In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology em um Modelo de Malária Cerebral Experimental Usando Ressonância Magnética
8 de junho de 2017
Descrevemos um modelo de camundongo de malária cerebral experimental e mostramos como a patologia inflamatória e microvascular pode ser rastreada in vivo usando ressonância magnética.
O objetivo geral deste método é monitorar as alterações patológicas da malária cerebral experimental in vivo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na patogênese da malária cerebral experimental, pois nos permite visualizar in vivo como a patologia de todo o cérebro evolui no espaço e ao longo do tempo. A técnica, portanto, permite uma avaliação detalhada da patologia cerebral e pode ser usada para avaliar a eficácia de novas estratégias de tratamento na malária cerebral.
Realizando a configuração da ressonância magnética estará Manuel Fischer, nosso gerente de laboratório. Comece coletando mosquitos fêmeas de sua gaiola, 17 a 22 dias após a refeição de sangue. Use uma pinça para colocar de três a quatro mosquitos em uma lâmina de vidro, combinada com uma gota de meio RPMI frio.
Em seguida, coloque a lâmina sob um microscópio. Estique cuidadosamente o mosquito entre a cabeça e o corpo com uma pinça e use uma seringa e uma agulha para isolar a glândula salivar. Em seguida, colete as glândulas salivares da lâmina de vidro sugando-as com uma pipeta de vidro e transferindo-as para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.
Em seguida, use um pequeno bastão de plástico para esmagar as glândulas salivares isoladas dentro do tubo de centrífuga por três minutos, a fim de isolar os esporozoítos do tecido da glândula salivar. Centrifugue por três minutos a 1.000 vezes g e quatro graus Celsius para purificar os esporozoítos do tecido restante. Pipete o sobrenadante, que contém os esporozoítos, para um novo tubo de centrífuga e conte os esporozoítos purificados em um hemocitômetro Neubauer.
Os esporozoítos mostram um movimento típico no sentido anti-horário. Em seguida, ajuste a concentração dos esporozoítos purificados para 10.000 por mililitro, adicionando solução salina tamponada com fosfato. Por fim, coloque um camundongo C57BL/6 em um limitador e coloque sua cauda em água morna para visualizar melhor a veia da cauda.
Em seguida, injete um total de 1.000 esporozoítos, ou 0,1 mililitros, na veia da cauda para iniciar a infecção. Comece levando o mouse a uma ressonância magnética de pequenos animais 9.4T, ou scanner de ressonância magnética, que usa um ressonador de volume para transmissão de radiofrequência. Em seguida, aplique a pomada de dexpantenol em ambos os olhos.
Ligue o banho-maria com temperatura controlada a 42 graus Celsius para manter a temperatura corporal do mouse. Em seguida, coloque um cateter de veia da cauda na veia da cauda do camundongo. Em seguida, posicione o mouse para a ressonância magnética, colocando-o de bruços e com as costas esmagadas em uma cama de animal equipada com uma chave de cabeça e barra de dente para minimizar o movimento da cabeça.
Tome cuidado para não endireitar a coluna cervical do mouse. Conecte um sistema de injeção de agente de contraste preenchido com 0,3 milimol por quilograma de Gd-DTPA ao cateter da veia caudal. Em seguida, coloque a bobina da cabeça do receptor de superfície Phased Array de 4 canais na cabeça do mouse.
Por fim, coloque uma almofada de respiração na parte de trás do mouse e verifique a respiração no dispositivo de monitoramento. Ligue o laser posicional pressionando F2 no painel de controle e mova o mouse até que a luz posicional horizontal esteja no meio da parte menor da bobina, que cobre a cabeça do mouse. Desligue o laser posicional pressionando F2 novamente e, em seguida, mova o mouse para a posição final pressionando F3 no painel de controle.
Comece realizando uma varredura de localização para garantir que o cérebro do camundongo esteja no isocentro do ímã. Avalie qualitativamente o edema vasogênico usando imagens ponderadas em T2 3D. Selecione uma sequência RARA de várias fatias e ajuste a posição do corte, certificando-se de que todo o cérebro, do nariz ao cerebelo, esteja coberto.
Depois de ajustar as fatias de saturação, inicie a sequência e aguarde 10 minutos e 48 segundos para adquirir as imagens. Em seguida, realize a relaxometria T2 para avaliar quantitativamente o edema vasogênico, selecionando a sequência de eco de vários cortes e vários spins. Ajuste a posição do corte e inicie a aquisição da sequência, que leva oito minutos e 53 segundos.
