Name: Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Aprenda a cultivar explantes de retina de zebrafish transgênicos adultos para imagem de células vivas por microscopia multiphotônica. Este método permite monitorar a migração nuclear intercinética em tempo real durante a regeneração retiniana.

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Agradecemos o apoio fornecido por William Archer e do Mecanismo de Notre Dame Integrado Imaging. Agradecimentos especiais são direcionados para os técnicos Freimann Ciências Biológicas por sua ajuda contínua e seus cuidados e criação de peixe-zebra. Este estudo foi apoiado por subsídios da National Eye Institute dos NIH para DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) eo Centro de Zebrafish Research, University of Notre Dame, Notre Dame, IN.

Nota: Os peixes-zebra foram criados e mantidos na instalação de Notre Dame Zebrafish na Freimann Life Sciences Center. Os métodos descritos neste manuscrito são aprovados pela Universidade de Notre Dame Animal Care e do Comitê Use e estão em conformidade com a instrução para o uso de animais em pesquisa visão pela Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia. 1. Soluções <ol><li> Preparar 70% de etanol para esterilizar o capuz de cultura de tecidos e qualquer equipamento / reagentes que são transferidos para o capuz de cultura de tecidos. </li><li> Adicionar 2 ml de 2-fenoxietanol para 1 L de água do sistema (1: 500 2-fenoxietanol). </li><li> Prepare 0,1 mM de NaHCO3, pH 8,0. Usar uma seringa de 10 ml e um filtro de tamanho de poro de seringa de 0,2 uM para esterilizar a solução em um capuz de cultura de tecidos esterilizadas. NOTA: NaHCO 3 é usado para espalhar o adesivo de forma eficiente as células e tecidos através da superfície da lamela de fluorodishes (verpasso 3.2). </li><li> Prepare a 1,0 M de CaCl2 e 1,0 M de MgCl2. Esterilizar com uma seringa de 10 mL e filtro de seringa de tamanho de poro de 0,2 um em um capuz de cultura de tecidos esterilizadas. </li><li> Para preparar Hank&#39;s-solução salina equilibrada (HBSS), adicionar estéril de CaCl2 estéril e MgCl2 a 1X HBSS sem Ca2 + / Mg2 +, sem vermelho de fenol a uma concentração final de 1 mM cada. Trabalhar em um ambiente estéril. </li><li> Para preparar o meio de cultura, misturar 50% 1x Meio Essencial Mínimo (MEM) sem vermelho de fenol, 25% HBSS contendo CaCl 2 e MgCl 2 (ver secção 1.4), 25% Soro de Cavalo (HS), 10 unidades / ml de penicilina e 10 ug / ml de estreptomicina. Trabalhar em um ambiente estéril. NOTA: Evite meio contendo vermelho de fenol como autofluoresces, afetando sinal para relações de ruído. 23 </li><li> Prepare 10 mL de 1% agarose de baixo ponto de fusão em 1x MEM sem vermelho de fenol. Derreter de agarose / 1x MEM usando um micav. Prepare pequenos volumes de agarose (por exemplo, 10 ml) como reaquecimento repetitivo irá alterar as concentrações de iões devido a evaporação de fluido. </li><li> Antes da cultura, esterilizar 1,5 mL tubos de microcentrífuga por autoclavagem. </li></ol> Paradigm 2. Light-danos <ol><li> Dark-adaptação <ol><li> Colocar 2-3 Tg [GFAP: nGFP] mi2004 peixe-zebra (ou outro peixe-zebra transgénico de interesse) em 6 - 14 meses de idade num ambiente isento de luz, durante 14 d. Para mais detalhes veja referência 2, 6, 24, 25. </li></ol></li><li> Posicione o tanque contendo 2-3 peixes-zebra transgénicos de adaptação ao escuro na água do sistema entre duas lâmpadas fluorescentes que emitem luz de 2.800 lux 2, 6, 24, 25. </li&gt; <li> Expor zebrafish à luz intensa constante por 35 h. Durante a exposição à luz, assegurar que a temperatura da água é mantida entre 31-33 ° C. </li></ol> 3. Preparação para a cultura (no dia do isolamento da retina) <ol><li> Utilizando 70% de etanol, esterilizar o capuz de cultura de tecidos e os componentes / ferramentas que são transferidos para o capuz de cultura de tecidos (por exemplo, frascos contendo MEM e HBSS, pipetas, pontas de pipeta estéreis, etc.). </li><li> Preparação de fluorodishes <ol><li> Brasão um fluorodish para cada retina com células e tecido adesivo (ver Tabela de Materiais). </li><li> Dilui-se o adesivo de células e tecidos em mM NaHCO3 0,1 a uma concentração final de 70 ug / ml, adicionar 50 ul de cada fluorodish e espalhar a solução através do centro do fluorodish com uma ponta de pipeta de 200 uL (cerca de 1 - diâmetro 1,2 centímetros ). </li><li> Incubar as fluorodishes revestidos por 1-3 h à TA; (Alternativamente, incubar O / N a 4 ° C). </li><li> Remover a solução e lavar 3x com 500 mL de 1x MEM para cada lavagem. Para evitar os fluorodishes revestidos de secar, mantê-los em MEM até explantes de retina são montados. </li></ol></li><li> Prepare meio de cultura tal como descrito no passo 1.6. O meio de cultura pode ser armazenado durante até 1 semana a 4 ° C. </li></ol> 4. O isolamento e cultura de explantes de retina NOTA: O protocolo delineado abaixo é para o isolamento da retina dorsal, que é a região da retina que é predominantemente lesionada pelo paradigma de luz danos descrito. Portanto, a proliferação induzida por danos e o evento associado de migração nuclear interkinetic ocorrer na retina dorsal. No entanto, o procedimento de isolamento pode ser ajustado para se obter regiões da retina de acordo com os requisitos específicos da questão investigador / pesquisa. <ol><li> Euthanize um light-danificado transgênicos zebrafish umtempo ta em 1: 500 2-fenoxietanol. </li><li> Remov de um fluorodish com uma pipeta de 1000 uL de modo a que apenas uma fina película de restos de fluidos. </li><li> Transfira o peixe-zebra em uma toalha de papel seco, remover o olho com um par de fórceps curvado Dumont (fórceps Nº 5, ângulo de 45 °) e transferi-lo para o fluorodish. </li><li> Usando um estereomicroscópio, orientar o olho com a pupila para o deslizamento da tampa do fluorodish de modo que a parte posterior do olho, com o nervo óptico é visível (Figura 1D). </li><li> Com um par de tesouras McPherson-Vannas remover o nervo óptico, de corte perto da parte posterior do olho. Em adição, remover o tecido conjuntivo que revestem o exterior do olho. </li><li> Mantenha o olho entre o seu lado nasal e temporal com um par de # 5 fórceps ao fazer uma incisão na haste óptica por perfuração com uma lâmina de tesoura através da lâmina cribrosa e corte ao longo tanto do lado nasal e temporal do olho (ver Figura 1E , Li segmentadane). </li><li> O uso de dois pares de pinças # 5, para a realização de um lado dorsal da retina e o outro par de separar o ventral a partir da retina dorsal, puxar o tecido. NOTA: É aconselhável para orientar a retina dorsal de modo que a lente e a camada de células ganglionares enfrentar a lamela enquanto a esclera está virada para cima. </li><li> Remover a esclerótica da retina dorsal com um par de fórceps # 5, enquanto mantém a lente que está ligado à retina com um segundo par de fórceps # 5 (Figura 1H, I). </li><li> Para remover a lente, utilizar tesouras McPherson-Vannas e cortar atrás da lente sem danificar a retina (Figura 1I, J). Por vezes, a lente separa no passo 4.7. Neste caso, remover a esclera cuidadosamente com uma pinça, mantendo a retina a uma orla de corte com um segundo par de fórceps # 5. </li><li> Remover o vítreo durante a remoção da lente sem danificar a retina. Achatar a retina com a camada de células ganglionares de frente para a lamelado fluorodish (Figura 1 L, M). </li><li> Cercam a retina com 10 mL de 1% agarose de baixo ponto de fusão e deixar a agarose solidificar. </li><li> Assista que a agarose líquido não levantar a retina como até mesmo uma ligeira elevação pode afetar a capacidade de se concentrar profundamente no tecido. Se elevação é observada, utilizar uma pipeta para remover agarose. Vamos conjunto de agarose residual antes de tentar adicionar mais. </li><li> Repita o passo 4,12 várias vezes antes de adicionar 1% agarose de baixo ponto de fusão para cobrir toda a fluorodish. Uma vez que a agarose solidificou, adicione 1,5 mL de meio de cultura. </li><li> Manter a cultura de explantes de retina num ambiente de ar / 5% de CO 2 fixada em 32 ° C durante aproximadamente 12 horas para permitir que a retina para recuperar do stress efectuadas pelo processo de isolamento. Ajustar a temperatura para 32 ° C para manter a retina à mesma temperatura como peixe-zebra luz-tratados (ver passo 2.3). </li></ol> 5. Multiphoton Microscopia Tabela de Materiais), uma longa distância objetiva de imersão em água 40X Apo (NA 1.15), um scanner galvanômetro e um câmara ambiental que contém uma inserção de quatro 35 milímetros placas de Petri. As imagens foram adquiridas com um detector não-descanned (R-NDD). <ol><li> Antes da imagiologia, equilibrar a câmara de condicionamento para atingir uma atmosfera de CO 2 / ar 5%. Certifique-se de que os pratos de Petri vazias são inseridos no suporte para evitar fugas de gás para dentro da sala. </li><li> Ligue o sistema de microscopia. </li><li> Uma vez que a câmara