Um ensaio de HS-MRM para a quantificação de proteínas de célula hospedeira em biofármacos de proteínas por espectrometria de massa líquida cromatografia iônica mobilidade QTOF

O objetivo geral do ensaio HS-MRM é reduzir o fenômeno de interferência MRM que afeta a quantificação de peptídeos ou proteínas, combinando a separação da mobilidade iônica de precursores de peptídeos com a detecção espectrométrica de massa de alta resolução de íons fragmentados. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na área de caracterização bioterapêutica, bem como quantificação de biomarcadores de proteínas ou peptídeos e proteômica quantitativa. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a detecção de proteínas de células hospedeiras pouco abundantes que podem estar presentes em proteínas biofarmacêuticas.

Primeiro, clique em criar método de análise no software de aquisição de dados e escolha gerar e adquirir e processar método. Digite o nome e a descrição do método, navegue até a pasta do método e clique em Avançar. Para o tipo de análise, escolha mapa peptídico IMS e clique em Avançar.

Em seguida, selecione a configuração atual do sistema e clique em Avançar e concluir. No método recém-criado, clique na guia de instrumentos, selecione o gerenciador de solvente binário e edite as configurações de gradiente para obter a separação de peptídeos a uma taxa de fluxo de 0,2 mililitros por minuto. Use uma diluição gradiente de um a 40% de solvente B em 30 minutos, seguida por uma lavagem em coluna de dois minutos e um equilíbrio de 10 minutos com um tempo total de execução de 45 minutos.

Em seguida, selecione o gerenciador de amostras e defina a temperatura da amostra para 10 graus Celsius e a temperatura da coluna para 60 graus Celsius. Na guia de instrumentos, selecione o instrumento Vion IMS QTde. Na seção de configurações, selecione a sensibilidade para o modo analisador e insira três quilovolts para tensão capilar, 100 graus Celsius para temperatura de origem, 250 graus Celsius para temperatura de dessolvatação, 50 litros por hora para fluxo de gás cônico e 500 litros por hora para fluxo de gás de dessolvatação.

Clique na guia do experimento e selecione MSE de alta definição para o modo. Em seguida, insira 100 para massa baixa, 2000 para massa alta e 0,4 segundos para tempo de varredura. Na seção de energia de colisão, digite seis elétron-volts para a configuração de baixa energia e escolha uma rampa de alta energia de 15 a 40 elétron-volts.

Para o tempo de aquisição, use um runtime personalizado entre cinco e 30 minutos. Em seguida, clique na guia de opções e selecione o modo de correção automática de bloqueio com um intervalo de correção automática de bloqueio de cinco minutos. Em seguida, selecione a opção continuar com correção de bloqueio e certifique-se de que a verificação automática do detector esteja desativada.

No menu de configuração do sistema atual, selecione o instrumento Vion IMS QTof e clique em ferramentas. Insira três quilovolts para tensão capilar, 40 volts para cone de amostragem, 100 volts para deslocamento da fonte, 100 graus Celsius para temperatura da fonte, 250 graus Celsius para temperatura de dessolvatação, 50 litros por hora para fluxo de gás de cone, 500 litros por hora para fluxo de gás de dessolvatação e três quilovolts para tensão capilar de referência. Analise uma amostra de 10 nanomolares com pontas falsas previamente preparada usando o ensaio LC-HDMSE que acabamos de descrever, injetando 10 microlitros de amostra no instrumento.

As sequências individuais de seis padrões de peptídeos de fosforilase B contidos na mistura de peptídeos falsos são mostradas aqui, juntamente com seus tempos de retenção e seus precursores mais abundantes observados no experimento HDMSE. Os espectros de HDMSE adquiridos para um dos peptídeos falsos enriquecidos no digesto Infliximabe são exibidos aqui. No software de aquisição de dados, clique em criar método de análise e escolha gerar e adquirir e processar método.

Digite o nome e a descrição do método, navegue até a pasta do método e clique em Avançar. Para o tipo de análise, escolha quantificar, selecione Quantificar Ensaio Tof 2D Cromatográfico e clique em Avançar. Em seguida, selecione a configuração atual do sistema e clique em Avançar e concluir.

Clique na guia de instrumentos no método recém-criado. Selecione o gerenciador de solvente binário e edite as configurações de gradiente para obter a separação de peptídeos a uma taxa de fluxo de 0,2 mililitros por minuto. Use diluição gradiente de um a 40% de solvente B em 30 minutos, seguida de uma lavagem em coluna de dois minutos e um equilíbrio de 10 minutos com um tempo total de execução de 45 minutos.

