Name: Uma câmara simples para a imagem confocal a longo prazo do desenvolvimento da raiz e do hipocótilo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprenda a usar microscopia confocal para imagem de lapso temporal do desenvolvimento de raízes e hipocótilos em Arabidopsis thaliana. Este método simples permite observar eventos celulares em morfogênese vegetal por vários dias.

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Agradecemos ao Prof. Geoffrey Wasteneys, da Universidade da Colúmbia Britânica, pela RFP-TUB6 que expressa sementes e um revisor anônimo por correções úteis. Agradecemos ao Prof. Hugh Dickinson por nos alertar para o uso de filme de celulose como suporte mecânico e para John Baker para fotografia. Este trabalho foi apoiado por BBSRC bolsas de pesquisa BB / G013993 / 1 e BB / D004055 / 1 para IM, e um BBSRC Prêmio de Treinamento de Doutorado e Clarendon Scholarship para CK

1. Criação da Câmara <ol><li> Usando um cortador de vidro, corte tiras de 3 mm de largura da extremidade de um slide de microscópio de 1 mm de espessura. Usando um cianoacrilato super-cola ou fita dupla face, cola essas tiras de vidro aproximadamente 45 mm de distância entre a largura de um segundo slide de microscópio ( Figura 1A ). Um slide por câmara é necessário, além de slides adicionais para derramar placas de agar (um slide produzirá 2-3 placas de agar). Os slides podem ser reutilizados. </li><li> Entre as tiras de vidro, forma uma gaxeta de idêntica altura fora da goma permeável ao gás (dimetilsiloxano). Colocar uma bola de goma de poli (dimetilsiloxano) sobre a lâmina ( Figura 1B ), molhar uma segunda lâmina com uma pequena quantidade de etanol absoluto a 100% e aplainar a bola de goma de poli (dimetilsiloxano) com a segunda lâmina até atingir a altura Das tiras de vidro ( Figura 1C ). <ol><li> Se necessário, corte excesso de poli (dimeTilsiloxano) com uma lâmina de barbear e repita o achatamento. </li></ol></li><li> Utilizando um cortador adequado ou uma lâmina de barbear molhada em etanol absoluto, remova a parte interior da goma de poli (dimetilsiloxano) para criar a cavidade que mais tarde irá reter as plântulas e a placa de agar ( Figura 1D ). </li><li> Cuidadosamente aparar o gel com uma lâmina de barbear para criar uma junta com uma espessura de parede final de aproximadamente 2 mm ( Figura 1E ). A permeabilidade dos gases através de uma barreira de poli (dimetilsilaxano) é independente de espessuras acima de 50 μm 11 . </li></ol> 2. Criação da laje solidificada com agar de meio de crescimento <ol><li> Em uma lâmina de microscopia com duas tiras de vidro, coloque uma lamela (22 mm x 50 mm) de modo que ela se apoie em ambas as tiras de vidro. </li><li> Pipetar o meio de cultura Murashige e Skoog de meia-força fundido contendo 1% p / v sacarose e agar a 1,5% p / v (½ MS) no espaço resultanteAbaixo do lamínula até que este último esteja completamente cheio (aproximadamente 1 mL de volume total) e deixe-se até que o ágar seja ajustado (aproximadamente 5 min). Nota: Os compostos farmacológicos podem ser administrados através da placa de agar adicionando concentrações apropriadas ao meio líquido antes da laje ser vertida. Este foi testado com sucesso para dexametasona 12 , isoxabeno, 2,6-diclorobenzonitrilo (DCB), orizalina e latrunculina B. </li></ol> 3 . Terminando a instalação da câmara <ol><li> Ar equilibram PFD agitando um pequeno volume de PFD em um tubo 7 . Adicionar uma pequena quantidade (aproximadamente 200 μL) de PFD com equilíbrio de ar ao poço da junta de gel, mas não encha a câmara completamente. Este PFD irá ajudar a evitar o aprisionamento de bolhas de ar sob a placa de agar como ele é colocado na câmara. </li><li> Remova a lamela da placa de agar (no passo 2.2 acima) e use uma lâmina de barbear para cortar uma porção deTamanho e forma. Em seguida, coloque-o no poço da junta de gel ( Figura 1F ). Deve haver uma folga de 2-4 mm para a junta ao redor. </li><li> Encha completamente a câmara com PFD com equilíbrio de ar. </li><li> Coloque uma ou mais mudas de A. thaliana (até 3 mudas para imagens por 2-3 dias) na placa de agar com cotilédones e hipocótilo pendurados sobre a borda, flutuando em PFD ( Figura 1G ). </li><li> Para obter mudas, esterilizar sementes com etanol a 70%, plantar em meio ½ MS suplementado com 1% de sacarose e agar a 0,8%, estratificar durante 2-4 dias a 4 ° C e crescer em placas orientadas verticalmente a 22 ° C em 16 H luz / 8 h regime escuro. Para imaginar raízes laterais, cultivar plantas durante 7-10 dias antes de transferir para câmaras de imagem. </li><li> Para fechar a câmara, aplique uma lamela correspondente à óptica da objectiva, empurrando-a suavemente para baixo com a borda de um microscópio de vidro até que a lamelaRepousa em ambas as tiras de vidro ( Figura 1H ). </li><li> Fixe a lamela com tiras de fita cirúrgica micropore de 1,25 cm de largura, cortadas em metade do comprimento em cada extremidade, se desejado ( Figura 1I ). Permitir que a amostra para resolver cerca de 30 min antes da imagem. Isto minimiza o movimento do espécime durante a imagem. </li><li> Realizar a imagem com um microscópio ereto para manter um substrato controlado para o crescimento. Use objetivos 20X / 0.7NA ou 63X / 1.2NA CS2. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O método apresentado aqui é uma estratégia simples para a imagem confocal de alta resolução de desenvolvimento de raízes laterais para dois e até três dias. Durante períodos de até 48 h, não foram observados efeitos adversos do sistema de imagem no desenvolvimento da raiz lateral. Após 48 h, o crescimento médio das raízes laterais começou a diminuir, embora um subconjunto substancial das raízes (37%) continuasse a crescer a taxas comparáveis ​​ao crescimento médio das raízes em placas. Portanto, através da imagem um número suficientemente grande de raízes, raízes cujo crescimento retarda após 48 h pode ser excluído. Testes sistemáticos das câmaras de imagem não foram realizados por períodos superiores a 72 h, mas são recomendadas estratégias alternativas se forem desejados períodos alargados de imagem. As câmaras de imagem podem ser deixadas no estágio do microscópio continuamente, se forem proporcionadas condições ambientais adequadas, ou removidas para uma instalação de crescimento e periodicamente devolvidas ao microscópio. Isto permite que várias câmaras sejam fotografadas em paralelo. &lt;/ P&gt; Uma vantagem das câmaras aqui descritas é que as raízes laterais são fixas na sua posição e podem ser visualizadas utilizando lentes de imersão em água de alta resolução. A estabilidade espacial depende criticamente da concentração de ágar utilizada na placa de agar de suporte. Inicialmente, testou-se uma gama de diferentes concentrações de 0,8% de agar a 2% de ágar, revelando que concentrações elevadas neste intervalo fixavam fixamente as raízes no espaço, mas o crescimento das raízes abrandou mais rapidamente e algumas raízes apresentaram sinais de stress mecânico, incluindo o alongamento celular reduzido. Em contraste, baixas concentrações de ágar não forneceram o suporte necessário e as raízes derivaram em x, yez durante a imagem. A placa óptima de agar de 1,5% fixa a posição da amostra sem efeitos mecânicos adversos. Sob estas condições, após a sedimentação nos primeiros 30 min ou assim, as raízes são estáveis ​​ao longo de muitas horas, permitindo a aquisição de dados durante a noite. Durante a aquisição de dados 4D, os intervalos de pilha z foram tipicamente bEncadeado por um adicional de 5-10 μm, mas isso foi principalmente para acomodar o crescimento fora-de-plano de raízes laterais ao invés de z-drift ou oscilação. Embora a concentração padrão de ágar proporcione alguma resistência contra a penetração, as raízes gravitropicamente crescentes irão eventualmente penetrar no ágar. No entanto, através de uma pequena modificação da câmara de imagem, o crescimento das raízes poderia ser mantido paralelo ao lamínula, permitindo que as raízes laterais mais antigas e raízes primárias de ser fotografado. Além disso, a câmara de imagem básica poderia facilmente ser personalizada para hipocótilos. Os hipocótilos flutuam mais livremente neste sistema, pelo que o suporte do eixo z para a aquisição de imagem aumentou normalmente para cerca de 20 μm. Neste estudo, utilizou-se um microscópio ereto, que permitiu controlar as propriedades do substrato. A câmara de imagem pode ser adaptável a configurações de microscópio invertido, mas a influência dependente do tempo da lamela rígida nos órgãos interceptores terá de ser avaliada. </p&gt; Littlejohn e colegas têm apontado que PFD em si não prontamente dissolver moléculas biológicas, o que significa que ele não pode ser usado para o diretamente para a entrega de compostos farmacológicos 7 . Este problema foi superado através do fornecimento de tais compostos através da laje de meio de crescimento solidificado sobre a qual a placa de agar repousa. Embora os sistemas de perfusão continuem a ser o método de escolha para experiências de lavagem, a câmara de formação de imagens foi utilizada com êxito para a administração de dexametasona 12 e outros compostos. Uma nota, enquanto este artigo estava em preparação, von Wagenheim e colegas 18 descreveram uma câmara para a obtenção de imagens do desenvolvimento da raiz lateral usando microscopia de luz-folha.