ambiental é equilibrado, adicione líquido de índice de refração para o 40X Apo longa distância objetiva de imersão em água (NA 1.15). NOTA: O índice de refracção de líquido com propriedades ópticas semelhantes a água é usada para evitar a evaporação de água durante o exame a longo prazo. </li><li> gripe lugarorodishes com explantes de retina para a câmara. Usando a luz brightfield, posicione a amostra para o caminho da luz e trazer a região intermediária da retina dorsal para o plano de foco. </li><li> Use luz epifluorescência GFP para se concentrar em GFAP: nGFP -positivo Müller núcleos da glia (Figura 2A, C). NOTA: Se explantes não são montados plana ou agarose acumulada sob o explante, será difícil para se concentrar na GFAP: nGFP núcleos -positivas ou eles vão fluorescência vagamente. <ol><li> Verifique se movendo para uma região diferente dentro do mesmo explante de retina irá superar o problema de foco. Caso contrário, passar para um explante de retina diferente. </li></ol></li><li> No software de aquisição de imagem, abra o &#39;A1 MP GUI &quot;, o&quot; TiPad&#39;, o &#39;A1 Compact GUI &quot;e as janelas&#39; nd de aquisição». Para geração de imagens multiphoton, verifique se a opção &#39;IR NDD&#39; é escolhido no &#39;A1 Compact GUI&#39;. </li><li> No &#39;Definiçõescampo de g &#39;, selecione IR-DM para o espelho dicróico 1º e escolher o filtro passa banda de 525/50 para adquirir GFP fluorescência. </li><li> Ligue o laser IR na janela chamada &#39;A1MP GUI&#39;. Vai demorar alguns minutos para que o laser estar pronto. Defina o comprimento de onda de 910 nm para excitar GFP fluorescência e alinhar o laser, clicando no botão &#39;alinhamento Auto&#39; na janela de &#39;A1 MP GUI&#39;. </li><li> Assegurar que a sala e equipamentos luzes são desligadas ou cobertas antes de abrir o obturador no &#39;A1 MP GUI &quot;, para evitar a exposição excessiva do tubo fotomultiplicador. Para reduzir os níveis de ruído, abrigar o microscópio em um ambiente escuro. </li><li> Adquirir imagens de um campo de visão de 300 x 300 pixels, com um zoom de dois, e um tempo de pixel habitação de 4,8 uS / pixel. Cerca de configurar a potência do laser, alterando a &#39;área de aquisição&#39; no &#39;A1MP GUI &quot;e o ganho na janela de&#39; A1 Compact GUI &#39;. </li><li> Configurando o z-stack <ol><li> Concentre-se na camada de células ganglionares para definir o plano focal topo do z-stack no &quot;-subwindow Z &#39;dentro da&quot; janela de aquisição ND&#39;. Alguns GFAP: células -positivas nGFP estão normalmente localizados na camada de células ganglionares, que ajuda a identificar o limite basal da retina (Figura 2A, D). </li><li> Mover o plano focal através do nível da ONL (Figura 2A, B), que é caracterizada pela presença de GFAP mal etiquetado: células -positivas nGFP que sejam redondos e alargada em relação às suas contrapartidas na INL (Figura 2A, C) . </li><li> Manter esta plano que a parte inferior da z-pilha. Assegure-se que toda a ONL vai ser trabalhada (Figura 2A, B). </li><li> Ao experimentar mudanças de plano focal que exigem re-ajustamento durante o período de imagem, clique duas vezes sobre a posição central na subwindow &#39;z&#39; para atribuí-lo como a posição de &#39;casa&#39;. Alterar para &#39;modo simétrico definida&#39;e clique &quot;relativa&quot;. </li><li> Defina o tamanho do z-passo entre 0,7-1 m. </li></ol></li><li> Z correcção de intensidade: <ol><li> Aplicar correções z intensidade para compensar a perda de intensidade de pixel, devido à dispersão da luz quando imagens em camadas profundas do tecido. </li><li> Para configurar a correção, abra a janela &quot;correção z-intensidade&quot;. Para definir o &#39;gama z-stack&#39;, escolha &#39;From ND&#39;. </li><li> Clique no plano focal inferior da janela &quot;Z-intensidade correcção &#39;(neste caso, corresponde à camada de células ganglionares) e definir a intensidade do laser (&quot; área de aquisição&#39; no &#39;A1MP GUI &quot;) e de ganho (GUI compacto A1 ). </li><li> Clique na seta ao lado do &#39;z-valores &quot;na janela&quot; correção z-intensidade &quot;para confirmar as configurações que são posteriormente mostrado em&#39; configurações do dispositivo&quot; na janela &quot;correção z-intensidade&quot; para o plano focal escolhido. </li><li> Repetir o processo para a um meioaviões top nd, aumentando a potência do laser e do ganho. planos focais adicionais podem ser adicionados se necessário. Ver Tabela 1 para configurações específicas de laser e de ganho para experimentos nas figuras 2 - 4. </li><li> Defina a &quot;área de aquisição &#39;na janela de&#39; A1 MP GUI &#39;. Evitar a selecção de uma zona de aquisição superior a 15 e um ganho superior a 126 no início de imagem para contornar a fotodegradação e o aumento dos níveis de ruído. NOTA: Como lasers e tubos fotomultiplicadores diferir entre sistemas de microscopia, do laser de teste e ajustes de ganho para obter condições de imagem óptimas para o microscópio configurar evitando fotodegradação. </li><li> Escolha &#39;correção intensidade relativa&#39; na janela &#39;correção z-intensidade &quot;. </li></ol></li><li> No subwindow &#39;timeseries&#39; na janela de &#39;ND aquisição&#39;, defina a duração de 8 horas e o intervalo para &#39;sem atraso&#39;. Então, certifique-se de clicar no botão &quot;Run z-correção &#39;em tele &#39;z-stack&#39; sub janela no botão da janela &#39;ND aquisição &quot;para adquirir os timeseries 3-D. </li><li> Manter explantes de retina, a uma temperatura de 27-29 ° C durante toda a duração de aquisição de imagem. </li><li> Durante todo o período de aquisição de imagem, se necessário, reajustar o nível de potência e de ganho, a fim de manter uma qualidade de imagem para análise pós-imagiologia. Para ajustes executar etapas 5.11.2 - 5.11.4. </li><li> Se as mudanças de plano focal, pausar ou parar a corrida e executar a etapa 5.11 novamente. NOTA: Se &#39;z-correção relativa &quot;foi escolhida na etapa 5.12.7 e 5.11.4 etapa foi realizada não deve ser necessário reajustar os níveis de poder e lucro, a menos extensa fotodegradação ocorreu. </li></ol> 6. Análise de Velocidade <ol><li> Extrai-se a tempo, definindo uma «região de interesse» na imagem. Use a &#39;medição do tempo&#39; ferramenta e exportar os valores de tempo para uma planilha. </li><li> Cortar uma região que contém uma diGFAP necer: nGFP núcleo -positivo. </li><li> Escolha da região recortada para que ele contenha pelo menos um núcleo que não sofram INM, a fim de definir um ponto de referência para medir, posteriormente, as distâncias que o núcleo divisória migraram em relação ao basal INL. NOTA: Para escolher um núcleo que permanece no INL basal, que ajuda a preparar uma reconstrução 3-D dos timeseries. </li><li> Em alternativa, se um GFAP: célula -positivo nGFP é observado na ONL durante todo o período de aquisição, utilizar uma linha vertical de comprimento fixo que mede a partir do núcleo para o ONL INL basal, a fim de identificar um ponto de referência. </li><li> Usando a função de &quot;mostrar fatias view &#39;, gerar projeções ortogonais. Posteriormente, alterar o modo de &#39;fatia&#39; para &#39;maximum intensity projection &quot;. </li><li> Desligue o ponto de vista &#39;xy&#39; da projeção máxima ortogonal. Dependendo da orientação em que o Migração / núcleo dividindo é melhor visível, umalso desligar tanto o &#39;xz&#39;- ou o &quot;-view yz&#39;. </li><li> Clique na imagem permanecendo com o botão direito do mouse e extrair o &#39;série yz&#39;-imagem com o&#39; &#39;xz&#39; ou função Criar novo documento a partir dessa visão &#39;. Se necessário, gire a imagem. </li><li> Usando a função &quot;Manual de Medição &#39;, desenhe uma linha horizontal através da imagem no nível inferior do núcleo que permanece no INL basal e não sofre INM (= ponto de referência; Figura 4A - E, linha horizontal vermelha). </li><li> Medir a distância entre a linha de referência e o ponto basal do núcleo migrando para os timeseries utilizando a ferramenta &#39;linha medida &quot;no software de análise (ver Figura 4A - E). </li><li> Uma vez que o envelope nuclear se rompe, medir a posição basal da soma se for identificável após a difusão da GFP em toda a célula. </li><li> Usando um software de planilha, traçar a distância de um nuCleus migraram contra o tempo passou (Figura 4F). <ol><li> Para determinar a velocidade apical de migração (v a), do gráfico as distâncias percorridas para o período antes desagregação envelope nuclear ocorre (Figura 4G). </li><li> Seleccione a série de dados no gráfico, clique com o botão direito do mouse e inserir uma curva de regressão linear incluindo a função correspondente &#39;y = mx + c&#39;. A inclinação &#39;m&#39; na função representa a velocidade, v a (Figura 4G). </li><li> Repita os passos 6.11.1 e 6.11.2 para a primeira fase da migração basal rápida para determinar a velocidade de migração basal, v b (Figura 4H). </li></ol></li></ol>

