados, gire as placas de modo que fiquem paralelas à superfície de trabalho e adicione suavemente 40, 80 e 160 microlitros de trombina à superfície externa de cada vaso de 35, 60 e 100 mm, respectivamente, enquanto gira lentamente as placas. Em seguida, adicione 40, 80 e 160 microlitros de fibrinogênio a cada construção de 35, 60 e 100 mm, respectivamente, o mais rápida e uniformemente possível, enquanto gira rapidamente a construção. A trombina e o fibrinogênio se transformarão rapidamente em um gel firme após a mistura.

Em seguida, adicione 20 mL de meio de diferenciação a cada recipiente de construção e coloque os recipientes em uma incubadora de 37 graus Celsius até que seja necessário. A análise histológica revela uma alta celularidade em todos os tamanhos de anéis, com uma pequena quantidade de gel de fibrina residual observada nas bordas externas dos pequenos anéis. Nos anéis maiores, algum gel de fibrina é intercalado com o conteúdo celular, com indicações de produção de colágeno aparentes nos anéis intermediário e grande.

A análise do anel tecidual para a expressão de actina e tropomiosina do músculo liso alfa revela que todos os tamanhos dos anéis são positivos para ambos os anticorpos, verificando que o fenótipo do músculo liso foi mantido. O teste de tração indica uma tendência consistente de aumento da resistência correlacionada com o aumento do tamanho do anel e do vaso em todos os três tamanhos de anéis. Os números de semeadura de células para criar os vários tamanhos de anel também se correlacionam com a área de superfície de semeadura.

Essas construções de vasos também são capazes de suportar o fluxo por até cinco minutos em taxas de fluxo de 100 a 417 ml por minuto, com apenas um pequeno vazamento observado onde os vasos se conectam ao sistema de profusão. Uma vez dominados, os anéis podem ser projetados em uma hora se a técnica for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de misturar bem os componentes do hidrogel para garantir a fixação do gel e a formação adequada do anel.

Após este procedimento, outros métodos, como a criação de anéis de outros tipos de células, podem ser realizados para a engenharia de outros tipos de tecidos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o método de empilhamento de anéis para projetar tecidos vasculares de vários tamanhos.