Para estudar os processos celulares e subcelulares que sustentam o desenvolvimento das plantas, há uma demanda crescente por estratégias de imagem de longo prazo de alta resolução. Um desafio fundamental nessas experiências de imagiologia é a manutenção de condições fisiológicas, incluindo uma troca gasosa suficiente, mais um fornecimento de água e nutrientes 1 , 2 , 3 . Para utilizar objetivos com aberturas numéricas elevadas para uma óptima resolução óptica, os espécimes devem ser posicionados próximos e orientados paralelamente à lamela. O movimento nas direções x, y e z deve ser ideal durante a imagem. Enquanto as mudas são freqüentemente montadas em água ou solução aquosa para imagens de curto prazo, a água tem uma baixa capacidade para dissolver CO 2 e O 2 (1,54 mg / mL e 0,04 mg / mL, respectivamente a 20 ° C, 0,1 MPa) 4 , que fazÉ inadequado para experimentos prolongados de lapso de tempo. Sistemas de perfusão que mantêm níveis constantes de oxigênio e nutrientes são uma solução para este problema e foram desenvolvidos tanto para microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) 1 , 2 , 3 quanto para microscopia de luz (LSM) 5 . Sistemas como o RootChip 2 e o RootArray 3 foram projetados especificamente para imagens em lapso de tempo de desenvolver raízes e envolver a germinação de sementes em um dispositivo multi-espécimes personalizado. Estas disposições garantem uma perturbação mecânica mínima e são concebidas para a análise paralela de plântulas múltiplas, mas não são optimizadas para imagens de estruturas subcelulares. Calder e colegas projetaram uma câmara de imagem de perfusão mais complicada otimizada para imagens de estruturas subcelulares nas quais a amostra é mantida em posição por uma malhaPara permitir o uso de lentes de imersão de alta ampliação 1 . Apresentado aqui uma alternativa, solução simples para este problema que não é baseado em sistemas de perfusão, mas utiliza perfluorodecalin (PFD), um perfluorocarbon que recentemente ganhou popularidade como um meio de montagem para Arabidopsis imagiologia 6 , 7 , 8 . Em tais aplicações, a alta capacidade de PFD para dissolver CO 2 e O 2 (1,9 g / mL para O 2 em PFD em comparação com 0,04 mg / mL em água) 9 , permite a troca gasosa pelo tecido imerso. Além disso, o PFD não é fluorescente e seu índice de refração (1.313) é comparável ao da água (1.333) e está mais próximo do do citosol (~ 1.4) do que o do ar (1.000) 6 . Perfluorocarbonetos têm sido relatados para ter efeito fisiológico mínimo em uma variedade de plantas e plantasQuestões 6 , com sementes de rabanete germinando prontamente quando submerso em PFD e exibindo normal crescimento e desenvolvimento de pelo menos dois dias completos, quando abastecido com água 10 . Observações semelhantes foram feitas para a germinação de sementes de Arabidopsis 6 . Com base no espalhamento Raman estimulado para imagem diretamente a distribuição de PFD em tecidos de folha de Arabidopsis após a infiltração, Littlejohn e colegas concluem que PFD provavelmente não é tomado por células vivas 8 . O PFD foi previamente utilizado predominantemente para a imagem de tecidos aéreos, onde aumenta significativamente a profundidade de imagem, uma vez que se infiltra facilmente nos espaços de ar devido à sua baixa tensão superficial 6 . Aqui, o PFD é adotado para a imagem confocal de longo prazo de raízes laterais em desenvolvimento. Nesta configuração, são colocadas uma ou mais mudas numa placa de meio de crescimento solidificado com agar e imerso em PFD. O PFD permite gNa câmara de imagem, evitando a anoxia. O PFD é altamente volátil por isso é retido por uma junta de goma de poli (dimetilsiloxano) que também tem alta permeabilidade aos gases (1,5 x 10 -12 pmol m -1 s -1 Pa -1 para CO 2 ) 11 . Nutrientes e água são fornecidos pela laje de meio solidificado com ágar. Ao mesmo tempo, esta placa de agar pressiona suavemente a raiz contra a lamela, fixando assim a sua posição relativa na câmara de imagem e permitindo a utilização de lentes de imersão de água de alta resolução. Além disso, a placa de agar pode ser utilizada para administrar uma gama de tratamentos farmacológicos, incluindo dexametasona, orizalina e isoxabeno. As câmaras de imagem podem ser montadas em grande número a partir de lâminas de microscopia padrão usando equipamento mínimo. As câmaras de imagem foram desenvolvidas e caracterizadas para estudar o desenvolvimento de raízes laterais, mas são adaptáveis ​​à imagem de outros órgãos de plântulas, tais como pontas de raízes primárias eHipocï¿½ilos.