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<li>Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+adult+rat+retinal+explant+model+for+screening+of+potential+retinal+ganglion+cell+neuroprotective+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.Ophthalmol.Vis.Sci%22%5BJournal%5D)">Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).</li>
<li>Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+excitability%2C+and+transfection+of+retinal+neurons+in+an+organotypic+culture+of+mature+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina.</a> Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).</li>
<li>Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+imaging+of+retinal+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro imaging of retinal whole mounts.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li>
<li>Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Lapse+Retinal+Ganglion+Cell+Dendritic+Field+Degeneration+Imaged+in+Organotypic+Retinal+Explant+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.Ophthalmol.Vis.Sci%22%5BJournal%5D)">Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).</li>
<li>Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+blue+light+on+photoreceptors+in+a+live+retinal+explant+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Vis%22%5BJournal%5D)">Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system.</a> Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).</li>
<li>Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+processes+by+long-term+live+imaging--historic+problems+and+current+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell.Sci%22%5BJournal%5D)">Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions.</a> J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).</li>
<li>Thomas, J. L., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+light+damage+paradigm+for+use+in+retinal+regeneration+studies+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish.</a> J.Vis.Exp. 80, e51017(2013).</li>
<li>Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repressing+notch+signaling+and+expressing+TNFalpha+are+sufficient+to+mimic+retinal+regeneration+by+inducing+Muller+glial+proliferation+to+generate+committed+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.Neurosci%22%5BJournal%5D)">Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells.</a> J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).</li>
<li>Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+defines+three+populations+of+Muller+glia+and+is+required+for+initiating+maximal+muller+glia+proliferation+in+the+regenerating+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.Comp.Neurol%22%5BJournal%5D)">Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina.</a> J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).</li>
<li>Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Muller+glial+dependent+neuronal+regeneration+in+the+damaged+adult+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina.</a> Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).</li>
<li>Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+and+IL-6+family+cytokines+synergize+to+stimulate+Muller+glia+reprogramming+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.Rep%22%5BJournal%5D)">Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration.</a> Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).</li>
<li>Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HB-EGF+is+necessary+and+sufficient+for+Muller+glia+dedifferentiation+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.Cell%22%5BJournal%5D)">HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration.</a> Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).</li>
<li>Lenkowski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+regeneration+in+adult+zebrafish+requires+regulation+of+TGFbeta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling.</a> Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).</li>
<li>Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+position+and+morphology+of+committed+precursor+cells+in+the+zebrafish+retina+adapt+to+architectural+changes+upon+tissue+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.Rep%22%5BJournal%5D)">Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation.</a> Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).</li>
<li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).</li>
<li>Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitor+of+phagocytosis%2C+O-phospho-L-serine%2C+suppresses+Muller+glia+proliferation+and+cone+cell+regeneration+in+the+light-damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina.</a> Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).</li>
<li>Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+dynamic+imaging+of+retinal+microglia+using+time-lapse+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.Ophthalmol.Vis.Sci%22%5BJournal%5D)">Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy.</a> Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+of+living+photoreceptors+contributes+to+inherited+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol.Med%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration.</a> EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).</li>
<li>Peri, F., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuronal+degradation+by+microglia+reveals+a+role+for+v0-ATPase+a1+in+phagosomal+fusion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo.</a> Cell. 133 (5), 916-927 (2008).</li>
<li>Morsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+microglial+engulfment+of+dying+neurons+in+the+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Front.Cell.Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord.</a> Front.Cell.Neurosci. 9, 321(2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Estudos investigando os mecanismos que regem a regeneração do adulto danificado retina zebrafish métodos utilizados predominantemente imunocitoquímicos 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Estabelecer condições para a cultura de explantes de retina e para realizar processamento de imagem de células v...