Na guia de instrumentos, selecione o gerenciador de amostras e defina a temperatura da amostra para 10 graus Celsius e a temperatura da coluna para 60 graus Celsius. Agora selecione o instrumento Vion IMS QTof e, na seção de configurações, selecione a sensibilidade para o modo analisador. Em seguida, insira três quilovolts para tensão capilar, 100 graus Celsius para temperatura de origem, 250 graus Celsius para temperatura de dessolvatação, 50 litros por hora para fluxo de gás cônico e 500 litros por hora para fluxo de gás de dessolvatação.

Clique na guia do experimento e, para o tipo de experimento, escolha a tabela de funções uma ou mais funções MS, MSMS ou MRM. Exclua a função de aquisição padrão, clique em adicionar mais MRM e edite os parâmetros da janela de retenção na seção de tempo de execução. No editor de funções Tof MRM, insira a taxa de carga mestre do precursor do peptídeo, selecione baixa para a resolução do precursor e insira o estado de carga do precursor.

Em seguida, insira a taxa de carga mestre do produto 16 elétron-volts para a energia de colisão inicial, 0,1 segundos para o tempo de varredura fixo e ampla para a coluna de espectro. Usando o botão duplicar, adicione mais 10 transições MRM e use diferentes valores de energia de colisão na faixa de 18 a 36 elétron-volts. Depois de estabelecer as três melhores transições para cada peptídeo, um experimento Tof MRM foi realizado para encontrar a energia de colisão ideal para maximizar os sinais gerados para cada peptídeo.

Em seguida, configure um método HS-MRM contendo apenas um íon fragmento por peptídeo. Modifique o método Tof MRM criado anteriormente selecionando a função HS-MRM em vez da função Tof MRM. No editor de funções HS-MRM, insira a taxa de carga mestre, selecione baixa para resolução do precursor e insira o estado de carga do precursor.

Em seguida, insira o valor CCS precursor e selecione baixo para a resolução CCS precursora. Para o íon produto, insira sua taxa de carga mestre, selecione a energia de colisão ideal, escolha um tempo de varredura de 0,4 segundos e selecione uma configuração de amplo espectro para incluir todos os seus isótopos. O ensaio HS-MRM final retém apenas a melhor transição para cada peptídeo e é usado para analisar todas as amostras enriquecidas.

No método de análise criado para o método de aquisição de dados HS-MRM, clique na guia de finalidade e escolha gerenciar componentes. No menu suspenso em tipo de experimento, selecione a opção HS MSMS/HS MRM. Clique em criar e insira o nome do componente, o tempo de retenção esperado, a janela de tempo de extração e a taxa de carga mestre do precursor.

Selecione o modo de extração XIC e digite o valor CCS esperado. Para o íon fragmento, insira seu estado de carga e taxa de carga mestre. Em seguida, insira todos os componentes peptídicos monitorados pelo ensaio HS-MRM.

Na guia de finalidade do mesmo método de aquisição HS-MRM, clique nos valores padrão e insira 0,1, um, 10 e 100 nanomolares para todos os componentes de peptídeos falsos. Depois de inserir o primeiro valor, clique com o botão direito do mouse e selecione a opção de preenchimento para inserir a mesma concentração para todos os componentes. Repetir o mesmo procedimento para as quatro concentrações da curva de calibração.

Agora vá para a guia de processamento e clique em configurações de extração. Insira 10 PPM para tolerância de massa. Em seguida, clique em tolerância de tempo de desvio CCS e insira 5% para tolerância CCS.

Na guia de processamento, selecione as configurações de processamento de pico. Na seção suave, selecione média como o algoritmo de suavização, um como a meia largura e outro como as iterações. Na seção integrar, certifique-se de que as opções de largura de pico automático e detecção automática estejam marcadas.

Em seguida, selecione as configurações da tela de destino na guia de processamento e selecione a opção mais próxima de RT na janela RT. Em seguida, insira 0,2 minutos para a tolerância do tempo de retenção. Selecione as configurações de quantificação e, no menu de calibração, escolha linear para o tipo de ajuste da curva de calibração, um sobre x ao quadrado para o tipo de peso, concentração para o tipo de valor do componente, milimoles por litro para unidades de valor do componente e nenhum para calcular pontos de calibração por média.

No menu de quantificação, selecione área como o valor de resposta. Exemplos de cromatogramas HS-MRM gerados para os peptídeos falsos em todas as concentrações são apresentados aqui. As curvas de calibração obtidas para cada peptídeo após a integração dos picos de HS-MRM são exibidas aqui.

O desvio padrão relativo da área de pico calculado com base em quatro injeções repetidas é resumido aqui. Como o ensaio MRM de alta seletividade incorpora a separação do precursor da mobilidade iônica e a detecção por espectrometria de massa de alta resolução direcionada, ele tem grande potencial para se tornar um ensaio de monitoramento rápido e de alto rendimento para várias proteínas de células hospedeiras em lotes de produtos biofarmacêuticos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como configurar um ensaio MRM de alta seletividade em um instrumento Vion IMS QTof.