<table><tbody><tr><td>Perfluorodecalin</td><td>F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, Reino Unido</td><td>FLUTEC PP6</td><td></td></tr><tr><td>Poly(dimetilsiloxano) goma&nbsp;</td><td>Suprimento Biológico Carolina; Burlington, NC, EUA</td><td>Item # 132700</td> Lâminas de Microscópio de <td>Cavidade de Gel de Observação Carolina</td></tr><tr><td></td><td>VWR International Ltd, Lutterworth,&nbsp;UK</td><td>10118-600</td><td>A cavidade tem 13 mm de diâmetro e 0,2-0,4 mm de profundidade. Qualquer lâmina de cavidade provavelmente será suficiente</td></tr><tr><td>Cola de cianoacrilato</td><td>Loctite</td><td>604753</td><td>Qualquer 'supercola' adequada para vidro provavelmente será suficiente</td></tr><tr><td>Membrana de celofane celulósico</td><td>AA Packaging Limited, Preston, Reino Unido</td><td></td><td>Filme de celulose 325P; disco de 80 mm</td></tr></tbody></table>

uma câmara simples para a imagem confocal a longo prazo do desenvolvimento da raiz e do hipocótilo

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Vários aspectos do desenvolvimento da planta, como a morfogênese da raiz lateral, ocorrem em períodos de vários dias. Para estudar os processos celulares e subcelulares subjacentes, são necessárias estratégias de microscopia de lapso de tempo de alta resolução que preservem as condições fisiológicas. Os tecidos das plantas devem ter nutrientes adequados e abastecimento de água com troca gasosa sustentada, mas, quando submersos e imobilizados sob uma lamela, eles são particularmente suscetíveis à anoxia. Uma estratégia que tem sido empregada com sucesso é a utilização de um sistema de perfusão para manter um fornecimento constante de oxigénio e nutrientes. No entanto, tais arranjos podem ser complicados, complicados e requerem equipamento especializado. Apresentado aqui é uma estratégia alternativa para um sistema de imagem simples usando perfluorodecalina como um meio de imersão. Este sistema é fácil de configurar, requer equipamento mínimo e é facilmente montado em um estágio de microscópio, permitindo que várias câmaras de imagem sejam configuradas e visualizadas em parAlelo Neste sistema, as taxas de crescimento das raízes laterais são indistinguíveis das taxas de crescimento em condições padrão em placas de ágar durante os primeiros dois dias e o crescimento de raízes laterais continua a taxas reduzidas durante pelo menos outro dia. Os tecidos das plantas são fornecidos com nutrientes através de uma placa de agar que pode ser utilizada também para administrar uma gama de compostos farmacológicos. O sistema foi estabelecido para monitorar o desenvolvimento da raiz lateral, mas é prontamente adaptável à imagem de outros órgãos da planta, tais como hipocótilos e raízes primárias.

As raízes laterais crescem a taxas fisiológicas em câmaras de imagem. Os comprimentos de raízes laterais das plantas nas câmaras de imagem foram medidos a intervalos de uma hora ( Figura 2A , esquerda, Filme 1, n = 23) e as taxas de crescimento foram comparadas com as de raízes laterais cultivadas em placas de Petri padrão contendo o mesmo meio solidificado com agar . 2A , direita, Filme 2, n = 23). As taxas de crescimento podem variar consideravelmente entre as raízes laterais, sendo o comprimento da raiz um fator determinante devido às zonas cada vez mais longas de crescimento e proliferação 13 . Portanto, foram selecionados conjuntos de raízes laterais para representar raízes de diferentes comprimentos iniciais (variando de 50 μm a 1150 μm) tanto na câmara de imagem como na placa de ágar. Comprimento médio da raiz lateral no início da experiênciaFoi semelhante em cada conjunto (439 e 442 μm para câmaras de imagem e placas, respectivamente). No intervalo de tempo analisado de 27 h, o crescimento das raízes laterais foi aproximadamente linear tanto em câmaras de imagem como em placas, com uma taxa média de crescimento de 52 μm / h (R 2 = 0,997) em placas e 51 μm / h em câmaras de imagem R 2 = 0,993) ( Figura 2B ). As taxas de crescimento de raízes laterais individuais são altamente variáveis ​​tanto em placas quanto em câmaras de imagem ( Figura 2C ), variando de 17 μm / h a 82 μm / h em câmaras de imagem e de 13 μm / h a 87 μm / h em placas. Embora as taxas de crescimento geralmente aumentassem com o comprimento da raiz, as taxas de crescimento variaram ainda substancialmente entre raízes de comprimento semelhante, mas a variância foi semelhante em câmaras de imagem e em placas. Raízes laterais proliferam em câmaras de imagem e podem serGh objetivos de abertura numérica. As raízes laterais co-expressando o marcador de membrana plasmática NPSN12-YFP 14 e o marcador de microtúbulos UBQ1 :: mRFP-TUBULIN BETA6 (RFP-TUB6) 15 foram visualizadas por CLSM 10 a intervalos de 1 h para documentar o comportamento dos microtúbulos