Ao contrário dos humanos, peixe-zebra (Danio rerio) apresentam uma resposta regeneração robusta sobre a morte celular dos neurônios da retina 1, 2, 3, 4. Factor de necrose tumoral α, uma molécula de sinalização que é libertado a partir de morrer neurónios retinais induz Müller glia residente no basal camada interna Nuclear (INL) da retina, a proliferar 5 e produzir células progenitoras neuronais que continuam a proliferar antes de se diferenciar em a célula neuronal tipos que morreram 2, 3, 4. Durante a fase proliferativa da resposta de regeneração, os núcleos de células da glia Müller e suas células progenitoras neuronais provenientes passam por um padrão repetitivo migratório em fase com o ciclo celular (migração nuclear Interkinetic, INM) 6 </sup<html> &gt;, 7. Núcleos posicionado no INL basal replicar o seu DNA antes de migrar para a camada exterior Nuclear (ONL), onde se dividem antes de retornar os núcleos resultantes basalmente para o INL. Este processo foi descrito pela primeira vez durante o desenvolvimento neuroepithelial usando métodos histológicos, enquanto abordagens de imagens ao vivo de células mais tarde confirmado a interpretação por Sauer 8, 9, 10, 11, 12. Ambas as abordagens de imagem histoquímicos e em células vivas, foram usadas para determinar os mecanismos subjacentes INM e a sua função no desenvolvimento neuroepithelia incluindo a retina 9, 11, 12, 13. No entanto, os mecanismos que regem INM no adulto regenerar retina não foram estudadas em grande detalhexref &quot;&gt; 6, 7. imagens ao vivo de células será uma abordagem de valor inestimável para avançar o nosso conhecimento sobre as vias de sinalização que controlam o INM na retina regenerar adulto. Até recentemente, a criação de imagens de células vivas de INM na retina foi limitada a qualquer embriões de peixe-zebra ao vivo ou para pinto embrionário ou o rato pós-natal explantes de retina 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. Enquanto explantes de retina de animais adultos de uma variedade de espécies, incluindo ratinhos, ratos e peixes-zebra foram utilizadas para diferentes células abordagens biológicas 17, 18, 19, 20, experimentos com imagens em células vivas a partir de explantes de retina have sido restrita a breves períodos de tempo e não foram executadas de forma contínua ao longo de várias horas 21, 22. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a cultura adultos retinas de peixe-zebra danificado de luz para realizar experimentos com imagens em células vivas, monitoramento INM usando microscopia multi-fotão 6. Abordagens de imagem de células vivas são vantajosos em relação aos métodos de imuno-histoquímica ao investigar os mecanismos que controlam INM, como a dinâmica do INM, por exemplo, as velocidades podem ser afetadas em vez de a localização da mitose, o que não seria potencialmente ser detectada usando imunocitoquímica. No futuro, este método tem também o potencial de ser modificado para estudar outros processos dinâmicos durante a regeneração da retina, tais como fagocitose de morrer fotorreceptores por Muller glia ou o comportamento da microglia.