Para avaliar quantitativamente o edema vasogênico e o edema citotóxico, realize imagens ponderadas em difusão selecionando uma sequência de difusão spin-eco EPI. Ajuste a posição da fatia e a fatia de saturação. Em seguida, inicie a sequência e aguarde sete minutos e 56 segundos até que as imagens brutas sejam adquiridas.
Em seguida, avalie as micro-hemorragias, usando imagens 3D ponderadas em estrelas T2. Selecione uma sequência FLASH com compensação de fluxo, ajuste a posição da fatia e inicie a sequência, que dura 15 minutos e 40 segundos. Em seguida, avalie a permeabilidade arterial usando a angiografia por tempo de voo, selecionando uma sequência 3D FLASH.
Ajuste a posição da fatia, inicie a sequência e aguarde sete minutos e 16 segundos até que as imagens sejam adquiridas. Finalmente, avalie a ruptura da barreira hematoencefálica. Selecione uma imagem 3D ponderada em T1 com uma sequência FLASH, ajuste a posição do corte e inicie a sequência.
Aguarde um minuto e 14 segundos até que as imagens sem contraste sejam adquiridas. Em seguida, injete contraste de 0,3 milimole por quilograma e repita a medição. Um aumento na ruptura da barreira hematoencefálica e um aumento de fluido indicam edema vasogênico precoce no bulbo olfatório que já está presente na doença leve e começa a se espalhar para o tronco cerebral à medida que a gravidade da doença aumenta.
Nos mapas T2, a gravidade do edema vasogênico pode ser quantificada desenhando-se regiões de interesse em regiões anatômicas específicas. Para cada região, pode-se obter um tempo de relaxamento T2 que aumenta com o aumento do edema. Além disso, o volume cerebral indicativo de edema começa a aumentar significativamente em camundongos moderadamente doentes em comparação com a linha de base, e aumenta ainda mais em camundongos gravemente doentes.
Por fim, a patologia microvascular, evidenciada por micro-hemorragias e aumento do contraste de suscetibilidade dos vasos, ocorre após os primeiros sinais de ruptura da barreira hematoencefálica no edema vasogênico. Essas microhemorragias ocorrem predominantemente no bulbo olfatório. Se todo o protocolo de ressonância magnética for obtido, todas as imagens, incluindo o posicionamento, podem ser obtidas dentro de uma hora, se for realizada corretamente.
O protocolo mínimo deve incluir uma sequência ponderada em T2 ou relaxometria T2 e uma sequência ponderada em estrela T2 para avaliar a presença de edema vasogênico, carga de micro-hemorragia e comprometimento microvascular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como a ressonância magnética de todo o cérebro visualiza alterações patológicas na malária cerebral experimental, incluindo alterações como inchaço cerebral, que é difícil de detectar ex vivo.
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Visão Geral
Este artigo descreve um modelo murino de malária cerebral experimental e demonstra como a patologia inflamatória e microvascular pode ser acompanhada in vivo por meio de imagem por ressonância magnética (MRI). O método permite a visualização da patologia cerebral ao longo do tempo, auxiliando na compreensão da progressão da doença e da eficácia do tratamento.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Doenças Infecciosas
- Técnicas de Imagem
Antecedentes
- A malária cerebral experimental é uma complicação grave da malária.
- Compreender sua patogênese é essencial para desenvolver tratamentos eficazes.
- Técnicas de imagem in vivo podem fornecer informações sobre a progressão da doença.
- A imagem por ressonância magnética (IRM) é um método não invasivo para avaliar a patologia cerebral.
Objetivo do Estudo
- Monitorar alterações patológicas na malária cerebral experimental.
- Visualizar a evolução da patologia cerebral no espaço e no tempo.
- Avaliar a eficácia de novas estratégias de tratamento.
Métodos Utilizados
- Modelo murino de malária cerebral experimental.
- Imagem por ressonância magnética (IRM) para rastreamento in vivo.
- Avaliação da patologia inflamatória e microvascular.
- Coleta de mosquitos fêmeas para a montagem experimental.
Resultados Principais
- Rastreamento bem-sucedido de patologia cerebral utilizando ressonância magnética.
- Visualização de respostas inflamatórias no cérebro.