durante a proliferação celular em câmaras de imagem ( Figura 2D , Filme 3). Nestas câmaras, as raízes laterais eram altamente estáveis ​​na sua posição nos eixos x, y e z, permitindo a aquisição de pilhas confocal contínuas de lapso de tempo ao longo de várias horas. As células meristemáticas proliferaram continuamente, como é evidente a partir da formação de bandas pré-prófase ( Figura 2D , setas verdes), fuso mitótico ( Figura 2D , setas brancas) e fragmoplastos ( Figura 2D , setas azuis). Tal como acontece com mudas em placas de Petri,Células de raiz totalmente alongadas em câmaras de imagem iniciaram cabelos de raiz ( Figura 2A , Figura 2D , cabeças de seta), indicando ainda que o desenvolvimento prosseguiu conforme esperado nas câmaras de formação de imagens. Para proporcionar um campo de visão largo, as imagens na Figura 2D foram obtidas com um objectivo de 20x / 0,7 NA. Também foi possível obter imagens de alta resolução de raízes laterais utilizando um objetivo de imersão em água NA de alta abertura numérica 63x / 1,2 ( Figura 2E ). O crescimento das raízes laterais é sustentado em câmaras de imagem por até três dias. Para quantificar quanto tempo as câmaras de imagem poderiam suportar o crescimento das raízes laterais a taxas fisiológicas, o comprimento da raiz lateral nas câmaras de imagem (n = 27) e nas placas (n = 33) foi quantificado às 0 h, 24 h, 48 h e 72 h. As raízes do choSen eram menores do que 200 μm às 0 h, com um comprimento médio da raiz lateral de 117 μm nas câmaras de imagem e 121 μm nas placas. Uma vez que as raízes mais curtas crescem mais lentamente em média ( Figura 2C ), elas crescem com mais freqüência sobre a borda da placa de agar e são mais fáceis de representar. O crescimento médio de todas as raízes laterais não foi significativamente diferente nas câmaras de imagem em comparação com as placas de Petri nas primeiras 48 h ( Figura 3A ). No entanto, o crescimento médio foi significativamente reduzido entre 48 h e 72 h ( Figura 3A ). Embora as taxas de crescimento pareçam diminuir em geral nas câmaras de imagem após 48 h, as taxas de crescimento entre indivíduos continuam a ser altamente variáveis ​​( Figura 3B , 3C ), o que significa que existe um subconjunto substancial de raízes laterais que cresce a taxas comparáveis ​​em placas e câmaras Durante o período completo de 72 h de crescimento. 23 das 33 raízes laterais cultivadasEm placas (69,7%) atingem um comprimento dentro de um desvio padrão do comprimento médio a 72 h (entre 927 e 3 163 μm, Figura 3B , vermelho). 10 de 27 (37,0%) raízes laterais em câmaras de imagem atingem um comprimento dentro deste intervalo ( Figura 3B , vermelho). As câmaras de imagem podem ser facilmente adaptadas para raízes laterais mais antigas, raízes primárias e hipocótilos . Uma das limitações do projeto da câmara de imagem original foi que enquanto a placa de agar rígida forneceu alguma resistência mecânica, as raízes gravitropicamente crescentes penetraram na placa de agar, resultando em perda de qualidade de imagem ( Figura 4B ) e crescimento além da distância de trabalho de NA elevada Até mesmo o objectivo relativamente longo de 0,3 mm de distância de trabalho 63X / 1,3 NA CS2. As raízes laterais jovens não possuem asColumella necessárias para o gravitropismo 17, de modo que inicialmente cresceram paralelamente à lamela em câmaras de imagem ( Figura 2E ). À medida que crescem mais e columela e statoliths formam, raízes laterais exibem gravitropismo positivo crescente, enquanto raízes primárias exibem uma forte resposta gravitrópica de germinação em diante. Isto restringe a algumas horas o período sobre o qual as raízes primárias podem ser visualizadas e limita severamente o comprimento inicial das raízes laterais que podem ser visualizadas continuamente por 48 h ou mais. Para ultrapassar esta limitação, a câmara foi modificada de tal modo que o crescimento é mantido paralelo à lamela por uma membrana celulósica de celofane que actua como uma barreira de penetração na superfície da placa de agar ( Figura 4A ). As primeiras tentativas usando uma placa de agar a 1,5% causaram redução no crescimento da raiz dentro das primeiras 24 h, devido talvez ao estresse mecânico. As baixas concentrações de ágar na placa foram testadasD verificou-se que em câmaras com uma placa contendo 0,8% de agar e película de celulose, as taxas de crescimento das raízes laterais jovens não diferiram significativamente das taxas de crescimento em câmaras convencionais durante as primeiras 48 h. Durante 0-24 h, o crescimento médio das raízes nas câmaras de celulose e câmaras convencionais foi de 242 μm e 262 μm respectivamente (p = 0,78 Student t-Test) e para 24-48 h foi 330 μm e 355 μm 1 respectivamente (p = 0,67 Student&#39;s T-Test); N = 12 e n = 11, respectivamente. Este arranjo