<table><tbody><tr><td>Pinça Dumont #5</td><td>Instrumentos de precisão mundiais</td><td>14098</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Dumont #5, ângulo de 45 graus</td><td>Instrumentos de precisão mundiais</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura McPherson-Vannas</td><td>Instrumentos de precisão mundiais</td><td>501233</td><td></td></tr><tr><td>Fluorpratos Instrumentos</td><td>de precisão mundiais</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscópio</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>SMZ-1B</td><td>tipo semelhante de estereomicroscópio de dissecção funcionará</td></tr><tr><td>Gabinete de Segurança Biológica classe tipo A2</td><td>Tipo equivalente Labconco</td><td></td><td>funcionará</td></tr><tr><td>incubadora de cultura de tecidos</td><td>Termocientífico</td><td>HEPA-classe 100</td><td>tipo equivalente funcionará</td></tr><tr><td>Lâmpadas fluorescentes Sylvania OSFP5835HOECO</td><td>Bulbtronics</td><td>31850</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &micro; Filtro de seringa Acrodisc de tamanho de poros m</td><td>VWR</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Luer-lok de 10 mL</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Luer-lok de 60 mL</td><td>VWR</td><td>BD309653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>FischerScientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>ThermoScientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>EMD Millipore</td><td>5980</td><td></td></tr><tr><td>HBSS sem Ca2+/Mg2+, sem vermelho de fenol, Gibco</td><td>ThermoScientific</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>MEM sem vermelho de fenol, Gibco</td><td>ThermoScientific</td><td>5100-038</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cavalo, inativado por calor</td><td>ThermoScientific</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>VWR</td><td>16777-164</td><td></td></tr><tr><td>Ácido de agasse ultrapuro de baixo ponto de fusão</td><td>ThermoScientific</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>etanol, absoluto</td><td>ThermoScientific</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>2-fenoxietanol</td><td>Sigma</td><td>77699</td><td></td></tr><tr><td>Corning Cell-Tak adesivo para células e tecidos&nbsp;</td><td>VWR</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>índice de refração líquido&nbsp;</td>O microscópio multifotônico <td>Cargille Lab</td><td>1803Y</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 equipado com um laser infravermelho MaiTai</td> O <td>sistema equivalente</td><td>da Nikon</td><td></td> funcionará</tr><tr><td>40X Apo objetiva de imersão em água de longa distância (NA 1.15)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>câmara ambiental equipada com inserto para placas de 35 mm</td> O <td>sistema equivalente</td><td>Okolab</td><td></td> funcionará</tr><tr><td>Software</td> <td>de análise NISNikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cultura do adulto transgênicos zebrafish retinal explantes for imaging em células vivas, por multiphoton microscopia