- Informações sobre a evolução espacial e temporal da doença.
- Implicações potenciais para a avaliação da eficácia do tratamento.
Conclusões
- O estudo fornece uma ferramenta valiosa para compreender a malária cerebral.
- A imagem in vivo pode aprimorar a avaliação de estratégias terapêuticas.
- São necessárias pesquisas adicionais para explorar intervenções terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite o monitoramento não invasivo e longitudinal da ruptura da barreira hematoencefálica, edema e patologia microvascular em um modelo translacional de malária cerebral. Ao fornecer leituras quantitativas por ressonância magnética da progressão da doença, ele apoia a desmistificação mecanicista de vias neuroinflamatórias e a avaliação preditiva de terapêuticas direcionadas ao SNC. A abordagem aprimora a validação de alvos ao associar mecanismos vasculares e inflamatórios a biomarcadores de imagem mensuráveis in vivo.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas ao visualizar a evolução espacial e temporal da ruptura da barreira hematoencefálica e do edema in vivo.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos envolvidos na neuroinflamação e na patologia microvascular por meio de imagens longitudinais.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao quantificar o desenvolvimento de edema e a carga de micro-hemorragias como biomarcadores transponíveis da gravidade da doença.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas validados e relevantes para doenças para triagem subsequente, estabelecendo fenótipos de ressonância magnética de edema vasogênico e citotóxico como linha de base.
- Saídas Quantitativas: Fornece tempos de relaxação T2 e medidas de volume cerebral que permitem avaliação padronizada e reprodutível do edema entre grupos experimentais.
- Reutilização da Plataforma: Estabelece uma plataforma de imagem escalonável para avaliar os efeitos de compostos sobre a integridade da barreira hematoencefálica e a patologia microvascular em modelos de doenças do sistema nervoso central.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela características-chave da malária cerebral humana, incluindo edema, inchaço cerebral e patologia microvascular, apoiando o alinhamento translacional de biomarcadores.
- Continuidade Pré-clínica: Conecta a descoberta e a validação pré-clínica ao permitir o acompanhamento não invasivo da patologia desde os estágios iniciais até os avançados da doença.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Orienta decisões de avançar/não avançar ao correlacionar o grau de edema e de micro-hemorragias derivados por ressonância magnética com a deterioração neurológica e os desfechos de sobrevivência.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes e os testes de eficácia pré-clínica, fornecendo pontos finais baseados em imagem que refletem a função da barreira hematoencefálica e a saúde neurovascular.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre mecanismos vasculares e inflamatórios ao permitir a visualização de todo o cérebro da evolução da patologia ao longo do tempo e do espaço.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio de protocolos padronizados de RM que quantificam o edema e a carga de micro-hemorragias para triagem confiável de compostos.
- Análises: Gera saídas quantitativas de relaxometria T2, ponderadas por difusão e ponderadas por suscetibilidade, que facilitam a comparação entre grupos e a modelagem de resposta à dose.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à validação pré-clínica ao monitorar alterações patológicas relevantes para a doença que refletem as manifestações da malária cerebral humana.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma capacidade reutilizável em programas de doenças infecciosas do SNC, neuroinflamatórias e de penetração na barreira hematoencefálica.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista em relação às contribuições neurovasculares e inflamatórias para a patologia.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de aquisição e pós-processamento de RM para quantificação de edema e micro-hemorragias.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao fornecer biomarcadores de imagem transponíveis que reduzem o risco de falha em estágios avançados do desenvolvimento de fármacos para o SNC.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco ao vincular métricas de edema e micro-hemorragia derivadas de RM à gravidade da doença e à resposta ao tratamento.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em ressonância magnética de pequenos animais, manipulação de agentes de contraste e interpretação neuropatológica de edema e alterações microvasculares.
- Depende de instrumentação de ressonância magnética de alto campo (9,4 T), ressoadores volumétricos, bobinas de matriz em fase e sistemas de injeção de contraste para administração de Gd-DTPA.
- Necessita padronização entre equipes distintas de parasitologia, imagem e patologia para garantir modelos de infecção e análise de imagens consistentes.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o modelo a outras cepas, espécies ou patologias do SNC além da malária cerebral experimental.
- É limitado pela complexidade técnica dos protocolos de ressonância magnética com múltiplas sequências e pela necessidade de monitoramento fisiológico preciso durante a aquisição de imagens.