efetivamente impediu que as raízes laterais crescessem longe da lamela, para dentro do ágar, e também permitiu a imagem de raízes primárias por até 48 h ( Figura 4C ). Para testar se as câmaras de imagem poderiam ser adaptadas para órgãos diferentes das raízes, foram escolhidos os hipocótilos de Arabidopsis. Os hipocótilo são substancialmente mais espessos do que as raízes, pelo que na câmara de formação de imagens convencional,Ells foram espremidos contra a lamela, levando a deformação. Um desenho alternativo foi, portanto, desenvolvido usando cavidade slides que contêm uma depressão oval em seu centro ( Figura 4D ). Nesta configuração, colocou-se uma placa de agar de 1 mm de espessura (preparada como no ponto 2.2 acima) com uma extremidade que se projetava alguns mm para dentro da cavidade de deslizamento ( Figura 4D ). Os hipocï¿½ilos foram posicionados acima da cavidade na corrediï¿½ enquanto a raiz foi posicionada acima da parte horizontal. Isso garantiu que a plântula foi fixada no espaço pela raiz, mas o hipocótilo não foi esmagado. Embora as taxas de crescimento em câmaras comparadas com placas não fossem quantificadas sistematicamente, os hipocótilos em câmaras de imagem exibiram a bem descrita onda de crescimento longitudinal migrando para cima do hipocótilo ( Figura 4E , 4F ) 16 . <img alt="figura 1"Class = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ arquivos / ftp_upload / 55331 / 55331fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1 : Montagem de uma câmara de imagem. Todos os detalhes são descritos no texto. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig2.jpg" /> Figura 2 : As raízes laterais crescem sob condições fisiológicas em câmaras de imagem. ( A ) Desenvolvimento da raiz lateral de Arabidopsis em câmara de imagem (à esquerda) e em placa (direita) superior a 25 h (luz constante, incubação horizontal, imagem simultânea). Barras de escala = 200 μm. ( B ) Parcela com comprimento de raiz lateral superior a 27 h (medido em intervalos de 1 h), de raízes laterais, conforme mostrado em ( A ). Individual(N = 23 para placas e câmaras de imagem), comprimento médio como círculos vermelhos. Barras de erro = 1 SD. A linha vermelha é ajustada linearmente através de comprimentos médios. ( C ) Parcela mostrando a taxa média de crescimento para todas as raízes laterais mostradas em ( B ) em relação ao seu comprimento inicial. ( D ) Projeções de intensidade máxima de pilhas 3D confocal adquiridas a partir de raízes laterais que expressam NPSN12-YFP e RFP-TUB6 em pontos de tempo consecutivos. Inserção: Ampliação da região encaixotada. Setas verdes: bandas pré-pró-fase; Setas brancas: fusos mitóticos; Setas azuis: phragmoplastos; Pontas de flecha: pêlos radiculares. ( E ) Projeções de intensidade máxima de imagens de alta resolução adquiridas a partir de uma raiz lateral jovem da linha transgênica mostrada em ( D ) usando um objetivo 63X / 1.2 NA e amostragem de Nyquist (dimensões de pixel 77 nm x 77 nm) às 0 h e 16 H; Os asteriscos localizam células idênticas em cada ponto de tempo; Seta indica uma célula que se divide entre 0h e 16 h.Barras de escala = 50 μm (AC); 20 μm (E). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig3.jpg" /> Figura 3 : Desenvolvimento de raízes laterais a longo prazo em câmaras de imagem. ( A ) Parcela mostrando o crescimento médio absoluto da raiz em três intervalos consecutivos de 24 h em câmaras de imagem em comparação com placas. Ns indica p @ 0,05; *** indica p &lt;0,001 (teste t de Student). N = 33 (placas) e n = 27 (câmaras de imagem). ( B ) Plot mostrando comprimentos de raízes laterais em pontos de tempo consecutivos em todas as raízes usadas em (A). Vermelho: todas as raízes laterais com um comprimento final dentro de 1 DP da média de todas as raízes laterais cultivadas em placas (entre 927 e 3163 μm). ( C ) Máximo emProjeções de tensão de pilhas confocal 3D representativas do marcador de membrana de plasma NPSN12-YFP em raízes laterais, adquiridas em pontos de tempo consecutivos ao longo de 72 h. Barras de escala = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig4.jpg" /> Figura 4 : As câmaras de imagem podem ser adaptadas para outros órgãos de plantas. ( A - C ) Adaptação da câmara de imagem para raízes primárias. ( A ) Esquema do desenho da câmara de imagem. Isto é idêntico ao desenho padrão ( Figura 1 ) para além de duas modificações: a placa de meio MS contém 0,8% de ágar em vez de 1,5% de ágar e uma película de celulose (vermelha) é colocada entre agar e planta para impedir o crescimentoNo ágar. ( B ) projeções de intensidade máxima XY (superior) e XZ (inferior) de pilhas confocal 3D representativas do marcador de membrana de plasma NPSN12-YFP na raiz primária de uma plântula de 7 dias de idade fotografada às 0 h e 48 h em uma imagem convencional