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Um programa de regeneração endógena é iniciada por Müller glia no peixe-zebra adulto (Danio rerio) retina seguintes danos e morte neuronal. As Müller glia re-entrar no ciclo celular e produzir células progenitoras neuronais que são submetidos a ciclos subsequentes de divisões celulares e diferenciar em tipos de células neuronais perdidas. Ambos Müller glia e células progenitoras neuronais núcleos replicar o seu ADN e sofrem mitose em locais distintos da retina, ou seja, elas migram entre o basal camada interna Nuclear (INL) e a camada exterior Nuclear (ONL), respectivamente, em um processo descrito como Interkinetic Migração nuclear (INM). INM foi predominantemente estudados na retina em desenvolvimento. Para examinar a dinâmica do INM no adulto regenerar retina zebrafish em detalhe, processamento de imagem de células vivas de células fluorescentes marcado Müller glia / neuronais progenitoras é necessária. Aqui, nós fornecemos as condições para isolar e retinas cultura dorsaisde Tg [GFAP: nGFP] mi2004 peixe-zebra que foram expostos à luz intensa constante por 35 h. Também mostram que estas culturas de retina são viáveis para efectuar experiências de imagiologia ao vivo de células, a aquisição de imagens continuamente Z-pilha, através da espessura do explante da retina por até 8 h, usando microscopia multifotônica para monitorar o comportamento migratório das GFAP: células -positivas nGFP . Além disso, descrevemos os detalhes para realizar a análise pós-imagem para determinar a velocidade do INM apical e basal. Para resumir, nós estabelecemos condições para o estudo da dinâmica do INM em um modelo adulto da regeneração neuronal. Isto irá avançar nossa compreensão deste processo celular crucial e nos permitem determinar os mecanismos que controlam INM.

