Uma câmara simples para a imagem confocal a longo prazo do desenvolvimento da raiz e do hipocótilo

O objetivo geral deste sistema de imagem é usar microscopia de fluorescência confocal para observar o desenvolvimento de órgãos de plantas ao longo de vários dias em uma resolução subcelular. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na morfogênese das plantas, como como as células de organismos multicelulares coordenam seus padrões de crescimento e proliferação durante a organogênese? A principal vantagem dessa técnica é que ela é simples de configurar e não depende do equipamento especializado frequentemente usado em imagens de lapso de tempo, como sistemas de profusão.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando lemos a publicação de Littlejohn e Love, na New Phytologist, que descreve as vantagens da perfluorodecalina para imagens em tecidos foliares. Para começar, use um cortador de vidro para fazer tiras de vidro de três milímetros de largura a partir de uma lâmina de um milímetro de espessura. Em seguida, com cola de cianoacrilato ou fita dupla face, prenda as tiras a aproximadamente 45 milímetros de distância na largura de uma nova lâmina.

Faça uma lâmina extra com as mesmas dimensões para servir de molde. Agora, faça uma junta da mesma altura com goma PDMS permeável a gás. Molhe uma segunda lâmina com um pouco de etanol absoluto e alise o PDMS na lâmina até a altura das tiras de vidro.

Em seguida, molhe uma lâmina com etanol absoluto e corte qualquer excesso de PDMS. Isso é crítico, pois as ferramentas molhadas com etanol não aderem ao PDMS. Em seguida, alise novamente o PDMS até a altura da tira.

Em seguida, corte uma cavidade no PDMS que conterá a muda e a laje de ágar. Para produzir um tamanho de cavidade consistente, usamos um cortador caseiro sob medida, construído a partir de especificações, mas uma lâmina de barbear pode ser usada. Em seguida, apare ao redor da borda externa para fazer a junta com cerca de dois milímetros de espessura.

Agora, em uma lâmina sem a junta PDMS, coloque uma lamínula em ambas as tiras de vidro. Em seguida, no espaço abaixo da lamínula, pipete cerca de um mililitro de meio de ágar liquefeito quente o suficiente para preencher o espaço. O ágar pode conter compostos experimentais de interesse.

Em seguida, o ar equilibra um pouco de PFD agitando um pequeno volume de PFD em um tubo. Assim que o ágar endurecer, carregue aproximadamente 200 microlitros do PFD na junta do PDMS, mas não a encha completamente. Remova a lamínula da placa de ágar e corte-a em uma forma que se encaixe no poço da junta de gel PDMS.

Deixe um espaço de dois a quatro milímetros entre o ágar e a parede da gaxeta. Em seguida, encha completamente a câmara com PFD equilibrado ao ar. Para obter imagens de raízes primárias gravitrópicas, uma membrana celulósica é usada como barreira física na superfície da placa de ágar.

A placa de ágar também deve ser mais macia com 0,8% de ágar em vez de 1,5% de ágar. Corte um pedaço da membrana que tenha aproximadamente as mesmas dimensões do bloco de ágar. Em seguida, esterilize-o com 80% de etanol e deixe secar ao ar.

Depois de seca, mergulhe a membrana em meio de crescimento líquido e transfira-a para a superfície do ágar. Para começar, coloque cuidadosamente até três mudas no ágar. Seu posicionamento é crítico.

Os cotilédones e o hipocótilo devem pairar sobre a borda do ágar, flutuando em PFD. Deve haver espaço entre as mudas para permitir o crescimento. As mudas podem ser enroladas se forem muito grandes para caber na câmara.

Em seguida, feche a câmara usando uma lamínula com uma espessura que corresponda ao objetivo escolhido. Pressione suavemente ao longo da borda para que o contato seja feito com as tiras de vidro. Use outra lâmina de vidro para pressionar suavemente a lamínula para que ela fique uniformemente apoiada nas duas tiras de vidro.

Em seguida, prenda a lamínula usando fita cirúrgica micropore cortada ao meio no sentido do comprimento. Agora, deixe a amostra repousar por cerca de meia hora antes de fazer a imagem. Para preparar as mudas de arabidopsis thaliana para as câmaras, primeiro esterilize as sementes com etanol 70%.

E então plante-os em meio suplementado. Estratificar as sementes plantadas por dois ou quatro dias a quatro graus Celsius. Em seguida, transfira as sementes plantadas a 22 graus Celsius e cultive-as verticalmente orientadas sob um ciclo de luz diário de 16 horas.

Para obter imagens das raízes laterais, cultive as plantas por sete a 10 dias e depois transfira-as para câmaras de imagem. Raízes laterais crescendo a taxas fisiológicas em câmaras de imagem foram documentadas a cada meia hora. As raízes laterais também foram cultivadas em placas de Petri padrão no mesmo meio para comparação.

A taxa de crescimento das raízes individuais variou muito em ambas as configurações, mas a amplitude foi semelhante em ambas as condições. No geral, a taxa de crescimento aumentou com o comprimento. A taxa de crescimento das plantas em câmaras de imagem ou em placas foi indistinguível nas primeiras 27 horas de crescimento.

Ambos os grupos começaram com o mesmo comprimento médio da raiz lateral. As raízes laterais co-expressando um marcador de membrana plasmática e um marcador de microtúbulos foram visualizadas em intervalos de uma hora nas câmaras de imagem. As raízes eram altamente estáveis em suas posições, permitindo várias horas de imagens confocais.

Indicadores visuais de proliferação foram observados durante todo o experimento. Nas células meristemáticas, bandas pré-prófase, fusos mitóticos e fragmoplastos puderam ser identificados. Ao longo de três dias, o crescimento da raiz lateral não foi significativamente diferente nas câmaras de imagem em comparação com as placas de Petri durante as primeiras 48 horas, mas em 72 horas a taxa média de crescimento caiu.

No entanto, uma proporção significativa de raízes nas câmaras ainda cresceu a taxas comparáveis às raízes nas placas por mais de 72 horas. Uma vez dominado, dois slides podem ser feitos em 15 minutos se tudo correr bem. É possível usar este sistema de imagem para estudar o efeito de tratamentos farmacológicos, embora outros métodos mais complexos, como sistemas de perfusão, sejam necessários para experimentos de washout.

Após seu desenvolvimento, essa técnica forneceu um meio barato e simples de acompanhar os eventos celulares que sustentam a morfogênese das plantas, em particular para explorar o papel das bordas celulares, das demandas espaciais que compartilham organogênese nas raízes laterais de Arabidopsis thaliana.