câmara. Note-se que a raiz cresce no agar devido à sua resposta gravitrópica. ( C ) projeções de intensidade máxima XY (superior) e XZ (inferior) de pilhas confocal 3D representativas do marcador de membrana de plasma NPSN12-YFP na raiz primária de uma plântula de sete dias de idade fotografada às 0 h e 48 h na imagem Com película de celulose. Antes da aplicação, a película de celulose foi esterilizada em etanol a 80% e embebida em meio líquido ½ MS. Note-se que o crescimento gravitrópico da raiz no ágar é impedido. ( D - F ) Adaptação de câmara de imagem para hipocótilos. ( D ) Esquema mostrando design de câmara de imagem de hipocótilo. Uma junta de goma de poli (dimetilsiloxano) (cinza) é manufactuVermelho sobre uma cavidade slide entre duas tiras de vidro (amarelo). Uma placa de 1,5% de ágar de espessura uniforme (bege) é colocada sobre a lâmina, atingindo parcialmente a cavidade. A câmara é preenchida com PFD (azul). As plântulas são colocadas sobre a placa de agar de modo que o hipocótilo ocupa a região inclinada para baixo da placa de agar na cavidade enquanto a raiz é posicionada na parte horizontal do ágar. A câmara é fechada com uma lamela. ( E ) Projeções de intensidade máxima de pilhas confocal 3D representativas do marcador de membrana plasmática NPSN12-YFP em um hipocótilo de uma plântula de dois dias de idade reproduzida durante 48 h em pontos de tempo consecutivos. ( F ) Crescimento longitudinal em dois intervalos de tempo consecutivos de células individuais ao longo do eixo basal ao eixo apical (posições relativas a 0 h ao longo do eixo mostrado em E) do hipocótilo mostrado em ( E ). Observe a onda de crescimento previamente descrita migrando para cima do hipocótilo 16 . Barras de escala = 100 μM. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Filme 1" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie1.jpg" /> Filme 1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_1.avi" target="_blank">Clique aqui para fazer o download deste filme.</a> <img alt="Filme 2" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie2.jpg" /> Filme 2: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_2.avi" target="_blank">Clique aqui para fazer o download deste filme.</a> <img alt="Filme 3" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie3.jpg" /> Filme 3: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_3.avi" target="_blank">Por favor c</a>Lamba aqui para baixar este filme.

Apresenta-se aqui uma técnica simples para imagens em tempo real confocal de alta resolução de desenvolvimento de raiz e hipocótilo por até 3 dias utilizando objectivos de elevada abertura numérica e perfluorodecalina como meio de imersão.

Uma câmara simples para a imagem confocal a longo prazo do desenvolvimento da raiz e do hipocótilo

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

O objetivo geral deste sistema de imagem é utilizar microscopia de fluorescência confocal para observar o desenvolvimento de órgãos vegetais ao longo de vários dias com resolução subcelular. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na morfogênese vegetal, como, por exemplo, como as células de organismos multicelulares coordenam seus padrões de crescimento e proliferação durante a organogênese? A principal vantagem desta técnica é que ela é simples de configurar e não depende de equipamentos especializados frequentemente usados em imagens de lapso de tempo, como sistemas de perfusão.Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao ler a publicação de Littlejohn e Love, na New Phytologist, que descreve as vantagens do perfluorodecalina para a obtenção de imagens em tecidos foliares. Para começar, utilize um cortador de vidro para produzir tiras de vidro com largura de três milímetros a partir de uma lâmina com espessura de um milímetro. Em seguida, com cola de cianoacrilato ou fita adesiva dupla face, fixe as tiras a aproximadamente 45 milímetros de distância uma da outra ao longo da largura de uma nova lâmina.Faça um lâmina extra com as mesmas dimensões para servir como molde. Agora, confeccione uma junta da mesma altura feita de borracha de PDMS permeável a gases. Umedeça uma segunda lâmina com um pouco de etanol absoluto e aplane o PDMS sobre a lâmina até a altura das tiras de vidro.Em seguida, umedeça uma lâmina com etanol absoluto e corte qualquer excesso de PDMS. Isso é crítico, pois ferramentas umedecidas com etanol não aderirão ao PDMS. Depois, readeque o PDMS até a altura da tira.Em seguida, corte uma cavidade no PDMS que acomodará a plântula e o bloco de ágar. Para obter um tamanho de cavidade consistente, utilizamos um cortador personalizado feito de perspex, mas uma lâmina de barbear pode ser usada como alternativa. Depois, aparar a borda externa para deixar a junta com cerca de dois milímetros de espessura.Agora, em