O isolamento da retina de acordo com o procedimento delineado no esquema na Figura 1 permite a cultura de uma retina dorsal achatada de luz-danificado adulto Tg [GFAP: nGFP] mi2004 peixe-zebra ao longo de um período de pelo menos 24 horas numa atmosfera de 5% de CO 2 ambiente / ar. Estes explantes de retina montados plana pode ser usado para planos focais imagem em níveis tecidos profundos. Um exemplo é Müller glia / núcleos neuronais de cé...

regeneração de retina de peixe-zebra foi principalmente estudada usando retinas fixos. No entanto, os processos dinâmicos, como a migração nuclear interkinetic ocorrer durante a resposta regenerativa e exigem processamento de imagem de células vivas para investigar os mecanismos subjacentes. Aqui, descrevemos as condições de cultura e de imagem para monitorar Migração Nuclear Interkinetic (INM) em tempo real através de microscopia multiphoton.

Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

O objetivo geral deste procedimento de isolamento é permitir a microscopia de células vivas das células em proliferação que estão realizando migração nuclear intercinética em culturas de explantes retinianos de peixe-zebra lesionado. Este método pode responder perguntas fundamentais na regeneração retiniana, como quais mecanismos impulsionam a migração nuclear intercinética ou se as células gliais de Müller em um estado de progenitor renal apresentam regulação semelhante durante a migração nuclear intercinética. A principal vantagem desta técnica é que o comportamento dinâmico das células em proliferação que realizam migração nuclear intercinética durante a regeneração pode ser monitorado, o que permite a investigação de mecanismos específicos a cada fase do ciclo celular.Embora este método possa fornecer informações sobre a migração nuclear intercinética, ele também pode ser aplicado a outras áreas de pesquisa retiniana, como investigar o comportamento das micróglias ou a fagocitose de neurônios em degeneração pelas células gliais de Müller. Inicie este procedimento transferindo o peixe-zebra para uma toalha de papel seca. Em seguida, remova um dos olhos com uma pinça curva e tran

culture-adult-transgenic-zebrafish-retinal-explants-for-live-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Demonstramos um protocolo para gerar embriões quiméricos zebrafish para o comportamento imagens ao vivo do celular durante a embriogênese.