uma lâmina sem a junta de PDMS, posicione uma lamínula sobre ambas as tiras de vidro. Em seguida, na região abaixo da lamínula, pipete cerca de um mililitro de meio de ágar liquefeito e aquecido, suficiente para preencher o espaço. O ágar pode conter compostos experimentais de interesse.Em seguida, equilibre com ar um pouco de DFP agitando um pequeno volume de DFP em um tubo. Assim que o ágar solidificar, adicione aproximadamente 200 microlitros do DFP na vedação de PDMS, mas não a preencha completamente. Remova a lamínula do bloco de ágar e corte-a em um formato que se encaixe no poço da vedação de gel de PDMS.Deixe uma lacuna de dois a quatro milímetros entre o ágar e a parede da junta. Em seguida, preencha completamente a câmara com PFD equilibrado com ar. Para imagens de raízes primárias gravitrópicas, uma membrana celulósica é usada como barreira física sobre a superfície do bloco de ágar.O bloco de ágar também deve ser mais macio, com 0,8% de ágar em vez de 1,5% de ágar. Corte um pedaço da membrana com dimensões aproximadamente iguais às do bloco de ágar. Em seguida, esterilize-o com etanol a 80% e deixe secar ao ar.Uma vez seca, mergulhe a membrana em meio de crescimento líquido e, em seguida, transfira-a para a superfície do ágar. Para começar, coloque cuidadosamente até três plântulas sobre o ágar. O posicionamento delas é crítico.Os cotilédones e o hipocótilo devem ficar pendurados sobre a borda do ágar, flutuando no PFD. Deve-se deixar espaço entre as plântulas para permitir o crescimento. As plântulas podem ficar encurvadas se forem muito grandes para caber na câmara.Em seguida, feche a câmara usando uma lamínula com espessura compatível com o objetivo escolhido. Pressione suavemente ao longo da borda para estabelecer contato com as tiras de vidro. Use outra lâmina de vidro para pressionar suavemente a lamínula, de modo que ela fique apoiada uniformemente sobre as duas tiras de vidro.Em seguida, fixe a lamínula utilizando fita cirúrgica microporo cortada ao meio no sentido do comprimento. Agora, deixe o espécime assentar por cerca de meia hora antes da obtenção de imagens. Para preparar as plântulas de Arabidopsis thaliana para as câmaras, primeiramente esterilize as sementes com etanol 70%.Em seguida, plante-as em meio suplementado. Estrate as sementes plantadas por dois ou quatro dias a quatro graus Celsius. Então, transfira as sementes plantadas para 22 graus Celsius e cultive-as com orientação vertical sob um ciclo diário de luz de 16 horas.Para obter imagens das raízes laterais, cultive as plantas por sete a dez dias e, em seguida, transfira-as para câmaras de imagem. Raízes laterais em crescimento com taxas fisiológicas nas câmaras de imagem foram documentadas a cada meia hora. Raízes laterais também foram cultivadas em placas de Petri padrão no mesmo meio, para comparação.A taxa de crescimento de raízes individuais variou bastante em ambos os arranjos, mas a amplitude foi semelhante sob qualquer condição. No geral, a taxa de crescimento aumentou com o comprimento. A taxa de crescimento de plantas em câmaras de imagem ou em placas foi indistinguível durante as primeiras 27 horas de crescimento.Os dois grupos começaram com o mesmo comprimento médio de raiz lateral. Raízes laterais que coexpressavam um marcador de membrana plasmática e um marcador de microtúbulos foram imagiadas em intervalos de uma hora nas câmaras de imagem. As raízes foram altamente estáveis em suas posições, permitindo várias horas de imagem confocal.Indicadores visuais de proliferação foram observados ao longo do experimento. Nas células meristemáticas, as faixas de pré-prófase, os fusos mitóticos e os fragmoplastos puderam ser identificados. Durante três dias, o crescimento da raiz lateral não foi significativamente diferente nas câmaras de imagem em comparação com as placas de Petri nas primeiras 48 horas, mas em 72 horas a taxa média de crescimento diminuiu.No entanto, uma proporção significativa das raízes nas câmaras ainda cresceu a taxas comparáveis às das raízes em placas durante 72 horas. Uma vez dominada a técnica, é possível preparar dois lâminas em 15 minutos, se tudo ocorrer sem problemas. É possível utilizar este sistema de imagem para estudar o efeito de tratamentos farmacológicos, embora outros métodos mais complexos, como sistemas de perfusão, sejam necessários para experimentos de lavagem.Após seu desenvolvimento, esta técnica forneceu um meio barato e simples para acompanhar eventos celulares que sustentam a morfogênese vegetal, em particular para explorar o papel das bordas celulares e das exigências espaciais no compartilhamento da organogênese nas raízes laterais de arabidopsis thaliana.

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Research

JoVE Journal

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