Transplante de GFP-expressando Blastômeros for Imaging ao vivo de Desenvolvimento da retina e do cérebro em embriões Zebrafish Quimérico

Neste vídeo, técnicas de imagem multicolor de lapso de tempo confocal e ablação de células alvo são fornecidos. Lapso de tempo de imagem é usado para monitorar o comportamento de vários tipos de células de...

Multicolor imagem em tempo-lapso de Transgênicos Zebrafish: Visualizando Células-Tronco da retina Ativado por Ablação célula-alvo Neuronal

Células que morrem são extrudados a partir de tecidos epiteliais pela contração concertada de células vizinhas, sem interromper a função de barreira. A clareza óptica de zebrafish desenvolvimento fornece um excelente sistema de visualização de extrusão na vida epitélios. Aqui nós descrevemos métodos para induzir e extrusão imagem na epiderme zebrafish larval em resolução celular.

Imagens ao vivo de extrusão celular da epiderme de Zebrafish desenvolvimento

O vídeo demonstra um método para cultivar células ganglionares primárias da retina a partir de embriões de peixe-zebra. Os embriões em estágio inicial são submetidos à dissecção para isolar os olhos, que são posteriormente dissociados mecanicamente em uma suspensão de células ganglionares da retina. Esta suspensão celular é cultivada em lamínulas revestidas com proteínas adesivas para facilitar o desenvolvimento do axônio.

Geração de culturas primárias de células ganglionares da retina a partir de embriões de peixe-zebra

Fonte: Lahne, M., et.al. Cultura de explantes retinianos de peixe-zebra transgênicos adultos para imagens de células vivas por microscopia multifotônica. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra imagens de células vivas da migração nuclear glial de Muller em explantes retinianos de peixe-zebra embebidos em agarose após danos por fotorreceptores induzidos por luz. O fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) liberado por fotorreceptores danificados ativa as células gliais de Muller, desencadeando a...

Imagem de células vivas da migração nuclear glial de Muller durante a regeneração da retina do peixe-zebra

acompanhamento ao vivo de células progenitoras da retina WT individuais em fundos genéticos distintos permite a avaliação da contribuição das células de sinalização não autónomo durante a neurogênese. Aqui, uma combinação de silenciamento de genes, através de transplante de geração quimera embrião e na imagiologia de lapso de tempo in vivo confocal foi utilizada para este propósito.

In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos

Imagem tecido retinal pode fornecer informações de célula única que não podem ser obtidas por métodos bioquímicos tradicionais. Este protocolo descreve a preparação de fatias da retina de zebrafish para a imagem latente confocal. Indicador de corantes permitem a visualização de numerosos processos biológicos em tipos distintos de células da retina ou fluorescente geneticamente codificado sensores.

Prepara frescas fatias da retina de adultos do Zebrafish para Ex Vivo experimentos de imagem

Aqui, apresentamos um protocolo para mostrar como célula photoconversion é conseguida através da exposição UV para áreas específicas, expressando a proteína fluorescente, Eos, em animais vivos.

Photoconversion de célula única no Zebrafish intacta vida

Apresentamos um protocolo eficiente e fácil de usar para a preparação de culturas de células primárias de zebrafish embriões para transfeccao e imagens de células vivas, bem como um protocolo para preparar as células primárias do cérebro adulto zebrafish.

Cultura e transfecção de células primárias de Zebrafish

Este protocolo descreve uma abordagem para rotulagem e imagem multidimensional de zebrafish desenvolvimento precoce dos olhos. Descrevemos rotulagem, incorporação e imagens quadridimensionais (4D) usando microscopia confocal de varredura a laser, e considerações para otimizar a aquisição de conjuntos de dados para dissecção de mecanismos de morfogênese de copo óptico.

Imagem 4-Dimensional da Morfogense da Copa Óptica de Zebrafish

Este protocolo descreve o uso de um peróxido de hidrogênio geneticamente codificado (H2O2)-biosensor em neurônios e larvas de zebrafish cultivados para avaliar os papéis de sinalização fisiológica de H2O2 durante o desenvolvimento do sistema nervoso. Pode ser aplicado a diferentes tipos de células e modificado com tratamentos experimentais para estudar espécies reativas de oxigênio (ROS) no desenvolvimento geral.

Imagem de células vivas ROS durante o desenvolvimento neuronal

Aprenda a cultivar explantes de retina de zebrafish transgênicos adultos para imagem de células vivas por microscopia multiphotônica. Este método permite monitorar a migração nuclear intercinética em tempo real durante a regeneração retiniana.

Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia

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